Nevirusna genska terapija ponuja upanje za kronične bolečine v križu

V nedavni študiji, objavljeni v reviji Biomaterials, so raziskovalci razvili novo nevirusno gensko terapijo za zdravljenje diskogene bolečine v hrbtu (DBP) z dovajanjem transkripcijskega faktorja Forkhead Škatla F1 (FOXF1) z uporabo inženirskih zunajceličnih veziklov (eEV) v degenerativne medvretenčne ploščice (IVD) in vivo.

Kronična bolečina v križu (LBP) je vse večji svetovni problem zaradi staranja prebivalstva in vse hujših težav z opioidi. Sedanje zdravljenje vključuje kratkotrajno olajšanje ali drage operacije, kar poudarja potrebo po terapijah, ki ne povzročajo odvisnosti in so manj invazivne.

Sedanje biološke terapije, vključno z dajanjem rastnega faktorja, celično terapijo in virusnimi genskimi terapijami, lahko zmanjšajo degeneracijo na živalskih in človeških modelih. Vendar lahko pomisleki, kot so kratkoročni učinki, slaba dolgoročna učinkovitost ter nepotrebna imunogenost in tumorigenost, preprečijo neposredno uporabo teh metod.

V tej študiji so raziskovalci vzpostavili nevirusno gensko terapijo za degeneracijo medvretenčne ploščice (IVD) z uporabo FOXF1-eEV.

Raziskovalci so transficirali primarne mišje embrionalne fibroblaste (PMEF) s plazmidom, ki je vseboval FOXF1 ali pCMV6 kot kontrolo, in okarakterizirali vzorce eEV z uporabo testa sledenja nanodelcev (NTA).

Ocenili so učinkovito nalaganje molekularnega tovora v eEV z uporabo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo s povratno transkripcijo (qRT-PCR) in običajne PCR. Western blot analiza je identificirala FOXF1 in specifične proteine EV v formacijah eEV. Ekipa je uporabila plazmide, ki izboljšajo zgornje in spodnje polilinkerske regije, da bi ugotovila prisotnost plazmidne DNK FOXF1 v donorskih celicah in ustvarila eEV.

Preiskali so mRNA polne dolžine, proizvedeno iz plazmidne DNA v eEV in donorskih celicah.

Raziskovalci so ustvarili zunajcelične vezikle s transkripcijskimi faktorji za obnovitev delovanja tkiva in spreminjanje odzivov na bolečino v živalskem modelu DBP.

Identificirali so EV za transport in distribucijo FOXF1 na poškodovane medvretenčne ploščice v mišjem modelu diskogene bolečine v hrbtu, da bi ugotovili inhibicijo FOXF1 eEV degeneracije medvretenčne ploščice.

Skupina je združila biomehansko testiranje mišjih medvretenčnih ploščic s slikanjem, spremembami zunajceličnega matriksa (ECM) in odzivi na bolečino, ocenjenimi po 12 tednih, da bi potrdila spremembe v strukturi in funkciji ter bolečino, ki jo povzroča terapevtski poseg.

Ocene bolečine pred operacijo in po zdravljenju so vključevale mikroračunalniško tomografijo (mikro-CT), slikanje z magnetno resonanco (MRI), mehanske teste, obarvanje z Alcianovo modro (AB) in pikrosiriusovo rdečo (PSR), test z dimetilmetilen modrim in imunohistokemijo (IHC) ) ).

Študija je vključevala kirurško tehniko, pri kateri so raziskovalci mišim subkutano injicirali buprenorfin ER za nadzor pooperativne bolečine.

Skupina je izvajala vedenjske ocene pred operacijo in vsaka dva tedna od štirih do dvanajstih tednov po operaciji, pri čemer je uporabljala različne tehnike, kot so test na odprtem polju, hladna plošča, obešanje na repu in obešanje z žico.

Preizkus na odprtem polju je ocenil spontano aktivnost miši; testi hladne plošče so merili toplotno hiperalgezijo; Testi vzmetenja repa so merili aksialno bolečino; in preskusi žičnih obes izmerjene trdnosti.

Dvanajst tednov po operaciji je ekipa secirala ledveno hrbtenico živali z uporabo sledi femoralnega živca in arterije za identifikacijo medvretenčnih ploščic med L4 in L5, L5 in L6 ter L6 in S1 IVD. Uporabili so L5/L6 IVD za oceno histologije in določitev vsebnosti glikozaminoglikana (GAG).

FOXF1 eEV so bistveno zmanjšali odzive na bolečino, medtem ko so obnovili strukturo in funkcijo IVD, vključno z izboljšavami v višini diska, hidraciji tkiva, vsebnosti proteoglikanov in mehanskih lastnostih.

Študija se je osredotočila na sproščanje eEV, naloženih s FOXF1, iz primarnih fibroblastov, transficiranih s transkripcijskim faktorjem FOXF1. Kvantitativna RT PCR je pokazala znatno povečanje ravni transkriptov mRNA FOXF1 in ravni mRNA FOXF1 v polni dolžini prepisane v primerjavi s celicami, transficiranimi s pCMV6.

Terapija FOXF1 eEV lahko zmanjša odzive na bolečino v modelu miške s punkcijo ledvenega diska za do 12 tednov. Samice miši so pokazale daljše čase pridobivanja v skupini, zdravljeni s FOXF1, kot v skupini z lezijami, kar je trajalo vsaj 12 tednov po zdravljenju.

Terapija FOXF1 eEV je izboljšala hidracijo in višino IVD tkiva pri poškodovanih in degenerativnih živalih in vivo, hkrati pa ohranila ravni hidracije in T2-uteženo intenzivnost slike IVD.

Vendar je ekipa opazila zmanjšanje višine diska pri ranjenih živalih in živalih, zdravljenih s pCMV6 eEV. Miši, zdravljene s FOXF1 eEV, niso imele zmanjšanja višine diska 12 tednov po zdravljenju. Spol ni vplival na funkcionalne rezultate.

FOXF1 eEV so obnovili mehansko funkcijo poškodovanih in degeneriranih IVD in vivo. Pod osno obremenitvijo so IVD-ji, obdelani s FOXF1 eEV, pokazali višjo normalizirano togost NZ v primerjavi s poškodovanimi IVD-ji.

V pogojih lezenja so poškodovani IVD pokazali povečane normalizirane pomike pri lezenju, kar kaže na zmanjšanje normalizirane elastične togosti pri lezenju.

Rezultati kažejo, da zmanjšanje vsebnosti GAG v poškodovanih IVD-jih poveča mehansko prožnost, vendar terapija z eEV preprečuje izgubo glikozaminoglikana in posledične spremembe mehanske funkcije.

FOXF1 eEV so povzročili strukturne in funkcionalne spremembe IVD s povečanjem ravni proteoglikanov in GAG.

Rezultati študije so pokazali, da lahko eEV, obremenjeni z razvojnimi transkripcijskimi faktorji, zdravijo boleče sklepne bolezni, kot je DBP, z dovajanjem teh transkripcijskih faktorjev v degenerativne in boleče IVD sklepe.

Ta strategija lahko pomaga zmanjšati strukturne in funkcionalne nepravilnosti, ki jih povzroča bolezen, ter uravnavati odzive na bolečino, specifične za spol.

Raziskovalci so tudi priporočili uporabo razvojnih transkripcijskih faktorjev, kot je FOXF1, za pretvorbo degenerativnih celic NP v proanabolično stanje in vivo. Za določitev njegove terapevtske učinkovitosti so potrebne nadaljnje raziskave.