Uporaba celičnih tehnologij za izboljšanje videza brazgotin

Za sodobno znanost je značilen hiter razvoj številnih sorodnih disciplin, združenih pod splošnim imenom "biotehnologija". Ta del znanosti, ki temelji na najnovejših dosežkih na področju biologije, citologije, molekularne genetike, genskega inženiringa in transplantologije, si prizadeva izkoristiti ogromen potencial, ki je lasten rastlinskim in živalskim celicam - osnovnim strukturnim enotam vseh živih bitij. "Živa celica je že pripravljen biotehnološki reaktor, v katerem se ne izvajajo le procesi, ki vodijo do nastanka končnega produkta, temveč tudi številni drugi, ki pomagajo ohranjati katalitično aktivnost sistema na visoki ravni," - John Woodward, 1992. Začetek celične znanosti je bil postavljen leta 1665, ko je angleški fizik R. Hooke ustvaril prvi mikroskop in odkril celice - celule ("celice") v pluti. Leta 1829 sta M. Schleiden in T. Schwann utemeljila "celično teorijo", ki je dokazala, da so vsa živa bitja sestavljena iz celic. Leta 1858 je R. Virchow dokazal, da vse bolezni temeljijo na kršitvi strukturne organizacije in presnove celic. Postal je utemeljitelj "celične patologije". Temeljni prispevek k znanosti o celici sta v letih 1907–1911 prispevala R. Harrison in A. A. Maksimov, ki sta dokazala možnost gojenja celic zunaj telesa. Njuno delo je pokazalo, da je treba za gojenje celic živalska tkiva in dele rastlin mehansko ločiti na majhne koščke. Za izolacijo celic tkiva z ostrim nožem ali mikrotomom narežemo na tanke rezine, približno 0,5–1,0 mm. Fizična ločitev celic se imenuje imobilizacija. Izolirane celice dobimo z encimsko disperzijo koščkov rastlin ali tkiv. Po mletju z ostrimi škarjami koščke obdelamo s tripsinom ali kolagenazo, da dobimo suspenzijo – suspenzijo posameznih celic ali njihovih mikroagregatov v posebnem mediju. Za imobilizacijo rastlinskih celic se pogosto uporabljajo alginatni geli (kalcijev alginat). Dokazano je, da imobilizirane rastlinske in živalske celice ohranijo sposobnost biosinteze. Produkti celične biosinteze se kopičijo v celicah, njihova ekspresija pa poteka bodisi spontano bodisi s pomočjo posebnih snovi, ki spodbujajo povečano prepustnost celičnih membran.

Gojenje živalskih celic je veliko bolj zapleten postopek kot gojenje rastlinskih celic, ki zahteva posebno sodobno opremo, visoko tehnologijo, prisotnost različnih medijev, rastnih faktorjev, namenjenih ohranjanju sposobnosti preživetja celic in njihovemu vzdrževanju v stanju visoke funkcionalne aktivnosti. Ugotovljeno je bilo, da je večina celic trdnih tkiv, kot so tkiva ledvic, jeter in kože, odvisnih od površine, zato jih je mogoče gojiti in vitro le v obliki tankih listov ali monoslojev, ki so neposredno povezani s površino substrata. Življenjska doba, proliferacija in funkcionalna stabilnost celic, pridobljenih z encimsko disperzijo tkiv, so v veliki meri odvisne od substrata, na katerem gojijo. Znano je, da imajo vse celice, pridobljene iz tkiv vretenčarjev, negativni površinski naboj, zato so za njihovo imobilizacijo primerni pozitivno nabiti substrati. Izolirane celice, pridobljene neposredno iz celih tkiv, je mogoče vzdrževati v primarni kulturi v imobiliziranem stanju, pri čemer ohranjajo visoko specifičnost in občutljivost 10–14 dni. Imobilizirane, površinsko odvisne celice igrajo danes pomembno vlogo v biologiji, zlasti v kliničnih raziskavah. Uporabljajo se za preučevanje ciklov razvoja celic, regulacije njihove rasti in diferenciacije ter funkcionalnih in morfoloških razlik med normalnimi in tumorskimi celicami. Imobilizirane celične monosloje se uporabljajo v biotestih, za kvantitativno določanje biološko aktivnih snovi, pa tudi za preučevanje učinka različnih zdravil in toksinov nanje. Zdravniki vseh specialnosti že desetletja kažejo veliko zanimanje za celico kot terapevtsko sredstvo. Celične tehnologije se trenutno hitro razvijajo v tej smeri.

Začetek tkivne in celične terapije je povezan z imenom znanega ruskega znanstvenika V. P. Filatova, ki je leta 1913 postavil temelje doktrine tkivne terapije, preučeval rezultate presaditev roženice od zdravih darovalcev do bolnikov s katarakto. Med delom s presadki roženice je odkril, da se roženica, shranjena na mrazu 1-3 dni pri temperaturi -2-4 stopinje C, bolje ukorenini kot sveža. Tako je bila odkrita lastnost celic, da v neugodnih pogojih izločajo nekatere snovi, ki vzbujajo vitalne procese v presajenih tkivih in regenerativne v tkivih prejemnika. Tkivo in celice, ločene od telesa, so v stanju stresa, torej upočasnijo življenjsko aktivnost. Krvni obtok v njih se ustavi, s tem pa tudi prehrana. Dihanje tkiv je izjemno oteženo, inervacija in trofizem sta motena. Ko so v novem kakovostnem stanju in se prilagajajo novim pogojem obstoja, celice proizvajajo posebne snovi z zdravilnimi lastnostmi. Te snovi nebeljakovinske narave je V. P. Filatov imenoval biogeni stimulansi. Skupaj z V. V. Skorodinsko je ugotovil, da se lahko material iz živali in rastlin po shranjevanju v neugodnih pogojih eno uro prosto avtoklavira pri t 120 stopinj Celzija, pri čemer ne le da ni izgubil aktivnosti, temveč jo je ravno nasprotno povečal, kar je bilo pojasnjeno s sproščanjem bioloških stimulansov iz konzerviranih tkiv. Poleg tega so izgubili antigenske lastnosti, kar je znatno zmanjšalo možnost zavrnitve. Konzerviran sterilni material so v telo vnesli z implantacijo (plantacijo) pod kožo ali v obliki injekcij ekstraktov, kar je dalo ustrezne rezultate. Ugotovljeno je bilo tudi, da fetalna tkiva vsebujejo bistveno večje število biološko aktivnih snovi kot tkiva odraslih posameznikov, nekateri dejavniki pa so prisotni le v zarodkih. Inokuliranih fetalnih tkiv prejemnik ne zaznava kot tujke zaradi odsotnosti beljakovin, odgovornih za vrstno, tkivno in individualno specifičnost (beljakovine glavnega kompleksa histokompatibilnosti) v citoplazemskih membranah. Posledično inokulacija živalskih fetalnih tkiv v človeški organizem ne sproži mehanizmov imunske zaščite ter reakcij nezdružljivosti in zavrnitve. V. P. Filatov je v svoji medicinski praksi pogosto uporabljal človeško posteljico in kožo. Zdravljenje je obsegalo 30–45 injekcij tkivnih izvlečkov in 1–2 implantacij avtoklaviranih tkiv.

Potem ko je svoje raziskave začel s človeškimi in živalskimi tkivi in celicami, je svoje posplošitve prenesel v rastlinski svet. Z eksperimenti z živimi deli rastlin (aloe, trpotec, agava, vršički pese, šentjanževka itd.) je ustvaril neugodne pogoje zanje, tako da je odrezane liste postavil v temen prostor, saj rastlina za svoje vitalne funkcije potrebuje svetlobo. Iz estuarijskega blata in šote je izoliral tudi biogene stimulanse, saj blato in šota nastajata s sodelovanjem mikroflore in mikrofavne.

Tkivna terapija je dobila nov krog razvoja v poznih 70. letih, ko so znanje in izkušnje, nakopičene skozi desetletja, omogočile uporabo živalskih in rastlinskih tkiv in celic na kakovostno novi ravni za zdravljenje ljudi in podaljšanje njihove aktivne življenjske dobe. Tako so v nekaterih domačih in številnih tujih klinikah ženske v fiziološki menopavzi s klimakteričnim sindromom ali na ozadju ovariektomije začele prejemati tkivno terapijo s fetalnimi tkivi posteljice, hipotalamusa, jeter, jajčnikov, timusa in ščitnice, da bi upočasnili proces staranja, razvoj ateroskleroze, osteoporoze, disfunkcije imunskega, endokrinega in živčnega sistema. V eni najprestižnejših gerontokozmetoloških klinik v zahodni Evropi se že več desetletij za iste namene uporabljajo injekcije izvlečkov, pridobljenih iz fetalnih tkiv spolnih žlez ovnov.

Tudi v naši državi je biostimulacijsko zdravljenje našlo široko uporabo. Do nedavnega so bolnikom z različnimi boleznimi aktivno predpisovali injekcije izvlečkov placente, aloe vere, kalanhoje, seduma majorja (biosed), FiBS, peloidnega destilata, peloidina, šote, humisola, pripravljenega po metodi V. P. Filatova. Trenutno je te zelo učinkovite in poceni domače tkivne pripravke živalskega, rastlinskega in mineralnega izvora v lekarnah skoraj nemogoče kupiti.

Osnova za pridobivanje različnih biogenih pripravkov iz človeških tkiv in organov uvožene proizvodnje, kot so rumalon (iz hrustančnega tkiva in kostnega mozga), aktovegin (iz telečje krvi), solkoseril (izvleček goveje krvi), pa tudi domači pripravki - steklovino (iz steklastega telesa govejega očesa), kerakol (iz roženice govejega očesa), splenin (iz vranice govejega očesa), epitalamin (iz epitalamično-epifizne regije), so prav tako raziskave V. P. Filatova. Poenotena lastnost vseh tkivnih pripravkov je splošen učinek na celotno telo kot celoto. Tako je "Tkivna terapija" akademika V. P. Filatova postala osnova za večino sodobnih razvojnih smeri v kirurgiji, imunologiji, porodništvu in ginekologiji, gerontologiji, kombustiologiji, dermatologiji in kozmetologiji, povezanih s celico in produkti njene biosinteze.

Problem presaditve tkiva skrbi človeštvo že od antičnih časov. Tako je v Ebersovem papirusu, datiranem v leto 8000 pr. n. št., že omenjena uporaba presaditve tkiva za kompenzacijo napak na posameznih delih telesa. V "Knjigi življenja" indijskega znanstvenika Sushrute, ki je živel 1000 let pr. n. št., je podroben opis obnove nosu iz kože lic in čela.

Potreba po donorski koži je rasla sorazmerno s povečanjem števila plastičnih in rekonstruktivni operacij. V zvezi s tem se je začela uporabljati kadaverična in fetalna koža. Pojavila se je potreba po ohranitvi donorskih virov in iskanju načinov za nadomestitev človeške kože z živalskimi tkivi ter različnih možnosti modeliranja kože. In prav v tej smeri so delovali znanstveniki, ko je leta 1941 P. Medovar prvič dokazal temeljno možnost rasti keratinocitov in vitro. Naslednja pomembna faza v razvoju celičnih tehnologij je bilo delo Karaseka M. in Charltona M., ki sta leta 1971 izvedla prvo uspešno presaditev avtolognih keratinocitov iz primarne kulture na kunčje rane, pri čemer sta kot substrat za gojenje CC uporabila kolageni gel, kar je izboljšalo proliferacijo celic v kulturi. J. Rheinvvald in H. Green sta razvila tehnologijo za serijsko gojenje velikih količin človeških keratinocitov. Leta 1979 sta Green in soavtorja odkrila možnosti za terapevtsko uporabo celične kulture keratinocitov pri obnavljanju kože v primerih obsežnih opeklin, nakar so to tehniko, ki se je nenehno izboljševala, začeli uporabljati kirurgi v opeklinskih centrih v tujini in pri nas.

V procesu preučevanja živih celic so ugotovili, da celice proizvajajo ne le biogene stimulatorje nebeljakovinskega izvora, temveč tudi številne citokine, mediatorje, rastne faktorje in polipeptide, ki igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju homeostaze celotnega organizma. Ugotovljeno je bilo, da različne celice in tkiva vsebujejo peptidne bioregulatorje, ki imajo širok spekter biološkega delovanja in usklajujejo procese razvoja in delovanja večceličnih sistemov. Začela se je doba uporabe celične kulture kot terapevtskega sredstva. V zadnjih desetletjih se je v kombustiologiji pri nas začela presaditev suspenzije fibroblastov in večplastnih plasti keratinocitnih celic. Tako aktivno zanimanje za presaditev kožnih celic opečenim bolnikom pojasnjujejo s potrebo po hitrem zaprtju velikih opečenih površin in pomanjkanjem donorske kože. Možnost izolacije celic iz majhnega koščka kože, ki lahko prekrije površino rane, ki je 1000- ali celo 10.000-krat večja od površine donorske kože, se je izkazala za zelo privlačno in pomembno za kombustiologijo in bolnike z opeklinami. Odstotek prijemanja plasti keratinocitov se razlikuje glede na območje opekline, starost in zdravstveno stanje pacienta in se giblje od 71,5 do 93,6 %. Zanimanje za presaditev keratinocitov in fibroblastov ni povezano le z možnostjo hitrega zaprtja kožne napake, temveč tudi z dejstvom, da imajo ti presadki močan biološko aktiven potencial za izboljšanje videza tkiv, pridobljenih kot posledica presaditve. Nastanek novih žil, lajšanje hipoksije, izboljšan trofizem, pospešeno zorenje nezrelega tkiva - to je morfo-funkcionalna osnova za te pozitivne spremembe, ki nastanejo zaradi sproščanja rastnih faktorjev in citokinov s strani presajenih celic. Tako so kombustiologi zaradi uvedbe progresivnih celičnih tehnologij za presaditev večceličnih plasti avtolognih in alogenskih keratinocitov in fibroblastov na velike rane v medicinsko prakso ne le zmanjšali stopnjo umrljivosti žrtev opeklin z visokim odstotkom kožnih lezij, temveč tudi kakovostno izboljšali brazgotinsko tkivo, ki se neizogibno pojavi na mestu opeklin stopnje IIb in IIIa ter b. Izkušnje kombustiologov, pridobljene pri zdravljenju ranskih površin pri bolnikih z opeklinami, so nakazale idejo o uporabi že modificirane Greenove metode v dermatokirurški praksi za različne kožne in kozmetične patologije (trofične razjede, vitiligo, nevusi, bulozna epidermoliza, odstranjevanje tetovaž, starostne spremembe kože in za izboljšanje videza brazgotin).

Uporaba alogenskih keratinocitov v kirurgiji, kombustiologiji in dermatokozmetologiji ima številne prednosti pred uporabo avtolognih keratinocitov, saj je celični material mogoče pripraviti vnaprej v neomejenih količinah, ga po potrebi shraniti in uporabiti. Znano je tudi, da imajo alogenski CC zmanjšano antigensko aktivnost, saj pri gojenju in vitro izgubijo Langerhansove celice, ki so nosilci antigenov HLA kompleksa. Uporabo alogenskih CC podpira tudi dejstvo, da jih po presaditvi po mnenju različnih avtorjev v 10 dneh do 3 mesecih nadomestijo avtologne. V zvezi s tem so danes v mnogih državah nastale celične banke, zahvaljujoč katerim je mogoče pridobiti celične presadke v potrebni količini in ob pravem času. Takšne banke obstajajo v Nemčiji, ZDA in na Japonskem.

Zanimanje za uporabo celičnih tehnologij v dermatokozmetologiji je posledica dejstva, da "celične sestave" nosijo močan bioenergetski in informacijski potencial, zaradi katerega je mogoče doseči kakovostno nove rezultate zdravljenja. Avtokini, ki jih izločajo presajene celice (rastni faktorji, citokini, dušikov oksid itd.), delujejo predvsem na telesne lastne fibroblaste, kar povečuje njihovo sintetično in proliferativno aktivnost. To dejstvo je še posebej privlačno za raziskovalce, saj je fibroblast ključna celica dermisa, katere funkcionalna aktivnost določa stanje vseh plasti kože. Znano je tudi, da se koža po poškodbi kože s kavterizacijo, laserjem, iglo in drugimi instrumenti napolni s svežimi matičnimi predhodniki fibroblastov iz kostnega mozga, maščobnega tkiva in kapilarnih pericitov, kar prispeva k "pomlajevanju" bazena telesnih celic. Aktivno začnejo sintetizirati kolagen, elastin, encime, glikozaminoglikane, rastne faktorje in druge biološko aktivne molekule, kar vodi do povečane hidracije in vaskularizacije dermisa, izboljšanja njegove trdnosti,