Eksperimentalni modeli osteoartritisa

Hlacanje je visoko specializirano tkivo, ki vsebuje le eno vrsto celic (hondrocite), za kar je značilno odsotnost krvi in limfnih posod. Prehrana hrustanca se večinoma izvaja z absorpcijo iz sinovialne tekočine. Presnovo kondroitov ureja vrsta topnih faktorjev, ki jih na lokalni ravni proizvajajo hondrociti in okoliška tkiva. Funkcija hondrocitov je odvisna tudi od sestave zunajceličnega medija (napetost kisika, koncentracija ionov, pH itd.), Sestava ECM, interakcija celic in matriksa ter fizikalni signali. Glavna naloga eksperimentalnega modeliranja je ustvarjanje kultur v zunajceličnem okolju brez spreminjanja fenotipa zrelih celic. Druga naloga je ustvariti kulture za preučevanje predčasnega, zakasnjenega, kratkega ali dolgotrajnega odziva hondrocitov na kemične in / ali fizične signale. Študije in vitro tudi priložnost za študij obnašanja hondrocitov v osteoartritisa. Tretja naloga je razvoj so-kurativnih sistemov, ki omogočajo proučevanje medsebojnega delovanja različnih tkiv v sklepih. Četrta naloga je priprava hrbteničnih vsadkov za nadaljnjo transplantacijo. In končno, peta naloga je preučevanje dejavnikov rasti, citokinov ali terapevtskih sredstev, ki lahko spodbudijo popravilo in / ali zavirajo njegovo resorpcijo hrustanca.

V preteklih desetletjih so bili ustvarjeni različni modeli kosti hrustančastih celic, vključno z monolojnimi kulturami, suspendiranimi kulturami, kondronskimi kulturami, eksplantati, kokulture, nesmrtnimi celičnimi kulturami. Vsaka kultura ima svoje prednosti in slabosti in je vsak primeren za proučevanje enega posebnega vidika presnove hondrocitov. Tako so hrustančne eksplantati odličen model za proučevanje prometa matričnih elementov, ki zahtevajo pristne receptorje celične površine in normalne celične matrice in interakcije matriksnih celic. Istočasno je priporočljivo, da se na kulture izoliranih celic preučuje vloge v matriki ali mehanizmi za uravnavanje presnove hondrocitov. Za proučevanje procesa celične diferenciacije je potrebna enoslojna kultura z nizko gostoto. Kulture, suspendirane v naravnem ali sintetičnem matriksu, so model za analizo prilagodljivega odziva hondrocitov na mehanske strese.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Kondricitne kulture

Pri izbiri tkiva hrustanca za in vitro študije je treba upoštevati več pomembnih točk. Matriksna sestava in presnovna aktivnost hondrocitov se razlikujeta v različnih sklepih, slednja pa je odvisna tudi od globine hondrocitov v tkivu. Ti podatki so bili pridobljeni v več poskusih, v katerih smo proučevali izolirane subpopulacije hondrocitov iz hrustančnih območij različnih globin. Ugotovljene so bile številne morfološke in biokemijske razlike med kultiviranimi hondrocitami, ki se nahajajo na površini in globoki plasti sklepnega hrustanca. Površinske celice sintetizirajo redko osiromašeno fibrilirno matriko proteoglikana, medtem ko globlje celice proizvajajo matriko, ki je bogata s fibrili in proteoglikani. Poleg tega površinske celice proizvajajo razmeroma manjše neagregirane proteoglikane in hialuronsko kislino ter sorazmerno manj agregan in keratan sulfat kot globlje locirani hondrociti. Druga pomembna značilnost metabolizma hondrocitov, izoliranih iz hrustančnih območij različnih globin, je odziv na eksogene stimuluse. Po mnenju M. Aydelotte in soavtorjev so bili bull chondrocytes iz površinskega območja hrustanca bolj občutljivi na IL-1 kot celice globoke cone.

Obnašanje celic je odvisno tudi od lokacije tkiva. Hondrocitov hrustanca in ušesa robov, vzetih iz iste živali, ki reagirajo drugače kot rastnih faktorjev, kot so fibroblastni rastni faktor (FGF) in TGF-beta. FGF povečana timidina, prolin in levcin na kulturi hondrocitov rebra, a ne ušesu. TGF-P povečali vključitev timidina v hrustančne hondrocitov rebrom in uho, vendar je v hondrocitov in prolinsko uho ne vpliva na timidina. Hrustančni celice so pridobljeni iz območij, ki nosijo največje obremenitve, se razlikujejo od tistih odsekov z nizko obremenitev na hrustanca. Na primer, zrele hondrociti hrustanca kolenskega sklepa iz osrednje območje ovce sklepnega tibialni površino kosti niso zajete meniskus, ki nosi največje obremenitve in vivo, manjši sintetizirane agrekana, dekorin vendar večja od celic področjih, ki jih meniska pokriva. Avtorji poudarjajo tudi pomen uporabe hrustanca v sklepih identičnih mestih v študiji sintetičnega funkcije sklepov.

Presnova hondrocitov in njihov odziv na regulativne dejavnike prav tako močno odvisna od starosti darovalca, razvoja njegovega okostja in stanja sklepov, iz katerih se celice vzamejo. Pri človeških hondrocitih opazimo znatno zmanjšanje s starostjo proliferativnega odziva. Največje zmanjšanje se kaže pri dajalcih, starih od 40 do 50 let in več kot 60 let. Poleg tega se resnost proliferativnega odziva na rastne faktorje (npr. FGF in TGF-beta) med staranjem zmanjša. Poleg kvantitativnih sprememb pri širjenju hondrocitov so tudi kvalitativne spremembe. Mlade darovalske celice (10 do 20 let) se bolje odzivajo na trombocitni rastni faktor (PDGF) kot na TGF-beta, medtem ko je nasprotno pri odraslih donorskih celicah. Da bi razložili starostno odvisne spremembe v sintetični funkciji hondrocitov in njihov odziv na učinek rastnih dejavnikov, se uporablja več mehanizmov. Med njimi je zmanjšanje števila in afinitete površinskih celičnih receptorjev, sprememba sinteze in bioaktivnosti rastnih faktorjev in citokinov, sprememba postreceptorskih signalov.

Patološko stanje sklepov tudi spreminja morfologijo in presnovno aktivnost hondrocitov. Torej, J. Kouri in soavtorji (1996) so identificirali tri subpopulacije hondrocitov v hrustancu z osteoartritisom. Chondrocytes iz površinske in zgornje polovice hrustanca oblikujejo grozdje in sintetizirajo več proteoglikanov in kolagena. TGF-beta, in inzulinu podobnega rastnega faktorja (IGF) lahko stimulira proteoglikan sintezo preko hondrocitov in delno nevtralizira učinke IL-1 in TNF-a. Hrustanec eksplante smo zbolijo z osteoartritisom in hondrocitov izolirane iz hrustanca bolnikov z osteoartritisom, so bolj občutljive za stimulacijo TGF-beta od zdravih hrustanca hondrocitov. Te razlike so najverjetneje povezane s fenotipskimi spremembami v hondrocitih v zgornjih plasteh sklepnega hrustanca.

Izolacijo posameznih hondrocitov dosežemo s sekvenčno terapijo s proteolitičnimi encimi ECM. Po izpustu iz ECM so izolirane celice idealne za proučevanje sinteze komponent de novo matrice . Nekateri avtorji uporabljajo le klostridij kolagenazo, drugi pa predkubirajo hrustanca s tripsinom, pronase, DNazo in / ali hialuronidazo. Število izoliranih celic je odvisno od uporabljenih encimov. Tako pri obdelavi enem od 1 g kolagenaze tkiva mogoče dobiti 1,4T0 ⁶ hondrocitov, ker pri uporabi pronaza, hialuronidazo in kolagenaze - 4,3-10 ⁶. Pri predelavi s kolagenazo, aggrecanom, beljakovinami, IL-6, IL-8 ostanejo v celični kulturi veliko več kot v primeru zaporednega zdravljenja z različnimi encimi. Za te razlike med dvema celičnim kulturam je nekaj razlag:

• Celične receptorje poškodovane ali depresivni z delovanjem encimov, TGF-beta zavira sintezo DNA proteoglikanov v novo izoliranih hondrocitov (dan 1), medtem ko je DNA in proteoglikana sintezo hondrocitov kultiviranih v monosloja (7 dni) z TGF-beta stimuliranih. Vendar pa je za ponovitev teh membranskih komponent potrebno pred začetkom eksperimenta ustrezno obdobje.
• Eksogene proteaze lahko prekinejo interakcijo celic in matriksa, ki jih posredujejo integrini. Družina integrin spodbuja pritrditev hondrocitov na molekule VKM (Shakibaei M. In sod., 1997). Ta zlom lahko vpliva na izražanje matriksnih genov.
• Ostanki matričnih komponent lahko uravnavajo sintetično funkcijo hondrocitov. Integrini lahko prepoznajo produkte degradacije ECM in s tem igrajo pomembno vlogo pri vzdrževanju tkiva po izpostavitvi proteolitičnim encimom. T. Larsson in soavtorji (1989) so poročali, da dodajanje intaktnih ali fragmentiranih pro-teoglikanov v celično kulturo stimulira sintezo proteinov in proteoglikanov. Vendar pa visoke ravni hialuronske kisline povzroči znatno zmanjšanje v vključitvi sulfat proteoglikan sintezo preko hondrocitov hondrocitov piščančjih zarodkov zrel prašičev in podganji hondrosarkom celice. Še več, hialuronska kislina - zaviralec proteoglikana sproščanje iz celic, tudi v prisotnosti IL-lb, TNF-a, FGF, kar kaže, da je prvi preprečevanju biološko aktivnost rastnimi faktorji in citokini. Natančen mehanizem, ki je podlaga za delovanje hialuronske kisline, ostaja nejasen; Znano je, da hondrociti vsebujejo receptor za hialuronsko kislino, ki je povezana z aktinskimi filamenti citosola. Vezava hialuronske kisline na receptor stimulira fosforilacijo proteinov. Tako ti podatki dokazujejo modulacijo metabolne funkcije holonditisov s fragmentiranimi ali nativnimi molekulami matriksnih proteinov z aktiviranjem membranskih receptorskih celic.
• Hitra stimulacija s sintezo matriksnih proteinov s hondrocitami je lahko posledica spremembe v obliki hondrocitov in / ali reorganizacije citoskeletov.
• Nekateri citokini (npr. IL-8) in faktorji rasti (npr. IGF-1, TGF-P) so določeni v ECM. Najbolj znan primer je vezava TGF-beta z decore, kar vodi k zmanjšanju sposobnosti nekdanjega povzročitelja celične rasti v celicah jajčnikov v kitajskih hrčkih. Podatki, da se vsebina hrustanca s starostjo poveča, kaže na zmanjšanje biološke uporabnosti TGF-beta pri staranju. Faktorje rasti in citokine se lahko sprostijo iz ostankov matriksa med kulturo in nato modulirajo funkcijo hondrocitov.

[8], [9], [10], [11],

Enoslojna kultura hondrocitov

Diferenciran fenotip hondrocitov je v prvi vrsti značilen za sintezo kolagena tipa II in tkivno specifičnih proteoglikanov ter nizko stopnjo mitotske aktivnosti. Dokazano je, da dolgotrajno kultiviranje celic v enoplastni, in po več ponavljajočih se prehodov celic, hondrociti izgubijo sferično obliko, postanejo podolgovati, fibroblastov podobne oblike. S takšno fibroblastov metaplazija sintetična funkcija prirejena tudi celice, označen s postopno tanjša sintezo kolagena II, IX in vrste XI in izboljšano sintezo kolagena I, III in Utipov. Manj neagregirane proteoglikane sintetiziramo s funkcionalnim aggrecanom. Sinthetzatepsin B in L sta izredno nizka v diferenciranih celicah, vendar se v procesu izgube razlikovanja poveča. Kolagenazo-1 je izražena v diferenciranih hondrocitov med daljšim gojenje njegova ekspresija je zmanjšana ker povečane proizvodnje inhibitorja tkiva metaloproteaz (TIMP).

Diferencirani hondrociti ponovno izražajo kolagen diferenciranega fenotipa, ko se prenesejo iz monoslojne kulture v suspendirano. Proces diferenciacije je verjetno povezan z obliko celic. To lastnost redno uporabljajo raziskovalci, ki preučujejo pomanjkljive presaditve z avtolognimi hondrociti. Majhno število celic, pridobljenih iz biopsijskega materiala, lahko pomnožimo v monoslojni kulturi in nato ponovno postavimo v tridimenzionalno matrico pred presaditvijo. Ponovno ekspresijo specifičnih fenotip dediferencirane hondrocitov prešle v agaroznem kulturo, lahko stimulira TGF-p-Kostna tkiva hidroksipatitnim kompleksa in askorbinske kisline.

V odziv na učinek rastnih faktorjev in citokinov se med procesom diferenciacije spremenijo hondrociti. Celični odziv na citokine in faktorje rasti se razlikuje med nediferenciranimi in diferenciranimi hondrociti. IL-1 stimulira proliferacijo fibroblastov, medtem ko rast nediferenciranih hondrocitov zavira IL-1. Sintezo DNK stimulira IGF-1 pri podolgovatih, a ne sploščenih hondrocitih. V diferenciranih hondrocitih so stimulativni učinki IL-1β in TNF-α na procollagenazne produkte bolj izraziti kot pri nediferenciranih.

Gojenje hondrocitov

Gojitev hondrocitov v suspenziji v tekočem mediju ali v naravni ali sintetični tridimenzionalni matriks stabilizira fenotip hondrocitov. Celice ohranijo svojo kroglično obliko, sintetizirajo proteine, specifične za tkivo. Ponavadi se priporoča ponderirana kultura hondrocitov za proučevanje nastanka novega perikularnega matriksa. Kondricitne kulture v sintetičnih ali naravnih vpojnih polimerih se uporabljajo za implantacijo celic v okvare hrustanca, da bi spodbudili regeneracijo tkiva hrustanca v sklepih. Sintetično ali naravno okolje za vsadljive celice mora izpolnjevati več zahtev:

• Implantati morajo imeti porozno strukturo za adhezijo in rast celic,
• niti sam polimer niti produkti njene razgradnje ne smejo povzročiti vnetij ali strupenih reakcij med implozijo in vivo,
• se nosilec presadka lahko veže na sosednji hrustanec ali subhondralno kost,
• naravni ali sintetični matriks mora biti sposoben absorpcije, njegovo razgradnjo je treba uravnotežiti z regeneracijo tkiva,
• Da bi olajšali popravljanje hrustanca, bi morala kemijska struktura in matrična arhitektura matrice pomagati vzdrževati celični fenotip, ki ga kodirajo hondrociti in sinteza beljakovin, specifičnih za tkivo,
• med implantacijo in vivo je treba preučiti mehanske lastnosti sintetične ali naravne matrice.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspenzija hondrocitov v tekoči fazi

Pritrditev celic na posodah iz umetne snovi, pri kateri se je kultiviranje hondrocitov mogoče preprečiti njihove stene prekrijemo z raztopino metil celuloze, agaroze, hidrogel (poli-2-hidroksietilmetakrilat) ali mešanice kolagenske-agaroze. Pod temi pogoji, tvorijo skupine in hondrociti sintetizirajo večinoma obsegali tkivno specifičen agrekana in kolagen (II, IX, vrste XI). Običajno najdemo dve vrsti celic. Se nahaja v središču celic ohrani okrogle oblike, obdan z dobro razvite ECM, ki je potrdil histokemijskih in ultrastrukturni študijah. Na obodu hondrocitov imajo diskoidni obliko, obdan z redko VKM; Majhno je znano o funkcionalnih značilnostih teh celic.

Možno je gojenje hondrocitov na mikro nosilcih, podprtih z vzmetenjem; Kot mikro nosilci se uporabljajo dekstranske kroglice (cytodex), dekstranske kroglice, prevlečene s kolagenom (cytodex III), neprodušne mikrosfere kolagena tipa I (kolagen). Pod temi pogoji kulture se hondrocite pritrdijo na površino mikroprožnjaka, ohranijo svojo kroglično obliko in izdelajo material, podoben matriksu. Poleg tega uporaba kolagena spodbuja proliferacijo hondrocitov in ponovno izražanje normalnega fenotipa. Zato lahko gojenje hondrocitov na mikrosferi kolagena uporabimo za obnovitev celičnega fenotipa pred presaditvijo.

Druga metoda gojenja suspenzije hondrocitov v tekočem mediju je njihova gojitev v obliki gostih kroglic, sestavljenih iz celic (0,5-1 * 10 ^b ), pridobljenih s centrifugiranjem. Takšne hondrociti lahko proizvedejo matriks, ki vsebuje velike količine proteoglikanov, II-kolagena tipa, vendar ne kolagena tipa I, ki je bila potrjena s histoloških imunohistokemijske in kvantitativne metode.

Suspenzija hondrocitov v naravnem ECM

Hondrocitov lahko gojimo v suspenziji v tridimenzionalni matriks (mehkega agarja, agarozo, imenujemo geni gela ali gobo, hialuronska kislina, fibrina lepilo, alginat kroglice).

Kulturni agarozni hondrociti ohranjajo svoj normalni fenotip in sintetizirajo kolagene tipa II in agregate, ki so specifični za tkivo. Ko se kultivirajo v agarozi, proteoglikani s celično sintetizacijo sproščajo v medij 50 dni. Za primerjavo - v monoslojni kulturi je celična faza prepolna z glikozaminoglikani že v prvih 5-6 dneh gojenja; ko se kultivira v mediju po intenziviranju sinteze in sproščanja glikozaminoglikanov, se v prvih 8-10 dneh pojavi časovno odvisno zmanjšanje glikozaminoglikanov. Kljub temu se vedenje hondrocitov med gojenjem v agarozi razlikuje od obnašanja v stanju in vivo. V agarozi veliko število sintetiziranih agregatov Aggregan vsebuje manjše in manjše molekule kot in vivo. TGF-P stimulira sintezo proteoglikanov v eksplantatu, vendar zmanjša sintezo aggrecana v agarozi.

Alginat je linearni polisaharid, pridobljen iz rjavih morskih alg. V prisotnosti dvovalentnih kationov, kot so Ca ^{2+ ioni}, ta polimer postane gel. Vsaka hondrocitov ujete v alginat, obdana z matriko negativno nabitih polisaharidov, pore, ki so primerljive s tistimi hialina hrustanca. Matrika ki je tvorjen hondrocite v alginatnih kroglice, ki sestoji iz dveh delov - tanka plast celico povezanega matrice ustreza pericellular in teritorialnih matrik sklepnega hrustanca in bolj oddaljenih matrični medteritorialnem ekvivalent v nativni tkivu. Na 30. Dan kulture, relativna in absolutna količina zasedajo celice, in vsak od dveh oddelkov v alginatno noge je skoraj popolnoma enaka tistim rodni hrustanca. Za skoraj 30 dni hondrociti obdržijo svojo kroglasto obliko in izdelavo agrekana, hidrodinamične lastnosti, ki so podobne tistim iz agrekana molekul v matrici sklepnega hrustanca in kolagenske molekule II, IX in XI vrste. Istočasno, kot kultur, suspenzij, alginat kapljice na površini sploščenih celic so prisotne, ki ustvarjajo majhno količino kolagena tipa I molekule, spusti neposredno v okolje in niso vključene v videorekorderju. V alginatnih kroglicah opazimo zmerno proliferacijo hondrocitov. Po 8 mesecev gojenja v alginat gel zrelih hondrocitov ne izgubijo metabolne aktivnosti in še sintetizirati tkivno specifične kolagena tipa II in agrekana.

N. Tanaka in soavtorji (1984) so raziskali difuzijske lastnosti različnih naravnih molekul v alginatu in ugotovili, da molekule, večje od 70 kD, ne razpršijo skozi alginat. Tako je gojenje celic v alginatu primerno za proučevanje regulacije matriksne biosinteze in organizacije ECM. Razpoložljivost celic, ki se gojijo v alginatu, omogoča, da preučuje učinek regulatornih faktorjev peptidov in farmakoloških učinkovin na transkripcijske, posttranscriptne in translacijske ravni.

Kondrocite tudi gojijo v matriki vrst I in II kolagenih vlaken. S. Nehrer in soavtorji (1997) so primerjali delovanje pasjih hondrocitov v poroznih polagnih matičnih kolagenskih proteoglikanov, ki vsebujejo kolagene različnih vrst. Ugotovili so pomembne razlike v morfologiji biosintetske funkcije hondrocitov, gojenih v kolagenskih matrikah, ki vsebujejo kolagen tipa I in II. Celice v matriki kolagena tipa II so zavojile svojo kroglično obliko, medtem ko so imele v kolagenu tipa I filoblastično podobno morfologijo. Poleg tega so v matriki kolagena tipa II hondrociti proizvedli več glikozaminoglikanov. J. Van Susante et al (1995) je primerjal lastnosti kondricitov, ki so bili kultivirani v alginatu in gelu kolagena (tip I). Avtorji so ugotovili znatno povečanje števila celic v kolagenskem gelu, vendar so od 6. Dne gojenja celice izgubile značilni fenotip in se spremenile v fibroblast podobne celice. V alginatnem gelu so opazili zmanjšanje števila celic, vendar pa so hondrociti ohranili svoj normalni fenotip. Količina kolagenski gel proteoglikanov na celico so precej višji kot v alginata, ki pa se je znižala v gelnega matriksa elementi sinteze izhodnega iz 6. Dan gojenja, ker alginatne sintezi še naprej raste.

Trden tridimenzionalni fibrinski matriks je naravna snov, ki podpira hondrocite, stehtane v njej, v diferenciranem fenotipu. 3D fibrinski matriks se lahko uporablja tudi kot nosilec za presaditev hondrocitov. Prednosti fibrina so odsotnost citotoksičnosti, sposobnost zapolnjevanja prostora, lepilne sposobnosti. Z histoloških in biokemijskih študijah Autoren-diografii, elektronska mikroskopija je pokazala, da hondrocitov v fibrinske gelov obdržijo svojo morfologijo, množijo in proizvajajo matriko celo po 2 tednih gojenja. Vendar pa G. Homminga in soavtorji (1993) poročajo, da se po treh dneh gojenja začne razpad fibrina, napredek dediplantacije hondrocitov.

Suspenzija hondrocitov v umetnem (sintetičnem) ECM

Hranilne implantate za rekonstruktivno ali ortopedsko kirurgijo lahko pridobimo z rastjo izoliranih hondrocitov in vitro v sintetični biokompatibilni matrici.

Kulturni poliglikolni kislinski hondrociti se širijo in ohranjajo normalno morfologijo in fenotip v 8 tednih. Kompleks hondrocit-poliglikolne kisline sestoji iz celic, glikozaminoglikanov, kolagenov in ima zunanjo kolagensko kapsulo. Vendar pa v takih vsadkih obstajata dve vrsti kolagenskih molekul - I in II. Vsadki za dediferencirane hondrocitov niz prehodov imajo večjo količino glikozaminoglikanov in kolagena kot v vsadki nediferenciranih primarnih hondrocitov.

L. Freed sod (1 993b) glede na obnašanje hondrocitov kultur človeških in goved v vlaknastega poliglikolno kislino (EQAP) in razdor polilaktilovoy kislini (PPLC). Po 6-8 tednih gojenja bikonondentov v HSVG ali PPLC so avtorji opazovali regeneracijo celičnega proliferacije in hrustanca. V HSBC so bili hondrociti sferični, ki se nahajajo v laktonih, obkroženih s hrustančastim matriksom. Po 8 tednih gojenja in vitro regeneriramo tkiva vsebujejo do 50% trdne snovi (4% mase celic, 15% in 31% glikozaminoglikanov kolagenov). V celicah PPLK so imele vreteno, majhno količino glikozaminoglikanov in kolagena. V HSBC je bila celična rast dvakrat bolj intenzivna kot pri PTCA. V pogojih in vivo so hondrociti, ki se gojijo v HPVC in PPLC v obdobju 1 do 6 mesecev, tkivo, ki je histološko podobno hrustanču. Vplivi so vsebovali glikozaminoglikane, kolagene tipa I in tipa II.

Fetalni bik hondrociti so bili gojeni v porozni hidrofobni in hidrofilni polietilen z visoko gostoto. Po 7 dneh inkubacije v obeh substratih so celice ohranile kroglično obliko, ki večinoma vsebuje kolagen vrste II. Po 21 dneh gojenja se je izkazalo, da hidrofilni matriks vsebuje več kolagena tipa II kot hidrofobni matriks.

Tkivo hrustanca se lahko pridobi tudi s kultiviranjem v monoslojnem filtru Millicell-CM. Predpristopanje filtrov s kolagenom je potrebno za pritrditev kondroitov. Histološki pregled kulture dokazuje kopičenje hondrocitov v ECM, ki vsebujejo proteoglikane in kolagene tipa II. Kolagen tipa I v taki kulturi ni zaznan. Hondrociti v nastalem krvotvornem tkivu imajo kroglično obliko, vendar so na površini tkiva nekoliko bolj sploščeni. Debelina novonastalega tkiva se je s časom povečala in je odvisna od začetne gostote enoslojnega celic. V optimalnih pogojih kulture je debelina tkiva hrustanca dosegla 110 μm, organizacija celic in kolagena v površini in globokih plasti je podobna kot pri sklepnih hrustancah. VKM vsebuje približno 3-krat več kolagena in proteoglikanov. Po 2 tednih pridelave smo opazili kopičenje matrice-sa, ki je omogočilo, da se tkivo izvleče iz filtra in ga uporabi za presaditev.

Sims in ostali (1996) so proučevali gojenje hondrocitov v polipeptidiranem polimernem matriksu z polietilenoksidom in gelom, ki omogoča prevažanje velikega števila celic z injekcijo. Šest tednov po injiciranju v podkožno tkivo atimičnih miši je nastal nov hrustanec, ki je bila morfološko značilna belja opalescenca, podobna hialinskemu hrustanču. Podatki iz histoloških in biokemijskih študij so pokazali prisotnost aktivno proliferirajočih hondrocitov, ki proizvajajo ECM.

Pojasnilo

Preiskava hrustančnega tkiva se uporablja za proučevanje procesov ana- in katabolizma v njej, homeostaze, resorpcije in popravila. Chondrocytes v ekspresijah tkiv hrbtenice podpirajo normalni fenotip in sestavo ECM, podobno kot pri sklepnih hrustancah in vivo. Po 5 dneh gojenja v prisotnosti seruma dosežemo stalno raven sinteze in naravne degradacije. Resorpcija lahko pospeši tkivnih kulturah in v glavnem kulturi z dodatkom seruma ob uporabi več agentov, npr IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivati retinojske kisline ali aktivnih radikalov kisika. Za preučevanje popravila hrustanca povzročijo njegovo škodo s topnimi mediatorji vnetja (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) ali fizičnim zlomom matriksa.

Metoda organotipskih kultur je model za proučevanje učinkov in vitro izoliranih zunanjih dejavnikov na hondrocite in okoliško matriko. In vivo se v ECM redko nahajajo hondrociti in se ne obračajo med seboj. Kultura eksplozivnega sklepnega hrustanca ohranja to strukturno organizacijo, pa tudi posebne interakcije med hondrocitov in njihovim okoliškim zunajceličnim okoljem. Ta model se uporablja tudi za preučevanje učinka mehanskih stresov, farmakoloških dejavnikov, rastnih dejavnikov, citokinov, hormonov na presnovo hrustanca.

Druga prednost razkrivanja hrustančnega tkiva je odsotnost poškodbe hondrocitov s proteolitskimi encimi ali mehanskim dejavnikom, ki je neizogiben, ko so celice izolirane. Receptorji in drugi membranski proteini in glikoproteini so zaščiteni pred škodljivimi dejavniki.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kultura hondrona

Hondron - strukturno, funkcionalno in presnovni sklepni hrustanec enota sestoji iz hondrocitov pericellular matrike in kompaktno žarilno kapsuli in je odgovoren za homeostaze matriksa. Chondrone se mehansko izločajo iz hrustanca in se zbrajo z več zaporednimi homogenizacijami z nizko hitrostjo. Izoliramo iz območij različnih globinah hondrony hrustanec lahko razdelimo v štiri kategorije: enotno hondron, dvojno hondrony, večkratnik (tri ali več) linearno razporejena hondrony (kolona hondronov) hondronov zastojev.

Enotni hondrony ponavadi najdemo v srednjem plasti nedotaknjene hrustanca, dvojčka - na meji srednje in globoke plasti linearno urejena z več hondrony značilne globoke plasti nepoškodovanega hrustanca. In končno, skupini chondrons sestavljajo naključno organizirane skupine enojnih in parnih hondronov, ki zadržijo agregirano stanje po homogenizaciji. Hondronov grozdi predstavljajo velike hrustanca fragmente, običajno vsebuje več radialni hondronov in kolagenske fibrilov, t. E. Tipična organizacija, ki je značilen za globoke plasti matrike. Chondroni so imobilizirani v prozorni agarozi, kar omogoča preučevanje njihove strukture, molekularne sestave in presnovne aktivnosti. Hondron sistem - agaroze šteje kot mikro model hrustanca, ki se razlikuje od tradicionalnega sistema hondrocitov - agaroze, ki ohranja naravno mikrookolje, ni potrebe, da opravlja svojo sintezo in montažo. Kultura hondrona je model za proučevanje interakcij celic in matriksa v sklepnem hrustancu v normalnih in patoloških pogojih.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Kultura nesmrtnih hondrocitov

Za ustvarjanje trajnih celičnih linij se uporabljajo rekombinantne DNK ali virusi, ki vsebujejo onkogen, kar lahko celico "nesmrtno". Besmrtni hondrociti imajo sposobnost neskončne proliferacije in ohranjajo stabilen fenotip. F. Mallein-Gerin s sodelavci (1995) so pokazali, da je onkogena-SV40T inducirane proliferacije mouse hondrocitov in torej še naprej stabilno izražanje kolagenov II, IX in XI vrst, kot tudi skupno in agrekana vezavni protein. Vendar pa takšna celična linija pridobi sposobnost sintetiziranja kolagena tipa I, kadar jo gojimo v monoslojni kulturi ali v agaroznem gelu.

W. Horton in soavtorji (1988) opisujejo linijo nesmrtnih celic z nizko stopnjo izražanja mRNA tipa kolagena tipa II. Te celice smo dobili tako, da smo jih pretvorili z retrovirusom miši, ki vsebuje I-mike in y-ra-onkogene. Ta vrsta celic je edinstven model za proučevanje interakcij artikularne matrice v odsotnosti kolagena tipa II in regulacija sinteze kolagena tipa II.

Kultura hondropitov z mutiranimi ali izbrisanim genom je primeren model za proučevanje njihove fiziološke funkcije. Ta model je še posebej primeren za preučevanje vloge posameznih molekul v organizacijah hrustanca matričnih ali preučevanje učinkov različnih regulativnih dejavnikov na metabolizem hrustanca. Hondrocitov daljinsko gena sintetiziramo Tip kolagen IX kolagena fibrile širši kot običajno, kar kaže, da tip kolagen IX regulira premer vlaken. Kot je navedeno v poglavju 1, je bila pred kratkim odkrita mutacija kolagena gena, ki kodira kolagen tipa II v družinah s primarnim generaliziranim osteoartritisom. Za preučevanje učinka mutirane kolagena tipa II v sklepnega matrike R. Dharmrvaram et al (1997) izvedemo transfekcijo ( "onesnaženje" tuje nukleinske kisline) v okvari COL ₂ AI (arginin na poziciji 519 se nadomesti s cisteinom) v plodovih hondrocitov človeških in vitro.

Sistem kokulture. V sklepu je hrustanec povezana s celicami drugih vrst, ki jih vsebujejo sinovialna membrana, sinovialna tekočina, ligamenti, subhondralna kost. Na presnovo hondrocitov lahko vplivajo različni topni faktorji, ki jih sintetizirajo te celice. Torej artikularni hrustanec artritisa uničijo proteolitični encimi in prosti radikali, ki jih proizvajajo sinovialne celice. Zato so bili razviti modeli za preučevanje zapletenih interakcij med hrustančnostjo in okoliškimi tkivi, ki se imenujejo kokulture.

S. Lacombe-Gleise s sodelavci (1995) so bili kultivirani zajec hondrocitov in osteoblastov v coculture sistemu (Costar), v kateri so celice ločimo mikroporozno membrano (0,4 mikronov) omogoča izmenjavo med dvema vrstama celic brez kakršnega koli neposrednega stika. Ta študija je pokazala sposobnost osteoblastov, da spodbujajo rast hondrocitov skozi topne mediatorje.

A.M. Malfait in soavtorji (1994) sta raziskali razmerje med monociti periferne krvi in hondrocitov. Ta model je uporaben za preučevanje procesov posredovanih s citokini pri vnetnih artropatije (revmatoidni artritis, seronegativni spondilitis et al.). Avtorji modela so ločili celice s proteinsko vezavno membrano s premerom 0,4 μm. Študija je pokazala, da-lipopolisaharidne stimulirane monocite izšlo iFNO IL-1 a, ki zavira sintezo hondrocitov agrekana in prispevali k degradaciji že sintetizirani agrekana agregatov.

K. Tada s sodelavci (1994) ustvaril model coculture v katerem so endotelne celice kolagena (I-tipa) gel povišanje v notranjo komoro od zunanje komore od katerega ga loči hondrocitov dane v filter z velikostjo por 0,4 um. V popolnem izolacijskega stanju od zunanjega komore človeške endotelijske celične cev tvorjena v kolagenski gel v prisotnosti EGF ali TGF-a. S hkratnim gojenje dveh celičnih tipov in TGF-odvisne postavitev endotelijske celične cevi je zatreti. Hondrocitov inhibicija tega postopka delno odstrani protiteles proti TGF-beta. Predvidevamo lahko, da TGF-beta proizvaja hondrocitov, zavira vaskularizacijo v hrustanca.

S. Groot in soavtorji (1994) so istočasno kultivirali hondrocite iz hipertrofičnih in proliferativnih pasov kosti 16-dnevne fetalne miši s koščki možganskega tkiva. Po 4 dneh kulture so opazili transdiferenciranje hondrocitov v osteoblaste in nastanek osteoidnih tvorb. Po 11 dneh gojenja je bil del hrustanca nadomeščen s kostnim tkivom in delno kalciniran kostni matriks. Nekateri nevropeptidi in nevrotransmitorji, ki jih proizvaja možgansko tkivo, vplivajo na metabolizem osteoblastov ali imajo na njih receptorje. Med njimi lahko izoliramo norepinefrin, vazoaktivni črevesni peptid, peptid, povezan s kalcitoninskim genom, snov P in somatostatin. Z kulturo s hondrocitima lahko delci možganskega tkiva proizvedejo nekatere od teh dejavnikov, kar lahko povzroči preoblikovanje hondrocitov v osteoblaste.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Vpliv zunanjih dejavnikov na kulturo hondrocitov

Učinek napetosti kisika na presnovo hondrocitov

V večini primerov se hondrocitne kulture razvijejo v razmerah napetosti atmosferskega kisika. Kljub temu je dobro znano, da in vivo hondrocite obstajajo v hipoksičnih pogojih, napetost kisika pa se spreminja z različnimi patološkimi stanji. Med postopkom zorenja opazimo pomembne spremembe v krvni obtoki epifiz. Ker se vaskularizacija spreminja v različnih območjih rastne plošče, se tudi njihova napetost spreminja. C. Brighton in R. Heppenstall (1971) sta pokazala, da je napetost kisika v hipertrofični coni na ploščici golenice na kuncih manjša kot v okoliškem hrustanču. Meritve nekaterih presnovnih parametrov so pokazale, da se lahko hondrociti hitro odzivajo na lokalne spremembe v koncentraciji kisika. Najprej z nizko napetostjo kisika se zmanjša poraba hondrocitov. Z zmanjšanjem napetosti kisika od 21 do 0,04% se poveča izkoriščenost glukoze, povečajo se encimska aktivnost glikolize in sinteza mlečne kisline. Tudi pri nizki napetosti kisika je absolutna količina ATP, ADP in AMP ostala stabilna. Ti podatki kažejo usmerjenost metabolizma hondrocitov za čim večjo porabo energije. Kljub temu se sintetična aktivnost in posledično procesi reparacije spreminjajo v pogojih hipoksije.

Visoka napetost kisika vpliva tudi na metabolizem hondrocitov, kar povzroči zmanjšanje sinteze proteoglikanov in DNA, degradacije matriksa hrustanca. Te učinke praviloma spremlja proizvodnja prostih kisikovih radikalov.

Vpliv koncentracije ionov in osmotskega tlaka okolja na delovanje hondrocitov

V nativne koncentracija hrustanec ionov se bistveno razlikuje od drugih tkivih: vsebnost natrija v zunajcelični mediju 250 - 350 mmol, in njegova osmolarnost - 350-450 mOsm. Ko izolacije hondrocitov iz videorekorderja in jih inkubiranje v standardni medijih (DMEM (Minimalni esencialni medij Eaglov medij, - Eaglov medij, minimalni esencialni medij) osmolarnost - 250-280,7 mOsm) spreminja močno okolice celice. Poleg tega, da je koncentracija kalcija in kalija v standardnem mediju so znatno nižje od nativnega tkiva, koncentracija anionske - bistveno večji.

Dodajanje saharoze medij vodi povečati osmolarnost in povzroči prehodno povečanje koncentracije intracelularnega H ⁺ in anione kalcija v citosolu. Takšne intracelularne spremembe lahko vplivajo na procese diferenciacije hondrocitov in njihovo presnovno aktivnost. J. Urban s sodelavci (1993) je pokazala, da je vključitev ³⁵ 8-sulfata in ³, je H-prolina izoliranih hondrocitov inkubirali v DMEM standardnem mediju za 2-4 ur v rodni tkivu le 10% tega. Intenzivnost Sinteza dosegla vrh pri osmolarnosti zunajcelične mediju 350-400 mOsm v novo izoliranih hondrocitov in hrustanca eksplantov v. Poleg tega se je obseg hondrocitov povečal za 30-40% po postavitvi izoliranih celic v standardni DMEM medij omenjene osmolarnosti. Vendar, kadar so celice prilagojene novemu okolju z zmanjšanjem intenzitete strigu kultiviramo hondrocite pod ne-fiziološko osmolarnost za 12-16 ur sorazmerna biosinteze osmolarnosti zunajcelične medija.

P. Borgetti s sodelavci (1995) so raziskovali učinek osmolarnosti zunajcelične medija na rast, morfologijo in biosintezo prašičjim hondrocitov. Avtorji so pokazale podobne biokemijske in morfološke lastnosti hondrocitov gojene v mediju z osmolarnostjo mOsm 0,28 in 0,38. Ko je bila 0,48 mOsm osmolarnost medija v prvih 4-6 urah kultiviranja opazili zmanjšanje celične proliferacije in sintezo proteinov, pozneje pa je prišlo obnovitev teh parametrov, ki sčasoma dosegel kontrolnimi vrednostmi. Ko gojenje hondrocitov v mediju z 0,58 mOsm osmolarnost celice izgubijo sposobnost za podpiranje fiziološke intenzivnost proliferacije procese in po 6 dneh je število hondrocitov bistveno zmanjša. Z osmolarnostjo medija, 0,58 mosmol, opazimo globoko zaviranje sinteze proteinov. Poleg tega, če so gojeni v medijih z osmolarnostjo mOsm 0,28-0,38 hondrociti ohranijo fiziološki fenotip pri višji osmolarnosti (mOsm 0,48-0,58) znatne spremembe v morfologijo celic, kar se kaže izguba značilen fenotip hondrocitov konverzijo v fibroblast podobne celice, pa tudi izgubo celic, sposobnost sestavljanja matricnih proteoglikanov. Rezultati te študije kažejo na sposobnost hondrocitov, da se odzivajo na omejene nihanje osmolalnosti v zunajceličnem okolju.

Sprememba koncentracije drugih ionov lahko vpliva tudi na procese biosinteze pri hondrocitih. Tako se stopnja vključitve ³⁵ S (sulfata) poveča za polovico s povečanjem koncentracije kalijevih ionov od 5 mmol (koncentracija v standardnem sredstvu DM DM) do 10 mmol (koncentracija v VKM in vivo). Koncentracija kalcija pod 0,5 mmol spodbuja tvorbo kolagena za zrel goveji hondrocitov, medtem ko je koncentracija 1-2 mm (ustreza koncentraciji v standardnem okolju DM EM) povzročila znatno zmanjšanje sinteze kolagena. Zmerno povečanje biosinteze so opazili pri visokih koncentracijah kalcija (2-10 mmolov). Različni kationi sodelujejo pri vezavi hondrocitov na proteine VKM. Tako magnezijevi in manganski ioni zagotavljajo vezavo na fibronektin in kolagen tipa II, medtem ko kalcijevi ioni ne sodelujejo pri vezavi hondrocitov na beljakovine. Tako rezultati študij, opisanih prikazujejo učinek sprememb zunajceličnih kalijevih ionov, natrij, kalcij, in osmolarnost medija na funkcijsko hondrocitov biosintezne inkubirali v standardnem mediju.

Vpliv mehanskega stresa na presnovo hondrocitov

Imobilizacija sklepa povzroči reverzibilno atrofijo hrustanca, kar kaže na potrebo po mehanskih dražljajih za normalen potek presnovnih procesov v ECM. V večini primerov uporabljajo vzorci celične kulture pri normalnih razmerah atmosferskega tlaka. M. Wright in soavtorji (1996) so pokazali, da mehansko okolje vpliva na metabolizem hondrocitov, odziv celic pa je odvisen od intenzivnosti in frekvence kompresijske obremenitve. Poskusi s tovorom na nedotaknjenih Eksplante sklepnega hrustanca in vitro dokazano zmanjšanje sinteze proteinov in proteoglikanov pod statične obremenitve, dinamične obremenitve pa stimulira teh procesov. Natančni mehanizmi za uresničitev učinka mehanskih obremenitev na hrustanec so zapleteni in so verjetno povezani s celično deformacijo, hidrostatičnim tlakom, osmotskim pritiskom, električnim potencialom in površinskimi celičnimi receptorji v matrične molekule. Za preučevanje učinka vsakega od teh parametrov je potrebno ustvariti sistem, v katerem lahko en parameter spremenimo neodvisno. Na primer, eksplantna kultura ni primerna za proučevanje deformacij celic, vendar jo lahko uporabimo za preučevanje splošnega učinka tlaka na presnovno aktivnost hondrocitov. Stiskanje hrustanca povzroča celično deformacije, in opremljeno tudi s pojavom gradientu hidrostatskega tlaka, električnega potenciala in fizikalno spremembo toka fluida dejavnikov, kot so vsebnost vode v matriksu, gostote električnega naboja, raven osmotskega tlaka. Deformacijo celic lahko preučujemo z uporabo izoliranih hondrocitov, potopljenih v agarozni ali kolagenski gel.

Razvili smo več sistemov za preučevanje učinka mehanske stimulacije na kulturo hondrocitov. Nekateri raziskovalci uporabljajo sisteme za ta namen, v katerem se tlak nanaša na celično kulturo skozi plinasto fazo. Na primer, JP Veldhuijzen s sodelavci (1979) z uporabo tlaka nad atmosferskim od 13 kPa pri nizki frekvenci (0,3 Hz) med 15 minut, opazili povečanje cAMP sintezo in proteoglikani in spuščanje sintezo DNA. R. Smith et al (1996) so pokazali, da je izpostavljenost s prekinitvami primarnih kultur hondrocitov bika hidrostatičnega tlaka (10 MPa) pri 1 Hz 4 ure povzročila povečanje sinteze agrekana in kolagena tipa II, medtem ko je konstanten tlak ne vpliva na te postopke. Z uporabo podobnega sistema M. Wright et al (1996) je poročal, da je ciklični pritisk na celični kulturi povezana z hyperpolarization na celično membrano hondrocitov in aktivacije Ca ²⁺ -dependent kalijevih kanalov. Torej, učinke cikličnega tlaka posredujejo ionski kanali, ki se aktivirajo z raztezanjem, v membrani hondrocitov. Odziv hondrocitov na hidrostatični tlak je odvisen od pogojev celične kulture in frekvence uporabljene obremenitve. Tako ciklični hidrostatični tlak (5 MPa) zmanjšuje vključitev sulfata v hondrocitov monosloja pri frekvenci 0,05, 0,25 in 0,5 Hz, medtem ko pri frekvencah nad 0.5 Hz vključitve sulfata v hrustanca vcepek povečuje.

Bushmann M. S sodelavci (1992) poročajo, da hondrociti v agaroznem gelu Mr. Spremeni biosinteze kot odziv na statične in dinamične mehanske obremenitve, kot tudi gojene nepoškodovano organa. Avtorji so ugotovili, da mehanska obremenitev ustvarja hiperosmotski dražljaj, ki ji sledi zmanjšanje pH v hondrocitih.

Učinek mehanskega raztezanja lahko preučujemo na kulturi celic, potopljenih v gel. Sila raztezanja je mogoče ustvariti z računalniško krmiljenim vakuumom. Ko je sistem v določeno stopnjo vakuuma, ki se dno petrijevko s kulturo celic razširjena z znano količino, ki je največje deformacije na robovih dna kupe in vsaj v sredini. Raztegovanje se prenaša in kultivira v petrijevki kondricitov. S to metodo, Holm-Vall K. Et al (1995) so pokazali, da kultiviramo v kolagen (tipa II) gelsko hondrosarkom celice povečano ekspresijo mRNA in ₂ -integrina. In ₂ p _g integrin se lahko veže na kolagen tipa II. Šteje se, da je mehanoreceptor, ker deluje z proteinom, ki veže aktin, s čimer povezuje ECM in citoskelet.

Vpliv pH na presnovo hondrocitov

PH intersticijske tekočine ECM hrustančnega tkiva je bolj kisel kot v drugih tkivih. A. Maroud (1980) je določil pH sklepnega hrustanca pri 6,9. W. Diamant in soavtorji (1966) so ugotovili pH 5,5 v patoloških pogojih. Znano je, da hondrociti živijo pri nizkih PO2, kar kaže na pomembno vlogo glikolize (95% skupne presnove glukoze) v presnovi teh celic; glikolizo spremlja proizvodnja velike količine mlečne kisline.

Poleg zakisljevanja okolja s produkti glikolize so zelo pomembne matrične komponente. Veliko število stalnega negativnega naboja na zunajcelični proteoglikanov spremeni ionsko sestavo: obstaja visoka koncentracija prostih kationov (npr H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) in nizke koncentracije anionov (npr O2, NPHS). Poleg tega je pod vplivom mehanske obremenitve voda izločena iz ECM, kar vodi k povečanju koncentracije fiksnih negativnih polnitev in privabljanju več kationov v matriko. To spremlja tudi zmanjšanje pH ekstracelularnega medija, ki vpliva na intracelularni pH, s čimer spreminja presnovo hondrocitov. R. Wilkin in A. Hall (1995) so proučevali učinek pH ekstracelularnega in intraceličnega medija na biosintezo matrice z izoliranimi bikondokcitami. Opazovali so dvojno modifikacijo sinteze matriksa z zmanjšanjem pH. Rahlo zmanjšanje pH (7,4 35 S0 ₄ in ³ H-prolina v hondrocitov, ker globlji zakisljevanje (pH <7,1) zavira sintezo za 75% v primerjavi s nadzor. Ustvarjanje enakega nizkega pH-ja (6,65) z amonijevimi ioni je povzročilo zmanjšanje sinteze matriksov za le 20%. Dobljeni rezultati kažejo, da sprememba pH zunajceličnega matriksnega sinteznega medija ni mogoče pojasniti le s spremembami v pH znotrajceličnega medija. Poleg tega, hondrociti imajo sposobnost reguliranja znotrajcelično vrednost pH z Na ⁺ H ⁺ izmenjevalcem, Ca ⁺ -dependent C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS in H ⁺ / ATPaze.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Učinek sestave medija za gojenje na presnovo hondrocitov

Medij za gojenje hondrocitov mora ustrezati eksperimentalnim pogojem. V zadnjih letih je bil za izboljšanje pogojev kulture uporabljen serum za tele. Pri uporabi seruma pa je treba razmisliti o številnih pomembnih točkah:

• zunanja rast celic z obrobja tkiva v organskih kulturah,
• variabilnost sestave serumov različnih serij,
• prisotnost neznanih komponent v njih,
• povečano tveganje motenj, artefakte pri študiji vpliva različnih bioloških dejavnikov na presnovno aktivnost celic.

Primer slednjega je preučevanje učinka EGF na hormonite hrustanca v hrustancah pri podganah. EGF je spodbudil vključitev ³ H-timidina in povečanje vsebnosti DNA v kulturi. Ta učinek je bil izrazitejši pri nizkih koncentracijah v serumu (<1%), vendar je pri visokih koncentracijah (> 7,5%) učinek izginil.

Znano je, da so stopnje sinteze in razgradnje v DMEM, obogatenem s serumom teleja, znatno povečane v primerjavi s pogoji in vivo. Razlike med in vivo in in vitro metabolizmom lahko povzročijo razlike med sinovialno tekočino in okoljem, v katerem so celice kultivirane. D. Lee s sodelavci (1997) smo kultivirali hondrocitov bikcev agaroze z uporabo hranilnega medija, ki vsebuje DMEM, obogaten z 20% telečjega seruma in velikega števila alogensko normalne sinovialne tekočine. Prisotnost sinovialne tekočine v mediju je povzročila povečanje števila proteoglikanov, do 80% celotne količine sinovialne tekočine. Dobljeni rezultati kažejo, da sinovialna tekočina v kulturi povzroči hitrost presnove, podobno tisti v in vivo, z visoko stopnjo sinteze glikozaminoglikanov in nizko stopnjo celične delitve.

G. Verbruggen s sodelavci (1995) so pokazali, da je sinteza ³⁵ je S-arrpeKaHa človekovih hondrocitov kultivirali v agaroze v DMEM brez seruma 20-30% ravni sinteze opazili v DMEM, dopolnjen z 10% telečjim serumom. Avtorji so ugotovili, v kolikšni meri IGF-1, IGF-2, TGF-P ali insulin obnovi proizvodnjo aggrecana v medijih brez seruma. Avtorji ugotovila, da 100 ng / mL insulina, IGF-1 ali IGF-2 delno zmanjšane sinteze agrekana na 39-53% ravni nadzora. S kombinacijo teh dejavnikov niso bili ugotovljeni sinergijski ali kumulativni pojavi. Istočasno, 10 ng / ml TGF-P v prisotnosti 100 ng / ml insulina stimulira sintezo agrekana do 90% ali več od referenčne višine. Na koncu serumski transferrin, sam ali v kombinaciji z insulinom, ni vplival na sintezo aggrecana. Ko je bil serum za tele zamenjal goveji serumski albumin, je bila vsebnost agregata v agreganu znatno zmanjšana. Obogatitev medija za insulinsko kulturo, IGF ali TGF-P je delno obnovila sposobnost celic za proizvodnjo agregatov aggrecan. V tem primeru lahko IGF-1 in insulin vzdržujejo homeostazo v celičnih kulturah. Po 40 dneh gojenja v mediju, dopolnjenem z 10-20 ng / mL IGF-1, je proteoglikan sinteza vzdržujemo pri isti ravni ali celo višja v primerjavi s medij, ki vsebuje 20% telečjega seruma. Katabolni procesi počasi napreduje v mediju, dopolnjenem z IGF-1, kot v mediju dopolnjenem z 0,1% raztopino albumina, vendar nekoliko hitrejša v mediju, dopolnjenem z 20% seruma. V dolgoživih kulturah, 20 ng / ml IGF-1 ohranja stabilno stanje celic.

D. Lee s sodelavci (1993) so primerjali vpliv sestave gojišča kulture (DMEM, DMEM + 20% telečjega seruma, DMEM + 20 ng / mL IGF-1) na sintezo DNA v kulturi eksplant hrustanca, enoplastni kulturi in v suspenziji v agaroze . Ko gojili v agaroze v prisotnosti seruma avtorjev opazili tendenco skupino hondrocitov v večjih koncentracijah. Celice gojimo brez seruma in z IGF1, ohrani krožno obliko iz agaroze, zberemo v majhnih skupinah, vendar se ne tvorijo velikih agregatov. V monosloja je sinteza DNK v mediju, ki vsebuje serum bistveno višja kot v mediju dopolnjenem z IGF-1; Sinteza DNK v slednjem je bila precej višja kot v neizogibnem okolju. Ko gojenje hondrocitov v suspenziji v agaroze v nekoncentriranem mediju in v mediju z IGF-1, ni razlike v sintezo DNA. Hkrati gošča gojenje hondrocitov v agaroze v mediju, dopolnjenem s serumom, je spremljalo povečano vključevanje radionucleotide ³ H-timidina v primerjavi z drugim okoljem.

Vitamin C je potreben za aktiviranje encimov, ki sodelujejo pri nastajanju stabilne spiralne strukture kolagenskih fibrilov. Kondrocite, pomanjkljivi glede na askorbinsko kislino, sintetizirajo premajhne hidroksilirane nekvične predhodnike kolagena, ki se počasi izločajo. Uvedba askorbinske kisline (50 μg / ml) povzroča hidroksilacijo kolagenskih vrst II in IX ter njihovo izločanje v normalnih količinah. Dodatek vitamina C ni vplival na stopnjo sinteze proteoglikanov. Zato se izločanje kolagena regulira neodvisno od izločanja proteoglikanov.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]