Nevirusno gensko zdravljenje ponuja upanje za kronično bolečino v križu

V nedavni študiji, objavljeni v reviji Biomaterials, so raziskovalci razvili novo nevirusno gensko terapijo za zdravljenje diskogenih bolečin v hrbtu (DBP) z vnosom transkripcijskega faktorja Forkhead Box F1 (FOXF1) z uporabo inženirsko izdelanih zunajceličnih veziklov (eEV) v degenerativne medvretenčne ploščice (IVD) in vivo.

Kronična bolečina v križu (LBP) je vse večji svetovni problem zaradi starajočega se prebivalstva in vse hujših težav z opioidi. Trenutna zdravljenja vključujejo kratkotrajno olajšanje ali drage operacije, kar poudarja potrebo po terapijah, ki ne povzročajo odvisnosti in so manj invazivne.

Trenutni biološki pristopi, vključno z dajanjem rastnih faktorjev, celično terapijo in virusno gensko terapijo, lahko zmanjšajo degeneracijo v živalskih in človeških modelih. Vendar pa lahko težave, kot so kratkoročni učinki, slaba dolgoročna učinkovitost ter nepotrebna imunogenost in onkogenost, ovirajo neposredno uporabo teh pristopov.

V tej študiji so raziskovalci vzpostavili nevirusno gensko terapijo za degeneracijo medvretenčnih ploščic (IVD) z uporabo FOXF1-eEV.

Raziskovalci so transficirali primarne mišje embrionalne fibroblaste (PMEF) s plazmidi, ki vsebujejo FOXF1 ali pCMV6 kot kontrolo, in okarakterizirali vzorce eEV z uporabo testa sledenja nanodelcev (NTA).

Učinkovitost nalaganja molekularnega tovora v eEV so ocenili z uporabo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) in konvencionalne PCR. Analiza Western blot je identificirala FOXF1 in EV-specifične proteine v formacijah eEV. Ekipa je uporabila plazmide, ki krepijo zgornja in spodnja polilinkerna območja, da bi določila prisotnost plazmidne DNA FOXF1 v donorskih celicah in ustvarila eEV.

Preučili so mRNA polne dolžine, proizvedeno iz plazmidne DNA v eEV in donorskih celicah.

Raziskovalci so ustvarili zunajcelične vezikle s transkripcijskimi faktorji za obnovitev delovanja tkiva in spreminjanje odzivov na bolečino v živalskem modelu DBP.

V mišjem modelu diskogene bolečine v hrbtu so identificirali EV za transport in distribucijo FOXF1 v poškodovane medvretenčne ploščice, da bi ugotovili zaviranje degeneracije medvretenčnih ploščic s strani FOXF1 eEV.

Ekipa je združila biomehansko testiranje mišjih medvretenčnih ploščic s slikanjem, spremembami zunajceličnega matriksa (ECM) in odzivi na bolečino, ocenjenimi po 12 tednih, da bi potrdila spremembe v strukturi in funkciji ter bolečino, ki jih je povzročil terapevtski poseg.

Predoperativna in pooperativna ocena bolečine je vključevala mikroračunalniško tomografijo (mikro-CT), slikanje z magnetno resonanco (MRI), mehansko testiranje, barvanje z Alcian modrim (AB) in pikrosirius rdečim (PSR), test z dimetilmetilen modrim in imunohistokemijo (IHC).

Študija je vključevala kirurško tehniko, pri kateri so raziskovalci mišim subkutano dajali buprenorfin ER za nadzor pooperativne bolečine.

Ekipa je pred operacijo in nato vsaka dva tedna od štiri do dvanajst tednov po operaciji izvedla vedenjske ocene z uporabo različnih metod, vključno s testom odprtega polja, hladno ploščo, repnim obešanjem in žičnim obešanjem.

Test odprtega polja je ocenjeval spontano aktivnost miši; testi s hladno ploščo so merili toplotno hiperalgezijo; testi repnega vzmetenja so merili aksialno bolečino; testi žične suspenzije pa so merili moč.

Dvanajst tednov po operaciji je ekipa secirala ledvene hrbtenice živali s sledenjem femoralnih živcev in arterij, da bi identificirala medvretenčne ploščice med L4 in L5, L5 in L6 ter L6 in S1 IVD. Z IVD L5/L6 so ocenili histologijo in določili vsebnost glikozaminoglikana (GAG).

FOXF1 eEV so znatno zmanjšali odzive na bolečino, hkrati pa obnovili strukturo in funkcijo medvretenčnega diska, vključno z izboljšano višino diska, hidracijo tkiva, vsebnostjo proteoglikanov in mehanskimi lastnostmi.

Študija se je osredotočila na sproščanje eEV, naloženih s FOXF1, iz primarnih fibroblastov, transficiranih s transkripcijskim faktorjem FOXF1. Kvantitativna RT PCR je pokazala znatno povečanje ravni transkriptov mRNA FOXF1 in ravni mRNA FOXF1 v polni dolžini v primerjavi s celicami, transficiranimi s pCMV6.

Terapija s FOXF1 eEV lahko zmanjša odzive na bolečino v modelu punkcije ledvene ploščice pri miših do 12 tednov. Samice miši so v skupini, zdravljeni s FOXF1, pokazale daljši čas napadov kot v poškodovani skupini, ki je trajal vsaj 12 tednov po zdravljenju.

Terapija s FOXF1 eEV je in vivo izboljšala hidracijo in višino tkiva medvretenčnega diska pri poškodovanih in degenerativnih živalih, hkrati pa je ohranila raven hidracije in intenzivnost T2-utežene slike medvretenčnega diska.

Vendar pa je ekipa opazila zmanjšanje višine diska pri poškodovanih živalih in živalih, zdravljenih s pCMV6 eEV. Pri miših, zdravljenih s FOXF1 eEV, se višina diska 12 tednov po zdravljenju ni zmanjšala. Spol ni vplival na funkcionalne izide.

FOXF1 eEV so in vivo obnovili mehansko funkcijo poškodovanih in degeneriranih medvretenčnih diskov (IVD). Pod aksialnim stresom so IVD, obdelani z FOXF1 eEV, pokazali večjo normalizirano togost NZ v primerjavi s poškodovanimi IVD.

V pogojih lezenja so poškodovani IVD pokazali povečane normalizirane premike lezenja, kar kaže na zmanjšanje normalizirane elastične togosti pri lezenju.

Rezultati kažejo, da zmanjšanje vsebnosti GAG v poškodovanih medvretenčnih diskih poveča mehansko fleksibilnost, vendar terapija z eEV preprečuje izgubo glikozaminoglikanov in posledične spremembe mehanske funkcije.

FOXF1 eEV so povzročili strukturne in funkcionalne spremembe v IVD s povečanjem ravni proteoglikana in GAG.

Rezultati študije so pokazali, da lahko eEV, naloženi z razvojnimi transkripcijskimi faktorji, zdravijo boleče bolezni sklepov, kot je DBP, tako da te transkripcijske faktorje dostavijo v degenerativne in boleče sklepe s pomočjo IVD.

Ta strategija lahko pomaga zmanjšati strukturne in funkcionalne nepravilnosti, ki jih povzroča bolezen, in uravnavati odzive na bolečino na način, specifičen za spol.

Raziskovalci so priporočili tudi uporabo razvojnih transkripcijskih faktorjev, kot je FOXF1, za premik degenerativnih NP celic v proanabolično stanje in vivo. Za določitev njihove terapevtske učinkovitosti so potrebne nadaljnje študije.