Eksperimentalno delo na presaditvi alogeničnih keratinocitov na umetno ustvarjene brazgotine belih podgan

Želja po uporabi celičnega potenciala in potreba po iskanju novih učinkovitih metod za izboljšanje estetskega videza brazgotin sta privedli do ideje o poskusu preučevanja možnosti presaditve keratinocitov na brazgotinske površine.

Da bi dokazali verjetnost uporabe kulture keratinocitov za izboljšanje videza brazgotin, je bila izvedena eksperimentalna študija na belih laboratorijskih podganah, katerim so bile ustvarjene brazgotinske površine. Model podganje brazgotine je bil pridobljen kot posledica celjenja umetno povzročenih ran na hrbtu, vzdolž hrbtenice. Podganam so izrezali enake koščke kože, velikosti 2x3 cm. 2,5 meseca po operaciji "modeliranja brazgotine" so podgane podvrgli dermabraziji (odstranitev zgornjih plasti brazgotine s termokavstiko) in presadili alogenske keratinocite, izolirane iz kože podganjih mladičev 2-4 dni po rojstvu.

Izolacijo in gojenje epidermalnih celic podgan smo izvedli v laboratoriju za celične tehnologije Inštituta za citologijo Ruske akademije znanosti z uporabo naslednje tehnologije.

Kožo smo oprali v Hankovi fiziološki raztopini, ki je vsebovala 200 U/ml gentamicina, in jo narezali na majhne koščke, površine 0,2–0,5 cm2 ^. Koščke kože smo 1 uro inkubirali v 0,5 % raztopini dispaze v uravnoteženi raztopini soli, pufrirani s fosfatom, pri 37 °C. Nato smo koščke prenesli v Dulbeccovo fosfatno pufrirano fiziološko raztopino in epidermis ločili od dermisa. Epidermis smo 10–15 minut inkubirali v 0,125 % raztopini tripsina ob mešanju pri 50 vrt/min, nakar smo delovanje encima ustavili z dodatkom 5 % fetalnega govejega seruma. Tretjino nastale celične suspenzije smo v čisti obliki uporabili za eno od možnosti presaditve na brazgotine, drugo tretjino smo gojili na biokompatibilnih domačih filmskih premazih »Polypor«, tretjo pa na petrijevkah brez substrata. Operacija dermabrazije nastalih brazgotin pri podganah s poznejšo presaditvijo podganjih epidermalnih celic nanje smo izvedli pod etrsko anestezijo z uporabo termičnega kauterja.

V prvi skupini podgan so po dermabraziji na spolirano, s fiziološko raztopino oprano in posušeno površino brazgotine nanesli sterilne koščke batista, na katere so nanesli pretreseno suspenzijo alogenskih podganjih epidermocitov v koncentraciji 1,5 milijona celic na 1 ml (po podatkih Inštituta za citologijo). Koščke batista so na spolirano brazgotino nanesli tako, da so celice ležale na površini brazgotine. Na vrh je bil nameščen povoj iz več plasti gaze, ki je bil prišit na robove brazgotine.

Del pridobljene celične suspenzije smo zasejali v petrijevke na sterilne filme Polypore, razrezane po obliki petrijevk, drugi del pa na petrijevke brez filma. Gojenje smo izvedli v gojišču FAD, ki je bilo sestavljeno iz mešanice DMEM in F12 medija v razmerju 3:1 z dodatkom 10 % fetalnega govejega seruma, 5 μg/ml insulina (Sigma), 0,5 μg/ml hidrokortizon hemisukcinata (Sigma), 10 μg/ml epidermalnega rastnega faktorja EGF (Inštitut za citologijo RAS, Sankt Peterburg). Druga in tretja skupina podgan, vsaka po 7 osebkov, sta bili operirani 6 dni po prvi. Do takrat so se iz suspenzije keratinocitov, zasejanih v petrijevke, oblikovale večplastne plasti, ki so bile presajene v podgane. Drugi skupini smo presadili epidermocite na filmu, tretji pa večplastno plast brez substrata. Po 7 dneh so bile pridobljene večplastne plasti alogenskih keratinocitov (MPALK), zasejane na filme "Polypore", kot kultura presadjene neposredno na površino rane. Na vrhu je bila folija, da se ne bi odtrgala, pritrjena z večplastnim gaznim povojem in prišita na kožo podgan.

Pred presaditvijo keratinocitov tretji skupini podgan, vzgojenih brez substrata, smo PAC ločili od dna petrijevke z obdelavo z dispazo, ki ima sposobnost selektivnega prekinjanja dermalno-epidermalnih vezi. Ko dispaza deluje na večplastno plast, prekine povezavo celic bazalne plasti z dnom petrijevke in ima veliko manjši vpliv na medcelične povezave, kar omogoča popolno "odstranitev" plasti. Ločitev večplastne celične plasti z dispazo je bila izvedena na naslednji način. Transportni medij smo odcedili iz petrijevk, celične plasti pa smo trikrat sprali s hranilnim medijem, ki je vseboval antibiotike, zlasti gentamicin (0,2 mg/ml). Večplastne plasti smo napolnili z 0,125 % raztopino dispaze ("Sigma") in jih postavili v termostat, kjer smo jih inkubirali pri t=37°C 20–30 minut. Pojav belega roba, ki se lušči vzdolž oboda plasti, je pokazatelj začetka procesa njenega ločevanja od robov in dna petrijevke. Nekaj minut po začetku procesa ločevanja smo raztopino dispaze odcedili, epitelijske plasti pa 2-3-krat sprali z medijem. Na površino epidermalne plasti smo nanesli košček sterilne obloge za rane "Lita-color", razrezan na velikost skodelice, na katero smo prilepili plast, ločeno z dispazo, ki smo jo z lopatico dodatno odlepili z dna skodelice. S pinceto za oči smo plast skupaj s premazom prtička "Lita-color" (Rusija) odtrgali z dna petrijevke in jo previdno prenesli na pripravljeno površino brazgotine. Prtički "Lita-color" vsebujejo gentamicin in eksolin (ekstrakt kolagena), ki sta po navlaženju z ostanki rastnega medija in nato s fiziološko raztopino nabreknila in postala sodobna obloga za rane, ki zagotavlja dobro zaščito pred zunanjo okužbo in hitro celjenje zaradi strukture, ki absorbira vlago.

Na folije Polypore in prtičke Lita-color so bili naneseni večplastni gazni povoji ter prišiti na kožo podgan za močnejšo fiksacijo. Vsaka podgana je bila nameščena v ločeno kletko, da bi ustvarili optimalne pogoje za njeno vzdrževanje in prijetje presajenih keratinocitov. Povoji podgan, na katere so bili presajeni suspenzija in večplastna plast epidermocitiv, odstranjenih z dispazo, so bili večkrat na dan navlaženi s sterilno fiziološko raztopino, da bi ustvarili najugodnejše pogoje za prijetje celic. Glede na to, da je bila folija Polypore neprepustna za vodo, povoji podgan v drugi skupini niso bili navlaženi, kar je bila ena od prednosti pred presaditvami brez folij. Povoji so bili odstranjeni po 10 dneh. Klinična slika brazgotin po presaditvi celic se je malo razlikovala od brazgotin brez presaditve, razen po bolj rožnati barvi (zaradi dermabrazije) in večjem luščenju. To dejstvo kaže na to, da takoj po tem, ko so povoji z rane odpadli skupaj z MPC, v brazgotini ni prišlo do sprememb.

Odvzem biopsijskega materiala pri podganah.

Po 1, 2, 5 in 9 mesecih po presaditvi alogenskih keratinocitov podgan na polirane brazgotine belih podgan je bil odvzet material za histološko, citomorfološko in elektronsko mikroskopsko preiskavo. Za kontrolo so bili odvzeti vzorci normalne kože podgan in brazgotine brez presaditve celic. Anestezija podgan je bila izvedena z etrsko anestezijo.

Po anesteziji so bili z označenih mest odvzeti koščki brazgotinskega tkiva, na katere so bili s pomočjo biopsijskega prebijala premera 2 mm presadjeni keratinociti in postavljeni v 2,5 % raztopino glutaraldehida za pripravo materiala za elektronsko mikroskopsko preiskavo. Koščki tkiva, odvzeti za histološko preiskavo, so bili postavljeni v 10 % nevtralno raztopino formalina, nato so bili prepuščeni skozi alkohole in vgrajeni v parafin, nato pa so bili narezani ultra tanki rezi in si jih ogledali v svetlobno-optičnem mikroskopu.

Kontrolna skupina I. Normalna koža podgan.

Da bi videli razliko med mikroskopsko sliko normalne brazgotinsko spremenjene kože podgan in brazgotinami v določenih obdobjih po presaditvi MPC, so v vseh fazah te študije prikazane fotografije in opisi brazgotin.

Epidermis normalne kože je sestavljen iz 7-9 plasti celic. Rožena plast je zmerne debeline. Ponekod jo sestavlja 6-8 plasti pohotnih lusk. Bazalno plast predstavljajo valjaste celice z velikimi, svetlimi, pravilnimi jedri in več nukleoli. Desmosomske povezave med celicami in z bazalno membrano so jasno izražene. Pod dobro definirano bazalno membrano, ki ima v subepidermalni plasti majhne izrastke, vzporedno z njo ležijo nežni snopi kolagenskih in elastinskih vlaken, med katerimi so podolgovati fibroblasti in majhne žile. V globljih plasteh ležijo snopi kolagenskih in elastinskih vlaken v različnih smereh. Med njimi je veliko žil s tankimi stenami enakega kalibra, celični elementi (fibroblasti, mastociti, levkociti). Veliko število lasnih mešičkov in lojnic.

Kontrola 2. Brazgotina podgane, stara 2 meseca.

Klinična slika. Brazgotine so bledo rožnate barve, luščijo se, ponekod ostanejo skorje. Njihova površina se je zaradi krčenja kolagenskih vlaken zmanjšala in je postala približno 3,0-3,5 cm ^. Kožni priveski so odsotni.

Mikroskopska slika. Epidermis sestavlja 3-5 plasti celic, nagubanih, predstavljenih z zaobljenimi bazalnimi celicami, eno vrsto subulatnih, 1-2 vrsti zrnatih s keratohialinskimi zrni v zgornji plasti, obstajajo območja znotrajceličnega edema. Stratum corneum je neenakomerno spremenjen od zelo tanke do odebeljene. Opaženo je gubanje brazgotine zaradi (krčenja) brazgotinskega tkiva. Gube prodrejo do papilarne plasti in ustvarjajo vtis papil. Meja med epidermisom in dermisom je ravna črta. Bazalna membrana ni povsod zasledljiva. V spodnjem delu subepidermalne in globljih plasteh so žile z debelo, zrahljano steno, mnoge so zapuščene, s stazo. Okoli žil je kopičenje makrofagov, fibroblastov. Makrofagi obdajajo eritrocite, ki se sproščajo iz kapilar, in jih fagocitirajo. V bolj površinskih plasteh so majhne kapilare. Pod epidermisom so kolagena vlakna rahlo razporejena. V globlji plasti brazgotine so grobi snopi kolagenskih vlaken, med katerimi je veliko fibroblastov.

Brazgotina podgane en mesec po presaditvi podganjih keratinocitov.

Klinična slika. Brazgotine so rožnate barve, njihova površina se je zmanjšala, zlasti v premeru, in je v povprečju 2,5-3 cm ^2. Lasje in lojnice so odsotne.

Podatki mikroskopskega pregleda materiala, pridobljenega od podgan s presaditvijo MPaLK na film in MPaLK brez substrata, so praktično enaki. Vendar pa je tehnično gledano delo z MPaLK brez substrata veliko bolj zapleteno in mukotrpno kot pri gojenju MPaLK na substratu, zato smo pri nadaljnjem preučevanju vprašanja presaditve keratinocitov v brazgotine kot osnovo za gojenje ("substrati") uporabili večplastni cambric.

Mikroskopska slika. Opažena je odebelitev epidermisa na 15-20 plasti, skoraj do sredine katere imajo keratinociti ozko, podolgovato, navpično obliko in kompaktno razporeditev. Bazalne celice so razporejene v neenakomerni liniji. Njihova jedra so svetla, velika, zaobljena z enim ali dvema nukleoloma, kar kaže na njihovo visoko sintetično in proliferativno aktivnost. Meja med epidermisom in dermisom je ravna črta. Trnasta plast je dobro razvita, sestavljena je iz 3-5 plasti zaobljenih celic, prisotni sta 2 nukleolarni celici.

Takoj pod bazalno membrano so gosto razporejeni tanki snopi kolagenskih vlaken, vzporedno z njimi je veliko število zapuščenih žil, globlja kolagena vlakna so bolj groba, zbrana v goste snope. Veliko je velikih fibroblastov, mastocitov (2-3 v vidnem polju), makrofagov, levkocitov in zapuščenih žil, katerih stene so zrahljane, okoli njih so rahlo razporejena kolagena vlakna. V nekaterih žilah je staza, diapedeza oblikovanih elementov. Okoli žil so fibroblasti, posamezni limfociti. Kožni priveski so odsotni.

Pri presaditvi suspenzije keratinocitov na spolirano brazgotino se mikroskopska slika razlikuje od prejšnje. Pri večini živali je epidermis tanek in sestavljen iz 5-6 plasti celic. Spodnja plast je sestavljena iz celic nepravilne, poligonalne oblike z jedri okroglo-nepravilne oblike. Stanje subepidermalne plasti je podobno kot v skupini živali brez presaditve MPALK.

V tem primeru lahko govorimo bodisi o zamudi v procesih, ki spremljajo presaditev celic, bodisi o veliki izgubi celic, presajenih v obliki suspenzije. Zato je bil sklepan o neprimernosti korekcije brazgotin s presaditvijo keratinocitov v obliki suspenzije.

Brazgotina podgane 2 meseca po presaditvi podganjih keratinocitov.

Klinična slika. Brazgotina je videti tanka in nežna. Ponekod se opazijo luščenje in luskaste lise.

Mikroskopska slika. Rožena plast je odebeljena, ponekod hiperkeratoza. Epidermis je odebeljen, sestavljen iz 12-20 vrst celic. Meja med epidermisom in dermisom je ravna črta. Nežna kolagena vlakna pod epidermisom ležijo precej gosto. V globljih plasteh brazgotine so zbrana v velikih grobih snopih. V subepidermalni plasti se pojavijo nove žilne tvorbe. V spodnjih plasteh brazgotinskega tkiva je veliko zapuščenih žil, ki se nahajajo vzporedno s površino epidermisa. Veliki fibroblasti so enakomerno razporejeni v debelini brazgotine, prisotni so velikanski, večrazvejani makrofagi.

Brazgotina podgane 5 mesecev po presaditvi epidermalnih celic podgane.

Klinična slika. Brazgotina je videti enakomerna, gladka, brez luščenja, prisotne so posamezne dlake, njihova gostota je večja na obodu brazgotin, kar kaže na mejno vraščanje lasnih mešičkov v brazgotino in nastanek novih lasnih mešičkov. Površina brazgotin se še naprej zmanjšuje.

Mikroskopska slika. Epidermis je še vedno debel (15-20 plasti, ponekod do 30), v zgornjih plasteh je napolnjen z zrnci keratohialina. Jasno je vidna bazalna membrana. Pod njo ležijo kolagena vlakna ohlapno. V spodnjih plasteh je kolagen močnejši in gosto zbit. Med kolagenskimi snopi je veliko kapilar. V zgornjih plasteh se je število zapuščenih žil zmanjšalo. Stičišče epidermisa in dermisa je rahlo valovito. Ponekod so v brazgotinskem tkivu globoki epidermalni izrastki. Med kolagenskimi vlakni so vidne novo nastale žile. Pojavijo se posamezni lasni mešički in lojnice.

Brazgotina podgane 9 mesecev po presaditvi epidermalnih MPA celic podgane.

Klinična slika. Brazgotine so v primerjavi s prejšnjimi obdobji postale bistveno manjše, njihova površina je v povprečju približno 1,5-2,0 cm2 ^. Brazgotine so neenakomerno prekrite z drobnimi dlačicami, zlasti na obrobju. Ostaja manjše drobno ploščato luščenje.

Mikroskopska slika.

Epidermis je postal tanjša, predstavljen je s 6-8 vrstami celic, po strukturi spominja na epidermis normalne kože podgan, le gostota celic je za 1 mm višja in so manjše. Bazalna plast je sestavljena iz majhnih okroglo-valjastih celic. Bazalna membrana je dobro izražena, hemidesmosomi so jasno vidni. Opažena je prisotnost epidermalnih izrastkov v subepidermalni plasti. Papilarna plast je izražena vzdolž celotne dolžine brazgotine. Ta dejstva kažejo, da je do takrat adhezija presajenih keratinocitov s spodaj ležečim brazgotinskim tkivom postala veliko močnejša. Zato je lahko oskrba brazgotine pri ljudeh s presaditvijo MPALK 9 mesecev po presaditvi MPC tradicionalna. Pod epidermisom so kolagena vlakna bolj občutljiva kot v globljih plasteh. Pojavilo se je veliko žil, zlasti površinskih. Stene večjih žil so odebeljene. Lasni mešički in lojnice so v velikih količinah. Mikroskopska slika spominja na tkivo, podobno dermisu.

Rezultati eksperimentalnega dela in njihova razprava.

V okviru tega dela so bili keratinociti v različnih oblikah presajeni na umetno ustvarjene brazgotine na koži podgan po operaciji dermabrazije - na obloge za rane, kot suspenzija na batistem in kot večplastna plast brez substrata. Delo je bilo izvedeno z namenom pridobitve morfoloških podatkov o učinku presajenih alogenskih keratinocitov na brazgotine ter določitve optimalnih možnosti presaditve.

Ugotovljeno je bilo, da so vse tri metode presaditve izvedljive, vendar je presaditev MPAC brez substrata zelo delovno intenziven postopek, med katerim se MPAC lahko poškoduje, kar vpliva na rezultate presaditve. Poleg tega ta metoda presaditve izključuje delo na velikih površinah.

Presaditev suspenzije keratinocitov je veliko bolj stroškovno učinkovita metoda, ne zahteva dolgotrajne gojenja celic in je v različici, ki jo predlagamo, preprosta z uporabo sterilnih cambricnih praznih vzorcev, katerih velikosti ustrezajo velikosti brazgotin. Zakasnitev terapevtskega učinka pri presaditvi celične suspenzije za približno en mesec v primerjavi z MPC na prevleko za rane ni pomembna točka pri trajanju zdravljenja več mesecev. Znano je, da se pri presaditvi MPC bolnikom z opeklinami preobrazba strukture kože dogaja postopoma in več let. Presaditev kulture keratinocitov na prevleke za rane je najprimernejša in obetavna metoda, a tudi bistveno dražja. Poleg tega trenutno zahteva iskanje naprednejših možnosti prevlek, ki bi morale biti fleksibilne, higroskopske, imeti bakteriostatične ali baktericidne lastnosti in biti biološko nevtralne za celice. Film "Polypor" - vmesna različica domače filmske prevleke za rane, nam je kljub nekaterim nepopolnostim omogočila, da smo v poskusu preučili presaditev podganjih keratinocitov na brazgotine in sklepali o učinkovitosti te smeri zdravljenja brazgotin.

Avtorji, ki so presadili MPC na opeklinske rane, so ugotovili, da se je v prvem tednu po presaditvi večplastne plasti keratinocitov na sanirane rane epidermis odebelil in stratificiral. Vse plasti epidermisa so bile jasno vidne. Zanimivo je, da je bilo število celičnih plasti v presadkih za 10–30 % večje kot v biopsijah kože. Avtorji so opazili pojav keratohialinskih granul 5. dan po presaditvi MPC, bazalne membrane in hemidesmosomov pa že 3. dan.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) so ugotovili, da je v zgodnjih fazah po presaditvi MPC bolnikom s popolnimi kožnimi defekti po opeklinah povezava med dermisom in epidermisom zelo šibka in poteka v ravni črti, papilarna plast pa je odsotna. Do konca drugega meseca se začnejo oblikovati plitve papile in kožni priveski, povezava med dermisom in epidermisom pa postane močnejša. Podatki iz literature kažejo, da je presaditev alogenskih keratinocitov na rane pri bolnikih z opeklinami obetavna metoda. Kljub temu, da zavrnitev alogenskih keratinocitov po mnenju različnih avtorjev poteka v 10 dneh do 3 mesecih, ti kljub temu igrajo svojo vlogo pri celjenju površine rane, izločanju rastnih faktorjev in mehanskem zapiranju defekta. Domneva se, da imajo MPALC zmanjšano antigensko aktivnost, saj med gojenjem in vitro izgubijo Langerhansove celice, kar jim omogoča dolgotrajen obstoj v telesu prejemnika. Poleg tega ima alogenska kultura, pridobljena iz kože mladih zdravih ljudi, neprimerljivo večji biološki potencial kot avtologna kultura bolnikov po poškodbi.

Glavni cilj naše študije je bil ugotoviti, ali se bodo alogenski keratinociti ukoreninili na brazgotinah in kakšne spremembe se bodo zgodile v brazgotinskem tkivu pod vplivom takšne biološko aktivne "prevleke za rane". V primeru pozitivnega rezultata razviti najučinkovitejšo in najmanj delovno intenzivno tehnologijo za to področje rehabilitacijske medicine.

Podatki, ki smo jih pridobili, so bili v marsičem podobni podatkom iz literature o morfoloških spremembah, ki se pojavljajo v človeški povrhnjici po presaditvi alogenskih keratinocitov na opeklinske rane. Vendar pa obstajajo tudi pomembne razlike, tako glede morfološkega substrata, na katerega se presaditev izvede, kot tudi glede tehnologije. Tako se proces nastanka bazalne membrane in dermalno-epidermalnih povezav (hemidesmosomi, papile) pojavi pozneje v primerjavi s presaditvijo keratinocitov na rane brez brazgotinskih sprememb. Očitno se to zgodi zaradi slabše prehranjenosti brazgotinskega tkiva v primerjavi z dermisom ali mišično fascijo. Brazgotina, zlasti stara, je gosto vezivno tkivo z zelo majhnim številom žil, medtem ko je dno opeklinske rane granulacijsko tkivo, bogato s žilami. Tako je očitno, da so pogoji, v katerih poteka presaditev in vcepitev keratinocitov, popolnoma drugačni. Bolj ko je območje presaditve celic prekrvavljeno, lažji je proces njihove vcepitve. Iz tega postulata sledi sklep o prednosti dela z mladimi brazgotinami, pri katerih je vezivno tkivo še precej ohlapno in bogato s žilami.

Kot rezultat tega eksperimentalnega dela je bilo dokazano, da:

1. Presaditev MPALK na brazgotine je možna.
2. Optimalna metoda presaditve je presaditev keratinocitov na rano.
3. Površino brazgotine je treba spolirati s kirurško lasersko dermabrazijo ali Schumannovim rezalnikom.
4. Pod vplivom MPALK pride do hitre epitelizacije polirane površine brazgotine.
5. Bolj ko je brazgotinsko tkivo prekrvavljeno, torej mlajša kot je brazgotina, boljši so rezultati presaditve keratinocitov.
6. Pod vplivom presajenih keratinocitov se brazgotinsko tkivo postopoma preoblikuje in spremeni v dermalno tkivo (bolj ohlapno brazgotinsko tkivo s kožnimi izrastki).
7. Postopno rahljanje brazgotinskega tkiva, začenši s subepidermalno plastjo. Izboljša se njegova vaskularizacija, snopi kolagenskih vlaken v zgornjem in spodnjem delu brazgotine so razporejeni bolj ohlapno kot v brazgotinskem tkivu brez presaditve celic. Pojavijo se lasni mešički in lojnice. Epidermis se po svoji strukturi, potem ko je prešel fazo hipertrofije, približa epidermisu normalne kože.
8. Opažene spremembe so povezane z rastnimi faktorji in citokini, ki jih izločajo keratinociti in ki z izboljšanjem trofizma brazgotinskega tkiva spodbujajo njegovo preobrazbo iz grobega vlaknatega tkiva v bolj ohlapno tkivo, kar vodi do izboljšanja videza brazgotine.

Na podlagi te študije lahko torej sklepamo, da imajo presajeni keratinociti koristen učinek na brazgotinsko tkivo, kar ima lahko praktične posledice za rehabilitacijo bolnikov z različnimi vrstami brazgotin.

To delo na podganah nam je omogočilo tudi oblikovanje zahtev za obloge za rane, na katerih gojijo keratinocite.

Obloge za rane morajo biti:

• biokompatibilen s celicami,
• zračna,
• imajo elastično, oblikovno podlago,
• biti hidrofilen,
• kot zdravilni dodatki vsebujejo antibakterijska zdravila in antioksidante, ki niso strupeni za gojene celice.

Klinični rezultati biotehnološkega zdravljenja brazgotin.

Pred tem sta N. Carver in sodelavci (1993) ugotovila, da okluzivni povoji najbolje spodbujajo pritrditev na rano in preživetje keratinocitov, vendar ne omogočajo nastanka stratificirane (zrele) povrhnjice. Za nastanek stratificirane povrhnjice je potrebno zračno okolje. Zato je bilo po pritrditvi večplastne plasti predlagano, da se okluzivni povoj za rane po 7–10 dneh odstrani in rane zdravijo s suhimi povoji ali vodotopnimi mazili. Lahko rečemo, da sta kakovost in lastnosti »substrata«, na katerem gojijo celice, zelo pomembna točka za učinkovitost presaditve celičnega materiala in s tem za rezultate dela zdravnikov. Vendar pa danes ni idealnega povoja za rane, kljub obilici predlaganih možnosti (umetna koža, netkana tkanina iz karboksimetilceluloze, fibrinski premazi, polprepustne poliuretanske folije). Pomembna točka pri tej zadevi so stroški »substratov« (posebnih prevlek za rane), saj njihova visoka cena povečuje skupne stroške biotehnološkega zdravljenja.

Učinkovitost celičnih tehnologij je bila do danes dokazana, vendar so te tehnologije žal zelo drage, zlasti v državah, kjer industrijska proizvodnja celičnih sestavkov še ni vzpostavljena. Vendar pa so države, kot so Združene države Amerike, že dolgo vzpostavile industrijo za proizvodnjo celičnega materiala za presaditev opeklin. Predvsem podjetje BioSurface Technology Inc. je od leta 1989 vzgojilo 37.000 večplastnih plasti keratinocitov, ki so bile uporabljene za zdravljenje 240 bolnikov v 79 državah po svetu (R. Odessey, 1992), medtem ko 1 cm2 ^celične kulture stane približno 7-8 ameriških dolarjev.

Tehnologija zdravljenja različnih kožnih bolezni in težav ima številne razlike, vendar vsako celično zdravljenje temelji na pridobivanju visokokakovostnega celičnega materiala in njegovi presaditvi.

Ta postopek je sestavljen iz naslednjih korakov:

• odvzem kože žrtvam (ali darovalcem),
• prevoz kožnih loput v biotehnološki center,
• izolacija celic bazalne plasti in njihova proliferacija,
• rast večplastnih plasti keratinocitov (MLK).
• presaditev celične kulture.

Glavna težava pri izvajanju zdravljenja s presaditvijo večplastnih keratinocitnih plošč je potreba po živih celicah v vseh fazah presaditve celic. Koščki kože za izolacijo avtolognih ali alogenskih celic morajo biti čim tanjši, saj jih je v tem primeru lažje ločiti z mehanskimi in encimskimi metodami ter dobiti suspenzijo živih celic za gojenje. Pridobimo jih lahko z rezanjem z dermatomom ali z uporabo kože vek, kožice in notranje površine rame. Glede na to, da so celice občutljive na halogene (klor, jod) in vodikov peroksid, jih ni mogoče uporabiti pri obdelavi kože med odvzemom materiala.

Kvantitativni in kvalitativni izkoristek celic iz kožnih presadkov ter učinkovitost njihove gojenja sta odvisna tudi od zdravja in starosti darovalca. Poleg tega je treba biopsije kože čim hitreje in v ustreznih pogojih (okolje, temperatura) dostaviti v laboratorij, ki je za te namene certificiran in akreditiran.

Za shranjevanje in transport kožnih loput se lahko uporabi Eagleov medij ali medij 199 z dodatkom 10 % govejega seruma, medij DMEM z dodatkom 5 % fetalnega govejega seruma in antibiotikov.

V citološkem laboratoriju se biopsija kože najprej mehansko razdeli na majhne koščke, nato pa se koščki kože obdelajo z encimi: tripsinom, kolagenazo, dispazo itd.

Pod delovanjem encimov se desmosomi uničijo in keratinociti se sprostijo v medij v obliki posameznih celic ali agregatov, ki so sestavljeni iz različnega števila celic. Za gojenje se uporabljajo le bazalni keratinociti, ki se gojijo na posebnih gojiščih v termostatih, ki vsebujejo 5 % CO2, v petrijevkah ali bučkah pri t = 37 °C. Že po 48 urah opazimo nastanek kolonij keratinocitov, ki se postopoma združijo in se spremenijo v monosloj. Po prejemu zadostnega števila celic se nastala suspenzija zaseje na za ta namen pripravljene obloge za rane in se namesti v petrijevke. Iz suspenzije se najprej oblikuje monosloj in nato večslojni sloj keratinocitov. Faze procesa gojenja keratinocitov so shematsko prikazane na sliki 12 (33,43,54,65).

Nastanek večplastne plasti keratinocitov, primerne za presaditev, običajno traja 7–10 dni. Včasih je to obdobje daljše, kar je odvisno od kakovosti izvornega materiala (starost, zdravstveno stanje darovalca, pravilnost odvzema materiala, kakovost uporabljenega gojišča itd.). Če večplastna plast preraste, se na njeni površini lahko pojavijo celice s pojavi apoptoze, ki niso primerne za presaditev. Petrijevke z večplastnimi plastmi keratinocitov (MLK), vzgojenimi v njih na oblogah za rane, se v kliniko dostavijo v posebnih posodah pri temperaturi najmanj +15 °C.

Spremenjena Greenova metoda za gojenje MPC

V našem delu smo kot prevleko za rane uporabili večplastni batist, pri čemer smo opustili folije "Polypor", s katerimi smo začeli delati v poskusu s podganami. Tako smo na predhodno razmaščenem in sterilnem batistu vzgojili večplastne plasti keratinocitov, čeprav tudi to ni optimalna prevleka za rane.

Klinične študije so bile izvedene na prostovoljcih v skladu s potrebnimi etičnimi standardi: podpisom sporazuma in informiranim soglasjem.

1. Uporabljena je bila kultura pacientovih lastnih (avtolognih) in shranjenih (alogenih) keratinocitov.
2. Pacientovi lastni keratinociti so bili pridobljeni iz koščka kože, izrezanega z notranje strani njihovih nadlakti.
3. Operacija dermabrazije brazgotin je bila izvedena s termokavterizacijo, rotacijskimi diski in erbijevim laserjem.
4. Vzete so bile skupine bolnikov z normotrofičnimi, hipotrofičnimi in hipertrofičnimi brazgotinami.

Tehnološki postopek uporabe celične tehnologije za izboljšanje videza kožnih brazgotin je bil sestavljen iz naslednjih faz:

1. Izbira pacienta.
2. Pojasnila bistva zdravljenja, časovni okvir za doseganje pričakovanih rezultatov, podpis pogodbe in informirana privolitev.
3. Bolnikom predpišite 2-3 tedne pred operacijo selmevit 1 tableto 3-krat na dan, cinqueteral 1 tableto 3-krat na dan.
4. Odvzem koščka kože, dolgega 2,0 cm in širokega 0,7-1,0 cm, z notranje površine rame, visoko, skoraj v spodnjem delu aksilarne regije, za pridobitev avtolognih keratinocitov.
5. V primerih, ko so pacienti zaradi možnosti linearne brazgotine na notranji površini rame zavrnili izolacijo lastnih keratinocitov, so celični material odvzeli iz celične banke (alogenski keratinociti).
6. Keratinocite smo izolirali in gojili v laboratoriju, certificiranem za tovrstno delo.
7. Po pridobitvi zadostne količine MPC za presaditev na brazgotine je bil določen dan za operacijo na kliniki, kamor so material prinesli v posebnih posodah v petrijevkah.
8. Izvedena je bila operacija dermabrazije brazgotine, hemostaza, polirana površina je bila oprana s sterilno fiziološko raztopino, posušena, nakar so bile nanjo na sterilni kambrični "celice navzdol" presadjene MPC. To pomeni, da so se celice, ki so bile zgoraj v MPC, izkazale za spodnje, ob polirani površini.
9. Na vrh je bila nanesena sterilna folija, ki je bila pritrjena na kožo z elastičnim povojem ali elastičnim obližem Omnifix. Namesto folije se lahko uporabijo indiferentni povoji za rane, ki vsebujejo silikon, na primer Mepitel, Mepiform, silikonske gelske obloge.

Po 5-7 dneh se film ali silikonski premaz odstrani. Do takrat bi se morali vsi keratinociti splaziti po spolirani brazgotini in se pritrditi na njeno površino.

10. Vlažno okolje, ki nastane pod filmom in silikonsko prevleko, k temu aktivno prispeva. Kambrik, ki od te točke naprej ostane na brazgotini, lahko prepojimo s kuriozinom ali hitosan gelom. Posledično se drugi dan ustvari gosta skorja, ki jo je za udobje pacienta najbolje pritrditi z elastičnim, zračnim obližem, kot je Omnifix. Zračna skorja omogoča, da se oblikovana povrhnjica diferencira in spremeni v zrelo.

Glede na vrsto brazgotine in globino brušenja se povoj po 8–10 dneh zavrže. V tem času ima povrhnjica 30–40 % več celičnih plasti kot v normalni koži. Bazalna membrana ni oblikovana. Keratinociti odebeljene povrhnjice izločajo veliko biološko aktivnih molekul v brazgotinsko tkivo.

Uspeh biotehnološkega zdravljenja brazgotin je v veliki meri odvisen od načina oskrbe v pooperativnem obdobju. Celične kulture so "nežna" vrsta prevleke za rane in v zgodnjih fazah po presaditvi se IPC-ji zlahka odlepijo od spodaj ležečih tkiv. Zato bolnikom svetujemo, da po operaciji z brazgotino ravnajo previdno. 8-9 mesecev je ne drgnite in jo nežno zdravite s hladno prekuhano vodo, da se izognete trganju tanke, novo nastale povrhnjice, ki nima tesne vezi s spodaj ležečimi tkivi.

Opomba.

Pred operacijo in med dermabrazijo je dovoljena uporaba halogeniranih antiseptikov in oksidantov (jodopiron, suliodopiron, jodinol, jodinat, klorheksidin, vodikov peroksid), pred presaditvijo celic pa je zaradi njihovega citotoksičnega učinka strogo kontraindicirana. Metilensko modro in briljantno zeleno sta prav tako strupena za celice.

Da bi se izognili okužbi, zlasti pri delu s hipertrofičnimi brazgotinami, lahko kirurško polje zdravimo z neomicin sulfatom, polimiksinom ali gentamicinom. Nimajo citotoksičnega učinka na keratinocite.

Zaradi takšnega zdravljenja se doseže trojni učinek.

1. Izravnavanje površine brazgotine.
2. Nastanek plasti nove povrhnjice normalne debeline nad njo.
3. Preobrazba brazgotinskega tkiva v tkivo, podobno dermi, zaradi delovanja citokinov, rastnih faktorjev in drugih biološko aktivnih molekul, ki jih izločajo presajene celice in jih stimulirajo keratinociti, fibroblasti in makrofagi.

Brazgotina postane manj opazna, bolj elastična, v njej se pojavijo pore in vellus dlake, pigmentacija pa se lahko obnovi zaradi prisotnosti melanocitov v IPC.

Vendar pa se vsi ti pozitivni vidiki brazgotine ne pojavijo takoj. V zvezi s tem je treba paciente opozoriti, da proces preobrazbe brazgotinskega tkiva v dermalno tkivo poteka počasi in da optimalni rezultat takšnega zdravljenja ni mogoče pričakovati prej kot v 10–14 mesecih. Takoj po zavrnitvi oblog imajo polirane površine izrazito polikromijo, svetlejša kot je, globlje je bilo poliranje. Najmanj poškodb kože opazimo pri poliranju normotrofičnih brazgotin z erbijevim laserjem. Barva brazgotin in okoliške kože se je obnovila v 3 do 8 tednih. Kljub takim previdnostnim ukrepom se včasih pojavi pooperativna hiperpigmentacija, ki lahko sama od sebe izgine v nekaj mesecih.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]