Komarji z vgrajenim "genetskim ščitom" ustavijo malarijo - stopnja okužb se zmanjša za 93 %

Premagovanje odpornosti na insekticide: Kako se ena sama genska modifikacija pri komarjih samorazmnožuje skozi generacije in praktično odpravlja prenos malarije, ne da bi pri tem ogrozila preživetje.

V nedavno objavljeni študiji v reviji Nature je skupina znanstvenikov preučila, ali alel glutamina 224 (Q224) v proteinu FREP1 (fibrinogen-related protein 1) povzroča odpornost komarjev vrste Anopheles stephensi na okužbo s plazmodijem, ocenila stroške preživetja, povezane s tem alelom, in preizkusila sistem alelnega genskega pogona za širjenje te zaščitne mutacije skozi populacije.

Predpogoji

Leta 2023 je zaradi malarije umrlo približno 600.000 ljudi, večinoma otrok v podsaharski Afriki in Južni Aziji. Tradicionalne metode zatiranja – mreže proti komarjem, insekticidi, zdravila proti malariji – izgubljajo svojo učinkovitost zaradi odpornosti komarjev in parazitov. Tehnologije genskega pogona, ki širijo koristne alele prek populacij komarjev, ponujajo obetavno in trajnostno rešitev.

Beljakovina FREP1 pomaga parazitom prečkati komarjevo srednje črevo, naravna varianta Q224 pa lahko prepreči okužbo, ne da bi pri tem ogrozila biologijo komarja. Cilj je bil preizkusiti, ali bi se tak endogeni alel lahko varno razširil, da bi zmanjšal prenos malarije, hkrati pa ohranil sposobnost preživetja komarja.

O študiji

Z uporabo CRISPR/Cas9 sta bila ustvarjena dva seva Anopheles stephensi, ki sta se razlikovala le v 224. aminokislini v proteinu FREP1: divji tip z levcinom (L224) in potencialno zaščitni sev z glutaminom (Q224). Vodilna RNA je ciljala na intronsko regijo 126 bp pred kodonom, kar je omogočilo homologno rekombinacijo z vstavitvijo fluorescentne oznake (GFP ali RFP).

Kondicijsko pripravljenost so ocenjevali glede na dolžino kril, plodnost, valilnost jajčec, mladice, izleganje odraslih osebkov in življenjsko dobo (Kaplan-Meierjeva analiza preživetja).

Kompetentnost vektorjev je bila določena z uporabo standardnega membranskega hranjenja parazitov Plasmodium falciparum (človek) in Plasmodium berghei (glodalec), s štetjem oocist in sporozoitov v slinavkah.

Sistem alelnega pogona je vključeval kaseto z gRNA proti L224 in Cas9 pod nadzorom promotorja vasa. Frekvence alelov so bile spremljane z uporabo fluorescentnih oznak v večcikličnih poskusih (10 generacij). Genotipizacija je bila izvedena s PCR, Sangerjevim sekvenciranjem in NGS. Bayesovo modeliranje je ocenilo konverzijo alelov, stroške primernosti in dinamiko med prostim parjenjem v laboratoriju.

Rezultati

Alel FREP1Q224 ni povzročil znatnih izgub v preživetju: dolžina kril, plodnost, izvalitev, puljenje in pojav odraslih osebkov so bili enaki kontrolni skupini FREP1L224. Majhne razlike v velikosti in življenjski dobi samcev niso vplivale na konkurenčnost. Neobdelane samice FREP1Q224 so živele tako dolgo kot kontrolne samice, samice po hranjenju s krvjo pa so pokazale le rahlo skrajšanje življenjske dobe.

Izzivni poskusi so pokazali izrazito zaščito pri homozigotih.

• Pri nizkih koncentracijah gametocitov P. falciparum (0,08 %):
  • Stopnja okužb se je v študiji FREP1Q224 zmanjšala z 80 % na ~30 %;
  • Povprečno število oocist: od 3 do 0;
  • Sporozoiti v slinastih žlezah: od >4000 do 0.
• Pri višji gametocitemiji (0,15 %):
  • Povprečno število oocist: od ~32 do
  • Tudi število sporozoitov se je dramatično zmanjšalo.
• Za P. berghei:
  • Povprečno število oocist: od 43 do 25;
  • Sporozoiti: od ~19.000 do 11.000.
• Heterozigoti (FREP1L224/Q224) niso bili zaščiteni.

Učinkovitost genskega pogona

• V parnih križanjih je Cas9 + gRNA L224 pretvorila 50 do 86 % alelov FREP1L224 v FREP1Q224;
• Pri materinem Cas9 je bila pogostost višja;
• V drugi generaciji je pogostost zaščitnega alela dosegla 93 %;
• Incidenca napak v poti popravljanja NHEJ je bila nizka (0–12 %) in je običajno povzročila poškodbe.
• V celičnih populacijah z razmerjem donor:prejemnik 1:3 se je pogostost FREP1Q224 v 10 generacijah povečala s 25 % na > 90 %;
• Pogostost alelov NHEJ se je zmanjšala s 5,4 % na

Bayesovo modeliranje je podprlo hipotezo o visoki konverziji, nizki frekvenci stabilnih mutacij in učinku smrtonosnega sterilnega mozaicizma, kjer so homozigoti WT z materinim genotipom Cas9 trpeli zaradi somatskih mutacij in zmanjšanega preživetja.

Kasnejše generacije so pokazale skoraj popolno zatiranje oocist P. falciparum (mediana 0 do 5,5), kar potrjuje, da je populacija postala v veliki meri odporna na prenos parazitov.

Zaščitni alel ni imel skritih koristi ali stranskih učinkov in se je širil z nagonom.

Zaključki

Študija je pokazala, da bi lahko zamenjava ene same aminokisline v proteinu FREP1 in preusmeritev njegovega dedovanja z uporabo genskega pogona naredila Anopheles stephensi praktično imun na malarijo – tako človeško kot glodavsko – ne da bi pri tem ogrozila sposobnost preživetja komarjev.

Ta pristop dopolnjuje obstoječe ukrepe (mreže, insekticide, zdravila), katerih učinkovitost se zmanjša zaradi odpornosti. Tak sistem se lahko uporabi tudi za obnovitev občutljivosti na insekticide ali vnos drugih zaščitnih alelov.

Preden se tehnologija lahko uvede, so potrebni strogi okoljski, etični in upravljavski okviri ter sistemi za nadzor razširjanja.