Eksperimentalno delo pri presaditvi alogenskih keratinocitov na umetno ustvarjene brazgotine belih podgan

Želja po uporabi celičnega potenciala in potrebo po iskanju novih učinkovitih metod za izboljšanje estetskega videza brazgotin, je vodila do ideje, da bi poskusili preučiti možnost presaditve keratinocitov na brazgotine.

Da bi dokazali možnost uporabe keratinocitov kulturo za izboljšanje videza brazgotin eksperimentalno delo je bilo opravljeno na belih laboratorijskih podganah, ki so bile ustvarjene brazgotin površino. Brazgotinjenja modela podgane smo pripravili z umetno celjenje ran, povzročene na hrbtu, vzdolž hrbtenice. Podgane smo razrezali kosov iste usnja, velikosti 2x3 cm. Po 2,5 mesecih po operaciji "simulacija brazgotinjenje" podganam smo izvedli dermoabrazijo operacijo (odstranitev zgornje plasti preko ignioperation vampu) in transplantiranih alogensko keratinociti, izolirano iz kože mladih podgan 2-4 dni po rojstvu.

Izolacijo in rast podganjih epidermocitov smo izvajali v laboratoriju celičnih tehnologij inštituta za citologijo RAS naslednje tehnologije.

Kožo smo sprali v slani raztopini Hanksa, ki vsebuje 200 g / ml gentamicina, razrezane na majhne koščke s površino 0,2-0,5 cm ². Kožne kocke smo inkubirali v 0,5% raztopini disaspaze v uravnoteženi raztopini fosfata z raztopino fosfata pri 37 ° C za eno uro. Kosi so nato prenesli v Dulbeccojevo fosfatno pufrsko sol in epidermis ločili od dermisov. Povrhnjica smo inkubirali v 0,125% raztopine tripsina 10-15 minut med mešanjem pri hitrosti 50 vrtljajev / min, nakar smo encim ustavili z dodatkom 5% fetalnega govejega seruma. Ena tretjina nastalo suspenzijo celic smo uporabili v čisti obliki za eno od možnosti za presaditev brazgotine, druga tretja gojili na domačem biokompatibilnega filmsko oblogo "Polipor", tretji - na petrijevko brez podlage. Delovanje dermoabrazija pridobljeni brazgotinjenje pri podganah z nadaljnjim prenosom na njih epidermotsitov podgano pod etrom anestezijo smo izvedli z uporabo cautery.

Prva skupina podgan po dermoabrazijo na polirani, izperemo s slanico in posušimo površinsko sterilne rumen prekriva dele trate, ki so deponirane zakodirane alogensko podgana epidermotsitov gošče v koncentraciji 1,5 milijonov celic na 1 ml (glede na inštitutu citologije). Batist kosov zložene na polirane brazgotine, tako da so celice tvori na površini brazgotine. Bandaža na vrhu več plasti gaze, ki je prišit na robove brazgotine.

Del dobljene celične suspenzije je bil posujen v Petrijevih posodah na sterilnih filmih Polypore v obliki skodelic, drugi del na posodah Petri brez filma. Gojitev smo izvedli v mediju FAD, ki je sestavljen iz mešanice DMEM in F12 v razmerju 3: 1. Z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma, 5 μg / ml insulina (Sigma), 0,5 μg / ml hidrokortizonijevega hemisukcinata (Sigma). 10 μg / ml epidermalni rastni faktor EGF (Inštitut za citologijo RAS, Sankt Peterburg). Druga in tretja skupina podgan z 7 osebami je delovala 6 dni po prvem. V tem času so se večplastne plasti oblikovale iz suspenzije posejanih keratinocitov v petrijevke, ki so bile presajene na podgane. Druga skupina je bila presnova z epidermociti na filmu, tretja skupina - z večplastno plastjo brez podlage. Po sedmih dneh so večplastne plasti alogičnih keratinocitov (MPALK), posejane na folije Polypore, transplantirane s kulturo neposredno na površino rane. Zgoraj, film, da bi se izognili njegovemu raztrganju, je bil pritrjen z večslojnimi gazami in šivom na kožo podgan.

Pred presajanjem keratinociti tretjo skupino podgan, goji brez substrata, ki proizvajajo ločitev PAC z dna zdravljenje jed dispaze Petri, ki ima sposobnost, da selektivno prekinitev komunikacije Dermo-epidermalni. Pod vplivom večplastna akumulacijskega dispaze uniči priključitev bazalnih celic plasti na dnu petrijevke in v veliko manjši meri to vpliva na medcelično komunikacijo, ki omogoča, da se "odstrani" celotno plast. Ločitev večslojne tvorbe celične dispaze bila izvedena kot sledi. Od Petrijevke mešana transportno gojišče smo celičnih plasteh izperemo trikrat z medijem, ki vsebuje antibiotikov, zlasti - gentamicin (0,2 mg / ml). Večplastne plasti smo zlili 0,125 raztopino% dispaze ( "Sigma") in nameščene v inkubator, kjer so inkubirali pri T = 37 ° C za 20-30 minut. Videz belo corolla, peeling okoli oboda posode - pokazatelj začetku procesa ločili od robov in dna petrijevke. Nekaj minut po začetku postopka ločevanja, smo dispaze raztopino izpraznili 2-3 krat epitelijske plasti speremo z medijem. Na bila uporabljena površina epidermalne plasti, razrezan na velikost skodelice kos sterilne Obveza za rano "Leith-barva, ki se odcepimo ločimo dispaze formaciji, nadaljnjo razslojevanja na dnu skodelice z lopatico. Uporaba očesnih pinceto plast skupaj s prevleko vložka" Leith-color "(rusko ) otresle dna petrijevko in previdno prenese na pripravljeno površino brazgotine. Prtički "Lita-barvni" vsebuje v svoji sestavi in gentamicin eksolin (kolagen ekstrakt), ki pri mokrem okolju ostane rastnimi v prihodnosti Shem raztopina soli nabreklih in postal sodoben celjenje premaz, ki zagotavlja dobro zaščito pred zunanjo infekcijo in hitro zdravljenje zaradi nastajajoči mokroto s strukturo.

Polipropilni filmi in Lita-barve prtiči so bili prepleteni z gazo povoji, ki so prišli na kožo podgan za bolj trajno pritrditev. Vsaka podgana je bila zasajena v ločeni kletki, da bi ustvarila optimalne pogoje za njegovo vzdrževanje in privabljanje presajenih keratinocitov. Povoji podgane, ki vsak dan presajene vzmetenje in večplasten rezervoar epidermotsitov shot dispaze, večkrat na dan, navlaženo s sterilno fiziološko raztopino ustvariti najugodnejšimi pogoji celice za prijetje presadka. Glede na to, da je film "Polypor" neprepusten za vodo, podgane druge skupine niso navlažile preliva, kar je bila ena od prednosti pred presaditvijo brez filmov. Po 10 dneh so bili povoji odstranjeni. Klinična slika brazgotine po presaditvi celic ne razlikujejo bistveno od presaditve brez brazgotinjenje, razen roza jih barvanje (skozi dermoabrazijo) in več piling. To dejstvo to kaže. Da se takoj po izginotju rane obloge z IPC v vampi niso pojavile spremembe.

Pridobivanje biopsijskega materiala pri podganah.

Po 1, 2, 5 in 9 mesecev po transplantaciji keratinocitov na podganah allogichnyh zemlja brazgotine bele podgane, ob dobljenim materialom za histološko, cytomorphological in elektronsko mikroskopski študiji. Kot kontrolni vzorci normalne kože in brazgotine podgane so vzeli brez presaditve celic. Anestezijo pri podganah smo izvajali z anestezijo etra.

Po anesteziji, iz označenih območij, v katere so bili presajeni keratinociti, biopsija s premerom 2 mm. Kosi brazgotinskega tkiva smo vzeli in dali v 2,5-odstotno raztopino glutaraldehida, da smo pripravili material za elektronsko mikroskopijo. Kosi tkiva vzeli za histološko preiskavo smo dali v 10% raztopini nevtralnega formalinom, čemur sledi preko ožičenja alkoholi in napolnimo s parafinom, čemur sledi rezanje ultratankih odsekov in stavijo na svetlobo optičnim mikroskopom.

Nadzor I. Običajna koža podgana.

Če želite videti razliko med mikroskopsko sliko normalno-brazgotin spremenila podganah kožo in brazgotin po določenem obdobju po presaditvi IDC, so slike in opisi dokazali, da jim v vseh fazah študija.

Povrhnjica kože je sestavljena iz 7-9 plasti celic. Horny plast zmerne debeline. V krajih je sestavljena iz 6-8 plasti okornih lestvic. Bazalni sloj predstavljajo celice cilindrične oblike z veliko svetlobo, navadnimi jedri in več jedkoni. Desmosomne povezave med celicami in bazalno membrano so jasno izražene. Pod dobro definirane bazalne membrane, ki ima drobne izbokline v subepidermalnih plasti ležijo vzporedno položnem snopov kolagena in elastina vlakna vključno podolgovatih fibroblastih, manjša plovila. V globljih plasteh so snopi kolagena in elastinskih vlaken v različnih smereh. Med njimi je veliko plovil s tankimi stenami istega kalibra, celičnih elementov (fibroblastov, mastocitov, levkocitov). V velikem številu lasnih mešičkov, lojnic.

Nadzor 2. Brazgotina podgana, stara 2 meseca.

Klinična slika. Brazgotine bledo rumene barve, z lupinami, kjer ostanejo skorje. Njihova površina se je zmanjšala zaradi krčenja kolagenskih vlaken in postala približno 3,0-3,5 cm ^:. Pripomočki za kožo niso na voljo.

Mikroskopska slika. Povrhnjice sestavljajo 3-5 plasti celic, naguban, z zaobljenimi bazalnih celic, ena vrstica subulate zastopata 1-2 vrstic keratohyalin granul z zrna v zgornji plasti, so odseki znotrajcelične edema. Rojena plast se heterogeno spremeni iz zelo tanke v zgoščeno. Zgibanje vročine zaradi (krčenja) brazgotinastega tkiva. Gube prodrejo do papilarne plasti in dajejo vtis papileja. Meja med povrhnjico in dermisom je ravna črta. Bazalno membrano ni mogoče izslediti povsod. V spodnjem delu podepidermalnih in globljih slojev - posode z debelo, oslabljeno steno, veliko puščavnih, s staznimi pojavi. Okoli plovil - grozda makrofagov, fibroblastov. Makrofagi obkrožajo eritrocite, ki izvirajo iz kapilar in jih fagocitirajo. V bolj površnih plasteh - majhnih kapilarah. Pod povrhnjico so kolagenska vlakna ohlapna. V globljih plasteh rumen - grobih snopov kolagenskih vlaken, med katerimi je veliko fibroblastov.

Brazgotinjenje podgane mesec dni po presaditvi MPAl podganjih keratinocitov.

Klinična slika. Brazgotine roza, njihovo območje se je zmanjšalo, zlasti v premeru in v povprečju 2,5-3 cm ². Lase in lojnice niso prisotne.

Te mikroskopska preiskava materiala dobimo iz podgan s prenosom MPAlK MPAlK na filmu in substratom brez bistvu identična. Vendar pa je tehnično delo z MPAlK nepodprto veliko težje in težaven kot pri gojenju MPAlK na podlago, tako da je nadaljnje proučevanje vprašanja o presaditvi kertainotsitov brazgotine smo uporabili kot osnovo za gojenje ( "substrat") večplastna trate.

Mikroskopska slika. Obstaja zgoščevanje povrhnjice do 15-20 slojev, skoraj do sredine katerih keratinociti imajo ozko, podolgovato, navpično obliko in kompaktno razporeditev. Bazalne celice so razporejene v neenakomerno črto. Njihova jedra so lahka, velika, okrogle oblike z enim ali dvema nukleoloma, kar kaže na njihovo visoko sintetično in proliferativno aktivnost. Meja med povrhnjico in dermisom je ravna črta. Trnovo plast je dobro razvita, sestavljena je iz 3-5 slojev celic okrogle oblike, obstajata 2 celic jedrske celice.

Takoj pod bazalne membrane - plotnoraspolozhennye tanke svežnjev kolagenskih vlaken vzporedno velikega števila plovil zapustevshih globlje kolagenska vlakna groba zbrane v ozkih snopov. Mnoga velika fibroblasti, mastociti (2-3 v vidnem polju), makrofagov, levkociti in zapustevshih plovila, katerih stene so popustili okoli njih - ohlapno postavljena kolagenska vlakna. V nekaterih plovilih - stazu, diapedeziji enotnih elementov. Okoli posode - fibroblasti, posamezni limfociti. Pripomočki za kožo niso na voljo.

Ko se suspenzija keratinocitov presadi v polirano brazgotino, se mikroskopska slika razlikuje od prejšnje. V večini živali - povrhnjica je tanka, sestoji iz 5-6 slojev celic. Spodnja plast sestavljajo celice nepravilne, poligonalne oblike z zaobljenimi nepravilno oblikovanimi jedri. Stanje subepidermnega sloja je podobno stanju v skupini živali brez presaditve.

V tem primeru lahko govorimo o zamudi procesov, ki spremljajo presaditev celic, ali velike izgube celic, presajenih v obliki suspenzije. Zato je prišlo do zaključka, da popravek brazgotin s presaditvijo keratinocitov v obliki suspenzije ni priporocljiv.

Brazgotina podgane 2 meseca po presaditvi MPAl podganjih keratinocitov.

Klinična slika. Brazgotina izgleda tanka, nežno. V krajih je ekstenzija, lestvice.

Mikroskopske slike. Stratum corneum je zgostitev, na mestih - hiperkeratoza. Povrhnjica je zgoščena, sestavljena je iz 12-20 vrstic celic. Meja med povrhnjico in dermisom je ravna črta. Nežna kolagenska vlakna pod povrhnjico ležijo precej tesno. V globljih plasteh vleka se zbirajo v grobih velikih snopih. V subepidermalnem sloju se pojavi nova tvorba plovil. V spodnjih plasteh brazgotinastega tkiva - veliko praznih posod, nameščenih vzporedno s površino povrhnjice. Veliki fibroblasti so enakomerno porazdeljeni v debelini vampa, obstajajo velikanski, večplastni, številni makrofagi.

Brazgotina podgana 5 mesecev po presaditvi MP iz spermocitov podgan.

Klinična slika. Scar izgleda gladka, gladka, brez piling, obstaja en sam las na njihovo večjo gostoto ob robu brazgotine, kar kaže na rob vraščene lasne mešičke v vampu in neoplazme od lasnih mešičkov. Območje brazgotin se še naprej zmanjšuje.

Mikroskopska slika. Povrhnjica je še vedno gosta (15 do 20 plasti, včasih do 30) v zgornjih plasteh je napolnjena z zrnci keratogialina. Bazalna membrana je jasno vidna. Pod njenimi kolagenskimi vlakni ležijo svobodno. V spodnjih plasteh - kolagen je močnejši in tesno zapakiran. Med žarki kolagena je veliko kapilare .. V zgornjih plasteh se je zmanjšalo število praznih plovil. Epidermis in dermis sta rahlo valovita. Obstajajo globoki epidermalni izrastki v brazgotinskem tkivu. Med kolagenska vlakna so vidna na novo oblikovana plovila. Pojavijo se posamezni lasni mešički in lojnice.

Brazgotina podgane 9 mesecev po presaditvi epidermocitov podganjih podganjih IPA.

Klinična slika. Brazgotine so precej manjši v primerjavi s prejšnjimi obdobji, in njihova površina povprečno okoli 1,5-2,0 cm ². Brazgotine so neenakomerno pokrite s tankimi lasmi, zlasti okoli periferije. Ohrani se manjša manjša ploščica.

Mikroskopska slika.

Povrhnjica je postala tanjša, predstavljena iz 6-8 vrstic celic, ki spominja na epidermalno strukturo normalne kože podgan, samo gostoto celic za 1 mm. Višje in so manjše. Bazalna plast je sestavljena iz majhnih celic okrogle valjaste oblike. Bazalna membrana je dobro definirana, hemidozmomi so jasno vidni. Opazimo prisotnost epidermičnih izrastkov v subepidermalnem sloju. Papilarna plast je izražena vzdolž celotne dolžine brazgotine. Ta dejstva kažejo, da se je v tem času adhezija presajenih keratinocitov bistveno okrepila z osnovnimi tkivi v vetru. Zato je lahko skrb za brazgotine ljudi z presaditvijo MALC 9 mesecev po presaditvi IPC lahko tradicionalna. Pod povrhnjico so bolj občutljiva kolagenska vlakna kot v globokih plasteh. Veliko plovil je bilo, še posebej na površini. V večjih posodah so stene odebeljene. Lasni mešički in lojnice v velikih količinah. Mikroskopski vzorec spominja na kožno tkivo.

Rezultati eksperimentalnega dela in njihova razprava.

Med izdelavo umetnih kožnih brazgotin podgan po operaciji dermoabrazijo, presajenih keratinocitov v različnih formah- na ran površine, kot suspenzijo v Batist in večplastna postavitev brez substrat. Delo je bilo opravljeno za pridobitev morfoloških podatkov o učinkih transplantiranih alogenih keratinocitov na brazgotine, kot tudi za določitev optimalnih variant transplantatov.

Ugotovljeno je bilo, da so vsi trije načini presajanje realne, vendar brez presaditve Mpaka substrata - zelo težaven postopek, v katerem se Mpaka lahko poškodujejo in se odraža na rezultatih presaditve. Poleg tega ta metoda presaditve izključuje delo na velikih površinah.

Presaditev keratinocitnega vzmetenje - je bistveno bolj ekonomičen način ni potrebno globoko kultiviranje celice in preprosto v predloženem izvedbenem primeru stika z uporabo sterilne batist predoblike, katere dimenzije ustrezajo vrednosti brazgotinjenja. Zaostanek terapevtski učinek pri presajanju celične suspenzije za približno mesec dni, v primerjavi z IPC na jutranje rane - ni pomemben trenutek, ko je trajanje zneskov zdravljenja do več mesecev. Znano je, da se je pri presaditvi IPC za opekline bolnikov transformacija stanja kožne strukture pojavila postopoma in več let. Transplantacija kulture keratinocitov na ranjenih oblogah je najprimernejša in obetavna metoda, vendar je tudi dražja. Poleg tega zahteva iskanje danes izboljšal različice premazi, ki morajo biti voljni, higroskopičen, imajo bakteriostatičnih ali baktericidne lastnosti in biti biološko nevtralna za celice. Film "Polipor" - vmesna različica domačega pokritosti film rane, kljub nekaterim pomanjkljivostim, nam je dovoljeno, da preuči eksperimentalno keratinocitov presajanja podgane na brazgotine in sklepati o učinkovitosti te smeri privlačnosti brazgotine.

Avtorji, ki so izvedli presaditev na rane IPC izgoreli, ugotovil, da je v prvem tednu po presaditvi na večplastnih rezervoarja keratinocitov na rano sanirano, povrhnjico zgosti in stratificiran. Vse plasti povrhnjice so bile dobro opredeljene. Zanimivo je, da je število celičnih plasti pri transplantih 10-30% večje kot pri vzorcih biopsije kože. Avtorji so na 5 dni po presaditvi MPA, bazalne membrane in hemidozmozoma opazili pojav granul kot keratogialin - že tretji dan.

J.Rives et al .. (bi po vsej l994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov s sod. (1998) je pokazala, da se komunikacija med usnjico in povrhnjico je v zgodnjih obdobjih po presaditvi bolnikov MKG s polnosloynymi napak kože po opeklinah zelo šibka in je premica, papilarni plasti odsoten. Do konca 2. Meseca se začne tvorba plitvega papil in kožnih priveskov, komunikacijskih usnjice in povrhnjice postane močnejša. Literatura podatki govoryato presadkom alogenske keratinociti za rano sežge paciente kot obetavno metodo. Kljub temu, da pride do zavrnitev alogenskih keratinocitov različnih avtorjev, predloženih v obdobju od 10 dni do 3 mesece, vendar pa imajo pomembno vlogo pri zdravljenju s površino rane, sproščanje rastnih faktorjev in mehansko zapiranje napako. Menijo, da so MPAlK zmanjšala antigensko aktivnost, kot takrat, ko kultivirani in vitro izgubiti Langerhansovih celic, ki jim omogoča, da obstaja že dalj časa v telesu prejemnika. Poleg tega alogensko kultura izvira iz kože zdravih mladih ima veliko večjo biološko potencial kot za avtologno kulture bolnikov po poškodbi.

Glavni namen raziskave je bil ugotoviti, ali uveljavljati v alogenske keratinocitov brazgotine in kakšne bodo spremembe v tkivu brazgotin pod vplivom take biološko aktivne "rane jutranje". V primeru pozitivnega rezultata izdelajte najučinkovitejšo in najmanj delovno intenzivno tehnologijo na tem področju rehabilitacijske medicine.

Podatki v mnogih pogledih smo jih pridobili, so bili podobni tistim v literaturi na morfološke spremembe, ki se pojavljajo v človeških povrhnjici po presaditvi alogenskih keratinocitov na opekline rane. Vendar pa obstajajo pomembne razlike, tako v smislu morfološkega substrata, ki je presajena, in v smislu tehnologije. Torej. Oblikovanje bazalne membrane in dermalnih-epidermalni vezi (poludesmosom, papil) pojavi pozneje v primerjavi s prenosom keratinocitov na rane površine brez brazgotin. Zdi se, da je to posledica slabe prehrane tkiv v vampu v primerjavi z dermisom ali mišičnimi očmi. Brazgotina, zlasti stara, je gosto vezivno tkivo z zelo majhnim številom posod, spodnji del opekline je granulacijsko tkivo, bogato z žilami. Tako je očitno, da so pogoji, pod katerimi potekajo presaditve in prisotnost keratinocitov, popolnoma drugačni. Bolj vaskularizira področje presaditve celic, lažje jih obdeluje. Iz tega postulata se sklene sklep o prednostih dela z mladimi brazgotinami, v katerih je vezivno tkivo še vedno dovolj ohlapno in bogato z žilami.

Kot rezultat tega eksperimentalnega dela je dokazano, da:

1. Možna je presaditev MALK v brazgotine. 
2. Optimalna metoda presaditve je presaditev keratinocitov na pokrovu rane.
3. Površina brazgotine je treba zmleti z operativnim dermabrasionom z uporabo Schumannovega laserja ali rezalnika.
4. Pod vplivom MPALK pride do hitre epitelizacije talne površine vleka.
5. Bolje vaskularizirano brazgotinsko tkivo, tj. Mlajša brazgotina, boljše rezultate transplantacije keratinocitov.
6. Tkivo brazgotine pod vplivom presajenih keratinocitov se postopoma preoblikuje in se spremeni v dermalno (bolj krho tkivo brazgotine z dodatki kože).
7. Postopno sproščanje brazgotinastega tkiva se začne s subepidermalno plastjo. Izboljša svojo vaskularizacijo, svežnji kolagenskih vlaken v zgornjem in spodnjem delu vretena so bolj krhke lokacije kot v brazgotinskem tkivu brez presaditve celic. Obstajajo lasni folikli in lojnice. Epidermis v svoji strukturi se po prehajanju faze hipertrofije približuje povrhnjici normalne kože.
8. Opažene spremembe se nanašajo na keratinocitih izločajo rastne faktorje, citokine, ki izboljšujejo trofizmu brazgotine prispevajo k preoblikovanju iz togega fibroznega tkiva v ohlapnejši, kar vodi k izboljšanju brazgotine.

Na podlagi te študije lahko sklepamo, da je koristen učinek transplantiranih keratinocitov na brazgotinsko tkivo, kar je lahko praktično pomembno za rehabilitacijo bolnikov z različnimi vrstami brazgotin.

To delo na podganah je prav tako omogočilo oblikovanje zahtev. Za rane, na katere se gojijo keratinociti.

Obloge rane morajo biti:

• biokompatibilen s celicami,
• dihanje,
• imajo elastično obliko,
• biti hidrofilni,
• saj zdravilni aditivi vsebujejo antibakterijska zdravila in antioksidanti niso strupeni za gojene celice.

Klinični rezultati biotehnološke obravnave brazgotin.

Earlier, N. Carver et al. (1993) je pokazala, da so okluzivnih prelivi najbolje spodbuja navezanost na rano in preživetje keratinocitov, vendar ne dovolite, da nastane stratifikacije (zrele) povrhnjico. Za oblikovanje stratificirane povrhnjice je potrebno zračno okolje. Zato je po namestitvi večplastnega sloja po 7-10 priporočal okluzivno zaščito ran, da odstranimo in izvedemo rane v suhih povojih ali mazilih, topnih v vodi. Lahko rečemo, da je kakovost in lastnosti iz "podlage", na katerem se goji celice zelo pomemben trenutek za učinkovitost presaditvi celičnega materiala in s tem za rezultate dela zdravnikov. Ampak idealna rane jutranje za danes ni, kljub številčnosti predlaganih možnosti (umetnega usnja, netkane tkanine iz karboksimetil celuloze, fibrina premaze, pol-prepustno poliuretanski film). Ni nepomembno vidik je strošek "podlage" v tem vprašanju (posebni rane), njihova visoka cena poveča skupne stroške biotehnološko zdravljenja.

Učinkovitost celičnih tehnologij je do sedaj dokazana, vendar so te tehnologije na žalost zelo drage, zlasti v državah, kjer industrijska proizvodnja celičnih kompozicij ni vzpostavljena. Kljub temu so države, kot so Združene države, že dolgo ustanovile industrijo za proizvodnjo celičnega materiala za presaditev opečenega. Še posebej, je družba BioSurface Technology Inc, od leta 1989, postavljeno 37.000 laminiranih plasti keratinocitov, ki so bile uporabljene za zdravljenje 240 bolnikov v 79 državah po vsem svetu (R.Odessey, 1992), z 1 cm ² celični kulturi stane okoli 7-8 $ US.

Tehnologija zdravljenja različnih bolezni in težav s kožo ima številne razlike, vendar je v osrčju vsakega zdravljenja s celicami proizvodnja kakovostnega celičnega materiala in njegova presaditev.

Ta postopek je sestavljen iz naslednjih korakov:

• izbira kože pri prizadetih (ali od darovalcev),
• prevoz kožnih loput v biotehnološki center,
• izolacijo celic bazalnega sloja in njihovo množenje,
• nastanek večplastnih slojev keratinocitov (IPC).
• presaditev celičnih kultur.

Glavna težava pri zdravljenju s presajanjem večplastnih slojev keratinocitov je potreba po sposobnih celicah na vseh stopnjah presaditve celic. Kožni deli za izolacijo avtolognih ali alogenih celic morajo biti čim bolj tanki, saj se v tem primeru lažje ločijo z uporabo mehanskih in encimskih metod ter pridobijo suspenzijo živih celic za rast. Lahko jih dobimo z odrezovanjem dermatoma ali z uporabo kože vek, kožice kože, notranje površine rame. Glede na to, da so celice občutljive na halogene (klor, jod), vodikov peroksid, jih ni mogoče uporabljati pri zdravljenju kože med odvzemom materiala.

Kvantitativni in kvalitativni pridelek celic kožnih cepljenk in učinkovitost njihovega gojenja sta odvisna tudi od zdravstvenega stanja in starosti darovalca. Poleg tega je treba osebje kože biopsije dostaviti v laboratorij čim prej in v ustreznih pogojih (okolje, temperatura) dostaviti v certificiran in akreditiran laboratorij.

Za shranjevanje in prenašanje kožnih presadkov se lahko uporabljajo ali Dulbecco medij 199, dopolnjenem z 10% govejega seruma, srednji DMEM z dodatkom 5% fetalnega govejega seruma in antibiotiki.

Pri PAP citološki laboratorij dermalni biopsije najprej mehansko ločimo na majhne koščke, čemur sledi obdelava kožnih koščke, ki uporabljajo encime: tripsin, kolagenaze, dispaze, in drugi.

Pod delovanjem encimov pride do uničenja z desmosomi in keratinociti sproščajo v medij kot ločene celice ali agregati, ki jih sestavljajo različno število celic. Za kulturo se uporabljajo samo bazalni keratinociti, ki se gojijo na posebnih medijih v inkubatorjih, ki vsebujejo 5% CO, v petrijevih posodah ali v vialah pri t = 37 ° C. V 48 urah opazimo nastanek kolonij keratinocitov, ki postopoma konvergirajo v monosloj. Po pridobitvi zadostnega števila celic nastala suspenzija razširi na pokrovčke za rane, pripravljene za ta namen, in jih položimo v posodo Petri. Od suspenzije najprej nastane monoslojna in nato večplastna plast keratinocitov. Shematično so faze postopka gojenja keratinocitov prikazane na sl. 12 (33.43.54.65).

Tvorba večplastne tvorbe keratinocitov, primernih za presaditev, običajno traja 7-10 dni. Včasih je to obdobje daljše, kar je odvisno od kakovosti izvornega materiala (starost, zdravje dajalca, pravilnost materiala, kakovost uporabljenih medijev itd.). Če se večplastna plast prelazi, potem na površini lahko pride do celic z apoptoznimi pojavi, neprimernimi za presaditev. Petrijevke, ki rastejo z njimi ran plasti večplastne coatings keratinocitov (IPC) dostavijo v kliniki v posebne posode pri temperaturi, ki ni nižja od + 15 ° C.

Modificirana zelena metoda za rast IPC

V našem delu kot prevleka rane smo uporabili večplastno kamrino, opustili smo polypore filme, s katerimi smo začeli delati v poskusu s podganami. Tako smo večplastni sloji keratinocitov zrasli na predfatnem in sterilnem batistu, čeprav to tudi ni optimalno pokrivalo ran.

Klinične študije so opravili prostovoljci ob upoštevanju potrebnih etičnih norm: podpis pogodbe in soglasja.

1. Uporabili smo kulturo lastnega (avtolognega) in vzetega iz celic (alogenih) keratinocitov.
2. Lastne keratinocite smo dobili iz kosa kože, razrezane z notranje strani ramena bolnikov.
3. Delovanje dermabrazije brazgotin je bilo izvedeno s pomočjo termokoupljivih, rotacijskih diskov in erbijevega laserja.
4. Skupine bolnikov z normotrofičnimi, hipotrofičnimi in hipertrofičnimi brazgotinami so bile vzete.

Tehnološki postopek za uporabo celične tehnologije za izboljšanje vrste kožnih brazgotin je obsegal naslednje faze:

1. Izbor bolnikov.
2. Pojasniti bistvo zdravljenja, čas pridobivanja pričakovanih rezultatov, podpisati pogodbo in informirano soglasje.
3. Imenovanje bolnikov za 2-3 tedne pred operacijo selmevit za 1t. 3-krat na dan, zinkteral na 1t. 3-krat na dan.
4. Vzamejo kos kože 2,0 cm dolg in širok 0,7-1,0 cm od notranje ploskve ramena, ki je skoraj na dnu osniške regije, da pridobi avtologne keratinocite.
5. V primeru okvare pacientov do lastnega izbora keratinocitov zaradi možnosti pridobitve linearno brazgotino na notranji površini rame, je celični material, vzet iz banke celic (alogensko keratinocitov).
6. Keratinocite smo izolirali in gojili v pogojih laboratorija, certificiranega za to vrsto dela.
7. Po prejemu IPC, ki je zadostna za presaditev, je bil na klinićne dni na kirurśko dano operativni dan, kjer so bili v posodo iz petrijevih kozarcev dodani posebni kontejnerji.
8. Delovanje dermoabrazija izvedemo v vampu hemostazo obdelovane površine izperemo s sterilno slanico, posušimo, nakar ga presadimo v sterilnih IPC batist "celice navzdol." To pomeni, da so bile celice, ki so bile zgornje v MIC, nižje, v bližini polirane površine.
9. Sterilni film je bil na vrhu nameščen, ki je bil pritrjen na kožo z elastičnim zavojem ali elastičnim trakom Omnifix. Namesto filma lahko uporabimo tudi indiferentne prevleke za rane, ki vsebujejo silikon, na primer Mepitel, Mepiform, silikonske gelne plošče.

Po 5-7 dneh odstranimo film ali silikonsko prevleko. V tem času se morajo vsi keratinociti plaziti na polirani brazgotini in se prilepiti na njegovo površino.

10. Mokro okolje, ustvarjeno pod filmsko in silikonsko prevleko, aktivno prispeva k temu. Baptist, ki ostane na brazgotini od te točke, lahko impregniram s kurioznim ali citozanskim gelom. Kot rezultat, na drugi dan se ustvari gosta skorja, ki je za udobje bolnika bolje pritrditi z elastičnim, zračno prepustnim ometom, na primer Omnifix. Dihalna skorja omogoča novo oblikovano povrhnjico, da se razlikuje in postane zrela.

Glede na vrsto brazgotine in globino brušenja se preliv zavrže po 8-10 dneh. Povrhnjica v tem trenutku ima 30-40% več celičnih plasti kot pri normalni koži. Bazalna membrana se ne tvori. Keratinociti zgoščenega povrhnjice sproščajo maso biološko aktivnih molekul v brazgotinsko tkivo.

Uspeh biotehnološkega zdravljenja brazgotine je v veliki meri odvisen od načina, kako jih skrbimo v pooperativnem obdobju. Kulture celic so "nežne" vrste rane in v zgodnjih obdobjih po presaditvi lahko BMD zlahka ločimo od spodnjih tkiv. Zato se bolnikom svetuje, da skrbijo za brazgotino po operaciji. Za 8-9 mesecev ne smete brisati in zlahka delati s hladno vrelo vodo, da se izognemo tanjšemu, novoustvarjenemu povrhnjam, ki nima tesnega oprijema s spodaj navedenimi tkivi.

Opomba:

Pred operacijo in med uporabo dermoabrazijo halogeniranih oksidantov in konzervansov (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, klorheksidin, vodikov peroksid) je dovoljena pred presajanjem kletok- absolutno kontraindicirana zaradi njihove citotoksičnih učinkov. Strupene za celice so tudi metilen modre barve. Briljantno zelena.

Da bi se izognili okužbam, še posebej pri delu s hipertrofičnimi brazgotinami, je možno zdraviti delovno polje z neomicin sulfatom, polimiksinom ali gentamicinom. Niso imeli citotoksičnega učinka na keratinocite.

Kot rezultat tega zdravljenja se doseže trojni učinek.

1. Poravnava površine vampa.
2. Ustvarite plast nad njo novo povrhnjico, normalno debelino.
3. Pretvorba brazgotine na dermopodobnuyu z delovanjem citokinov, rastnih faktorjev in drugih bioaktivnih molekul z transplantiranih celic in keratinocitih z njimi, fibroblasti in makrofagi stimuliranih izločajo.

Brazgotina postane manj opazna, bolj elastična, v njej se pojavljajo pore, dlakavi lasje, pigmentacija se lahko obnovi zaradi prisotnosti melanocitov v MPC.

Vendar pa vsi ti pozitivni trenutki v cicatrixu ne pridejo takoj. V zvezi s tem je treba opozoriti bolnike. Da je proces preoblikovanja brazgotinskega tkiva v dermis počasen in da je optimalen rezultat takega zdravljenja mogoče pričakovati ne prej kot 10-14 mesecev. Takoj po tem, ko je zavijanje zavrnjeno, imajo polirane površine izrazito polihrome, svetlejši je postopek mletja. Najmanjša poškodba kože nastane pri brušenju normotropnih brazgotin z erbijevim laserjem. Barva brazgotin in kožne kože je bila obnovljena v obdobju od 3 do 8 tednov. Kljub takšnim previdnostnim ukrepom včasih obstaja pooperativna hiperpigmentacija, ki lahko več mesecev traja neodvisno.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]