Zarodne matične celice

Odkritje embrionalnih matičnih celic ni nastalo po naključju, temveč se je pojavilo na pripravljenih tleh znanstvenih raziskav na področju razvojne biologije. Izraz »matična celica« je v medicino leta 1908 na kongresu hematološkega društva v Berlinu uvedel Aleksander Maksimov v povezavi s hematopoetskimi celicami. Že dolgo pred izolacijo in proizvodnjo stabilnih linij pluripotentnih embrionalnih matičnih celic so bile matične terato-(embrio-karcinomske) celice uporabljene v študijah zgodnjih razvojnih procesov, s pomočjo katerih so preučevali neznane mehanizme embriogeneze, vključno z zaporedjem izražanja zgodnjih genov in beljakovinskih produktov njihove aktivnosti.

Toda ali je totipotentnost človeškega genoma v procesu evolucije nepovratno izgubljena? Ne, in embriogeneza je dokaz za to. Če je temu tako, kdaj se bo potem načeloma uresničila druga pot evolucijskega razvoja? Verjetno, ko bo človek vstopil v vesolje, kjer bodo okoljski pogoji dovolj dolgo relativno konstantni. Izguba kostnega tkiva (demineralizacija kosti v stanju breztežnosti), ki je zelo počasi podvrženo preoblikovanju in regeneraciji, se lahko šteje za prvi korak v procesu prilagajanja človeka kot vrste na obstoj v vesoljskih razmerah. Vendar bo cena za drugo pot evolucijskega razvoja drugačna - cena za vrnitev totipotentnosti in absolutne plastičnosti vsem celicam bo sterilnost. Torej se bomo v tem svetu "evolucijskih kameleonov" morali razmnoževati brez mejoze, z brstenjem. Živeli pa bomo dolgo. Telomerazna nesmrtnost je nesmrtnost amebe. V večceličnem organizmu so matične celice substrat kvantitativne in kvalitativne dolgoživosti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Viri embrionalnih matičnih celic

Danes so viri embrionalnih matičnih celic za laboratorijske raziskave mišje linije teratokarcinoma (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) in človeški teratokarcinom (NTERA-2, TERA-2, klon H-9), pa tudi linije Trauneon ESC. Vendar pa razpoložljivost podrobnega celičnega potnega lista, ki prikazuje imunski fenotip, rezultate kromosomske analize, profile izražanja mRNA, izpostavljene receptorje in znotrajcelične signalne beljakovine, ne nadomesti pomembnih pomanjkljivosti linij ESC teratokarcinoma - hitre izgube totipotentnosti in nezmožnosti njihove uporabe v kliničnih preskušanjih, medtem ko mešana diferenciacija v kulturi zelo otežuje izolacijo čiste specializirane linije iz heterogene celične populacije. Zato je vir linij ESC, ustvarjenih za klinične namene, običajno notranja celična masa blastociste, posamezni blastomeri 8-celičnih zarodkov, celice morule kasnejših stopenj, pa tudi primordialne zarodne celice.

Treba je opozoriti, da imajo teratokarcinomske celice, čeprav imajo lastnost pluripotence, bistveno nižji pluripotentni potencial v primerjavi z embrionalnimi matičnimi celicami (ESC). Njihova integracija z embrionalnimi celicami redko vodi do nastanka himer, ki poleg tega nikoli ne tvorijo gamet z genotipom teratokarcinomskih celic. Domneva se, da je to posledica pogostega pojavljanja kromosomskih nepravilnosti med gojenjem teratokarcinomskih celic: izguba kromosoma Y, različne trisomije, delecije ali translokacije.

Poskusi izolacije linije človeških ESC so bili večkrat izvedeni, vendar ta naloga ni bila rešena, saj so normalne človeške blastociste težko dostopne. Poleg tega je pogostost kromosomskih nepravilnosti pri ljudeh višja kot pri živalski embriogenezi. Velika večina zgodnjih človeških zarodkov, pridobljenih po oploditvi in vitro, kaže kaotičen kromosomski mozaicizem in pogosto imajo numerične in strukturne aberacije. Tudi kasneje, v fazi blastociste, le 20–25 % človeških zarodkov sestavljajo celice z normalnim kariotipom. Takšne zarodke je bilo praktično nemogoče uporabiti za ustvarjanje ESC, saj so zigote običajno gojili do stopnje dveh ali štirih blastomer in nato presadili v maternico. Šele relativno nedavno je bila razvita zanesljiva tehnika za gojenje oplojenih človeških jajčec do stopnje blastociste. Uvedba te tehnike v prakso oploditve in vitro ni le povečala pogostosti uspešnih izidov implantacije, temveč je tudi normalne blastociste naredila dostopnejši objekt.

Drug vir pluripotentnih matičnih celic so primordialne zarodne celice, ki za razliko od naprednejših progenitorskih populacij zarodnega epitelija na svoji površini nimajo beta-integrina, vendar izražajo visoko aktivnost alkalne fosfataze. Treba je opozoriti, da se populacije matičnih celic, ki so nastale iz primordialnih zarodnih celic, eksperimentalno preučujejo že od osemdesetih let prejšnjega stoletja. Takrat je bila razvita tehnika za izolacijo primordialnih zarodnih celic iz začetkov gonade mišjega zarodka. Prvi neuspešni rezultati gojenja primordialnih zarodnih celic in vitro so nakazovali na nesmiselnost teh poskusov, saj celice, čeprav so preživele, niso proliferirale in so umrle v prvem dnevu. Kasneje je bilo ugotovljeno, da se mišje primordialne zarodne celice in vitro razmnožujejo le v prisotnosti topnih in membransko vezanih specifičnih polipeptidnih rastnih faktorjev v gojišču. Rezultati številnih študij so pokazali, da je za preživetje in proliferacijo primarnih zarodnih celic potrebna prisotnost ne le LIF, temveč tudi membransko vezanih in topnih Steel faktorjev (SIF) v gojišču. Te peptide proizvajajo somatske celice zarodkov, homozigotnih za Steelovo mutacijo, eden od njih pa je ligand protoonkogena cKit.

Primarne zarodne celice sesalcev in ljudi imajo ekstragonadalni izvor in so vir klonskega razvoja linije zarodnih celic. Izvor primordialne linije zarodnih celic, pa tudi vseh embrionalnih tkiv in ekstraembrionalnega mezoderma, je epiblast (primarni ektoderm) zgodnjih zarodkov, ki ima mozaično strukturno organizacijo. Z metodo mikrokirurške odstranitve različnih delov zgodnjega zarodka je bila v epiblastu določena lokalizacijska cona klona zavezanih predhodnikov primordialnih zarodnih celic. Z uporabo rodamin dekstrana, ki je bil uporabljen kot celični marker, je bilo ugotovljeno, da so predhodniki primordialnih zarodnih celic lokalizirani v proksimalnem predelu epiblasta, v bližini ekstraembrionalnega ektoderma. Primordialna linija zarodnih celic nastane iz 45-celičnega klona, katerega dodelitev se pojavi na samem začetku gastrulacije. Nato se klon loči in med gastrulacijo primarne zarodne celice vstopijo v ekstraembrionalni mezoderm in se nahajajo na dnu alantoisnega rudimenta, za primarno progo. Od tam se primarne zarodne celice selijo proti ventralnemu delu endoderma zadnjega črevesa in se nato aktivno premikajo vzdolž mezenterija ter na koncu migracije naseljujejo genitalne grebene. Med migracijo, pa tudi v prvih 2-3 dneh po lokalizaciji v gonadnem rudimentu, se primarne zarodne celice aktivno razmnožujejo in opravijo osem replikacijskih ciklov. Če je na začetku migracije približno 50 primarnih zarodnih celic, potem v genitalnih grebenih mišjih zarodkov dvanajst dni razvoja število primarnih zarodnih celic presega 25.000.

Funkcionalno podobnost ESC in primordialnih zarodnih celic dokazuje popolna integracija slednjih v blastocisto z nadomestitvijo notranje celične mase in poznejšim polnopravnim razvojem zarodka, katerega tkiva sestavljajo le potomci primordialnih zarodnih celic. Tudi pri drugih lastnostih so se mišje primordialne zarodne celice izkazale za identične ESC, saj so pokazale sposobnost diferenciacije v različne smeri, tvorbe embrioidnih teles in vitro ter tvorbe teratomov in vivo, ko so jih dajali subkutano imunsko pomanjkljivim mišim, kar je podobno spontanim testikularnim teratomom pri miših 129/ter.

Ugotovljeno je bilo, da ko se v medij dodajo LIF, membransko vezan in topen SIF, izolirane primarne zarodne celice 8 dni starih mišjih zarodkov preživijo in se razmnožujejo v kulturi 4 dni, nato pa umrejo. Poleg tega obdobje, ko v kulturi opazimo smrt primarnih zarodnih celic, sovpada s stopnjo razvoja mišjih zarodkov (12,5–13,5 dni), ko ženske primarne zarodne celice vstopijo v mejozo v zametkih gonad, mitotične delitve pa so blokirane v moških primarnih zarodnih celicah. Če pa se v medij dodajo ne le rastni faktorji LIF in SIF, temveč tudi FGF2, se primarne zarodne celice še naprej razmnožujejo in v subkulturah nastanejo kolonije celic, ki se lahko razmnožujejo tudi po odstranitvi rastnih faktorjev (SIF in FGF) iz medija. Takšne celice je mogoče dolgo časa gojiti na substratu embrionalnih fibroblastov brez dodajanja topnega rastnega faktorja LIF. Predlagano je bilo, da se te stabilne celične linije, pridobljene iz primordialnih zarodnih celic, imenujejo embrionalne zarodne celice. Ta izraz sploh ni uspešen, saj je pri gojenju EG celic nemogoče pridobiti embrionalne zarodne celice, ki bi bile sposobne izvajati nadaljnje faze oogeneze ali spermatogeneze. To je posledica dejstva, da celične linije EG, čeprav izvirajo iz primordialnih zarodnih celic, v kulturi pridobijo lastnosti embrionalnih pluripotentnih matičnih celic, vendar izgubijo sposobnost vezave na zarodne linije. Z drugimi besedami, primordialne zarodne celice pri gojenju izgubijo lastnosti predhodnikov gamet in se transformirajo v pluripotentne celice, podobne ESC.

Ugotovljeno je bilo, da teratomi ne nastanejo, ko se celice EG vnesejo v imunsko pomanjkljive miši. Domneva se, da je izguba sposobnosti človeških celic EG za nastanek teratomov posledica dejstva, da te linije niso bile ustvarjene neposredno iz gojenih primarnih zarodnih celic, temveč so bile pridobljene iz celic, izoliranih iz embrioidnih teles. Zato je možno, da so potomci pluripotentnih, a že dedovanih celic.

Treba je opozoriti, da obstajajo temeljne razlike med celicami EG in primordialnimi zarodnimi celicami. Slednje ne omogočajo pridobivanja himernih mišjih zarodkov, kar kaže na pomanjkanje sposobnosti primordialnih zarodnih celic za integracijo v notranjo celično maso oziroma trofektoderm. Značilnosti populacije primordialnih zarodnih celic so bolj podobne zavezanim linijam somatskih celic kasnejših zarodkov, katerih vnos v blastocisto prav tako ne vodi do nastanka himernih zarodkov.

Sprememba tehnike gojenja embrioidnih teles, pridobljenih z agregacijo EG celic, je omogočila pridobitev druge populacije pluripotentnih celic, imenovanih "celice, pridobljene iz embrioidnih teles" (EBD celice), z uporabo selekcije na selektivnih gojiščih. Sposobnost EBD celic, da se dolgo razmnožujejo v kulturi, je omogočila ustvarjanje stabilnih celičnih linij zavezanih celic. Pridobljeni so bili kloni celic, ki izražajo širok spekter mRNA in beljakovinskih markerjev specializiranih celic. Ta pristop je na koncu dokazal, da so človeške primarne zarodne celice pluripotentne in se in vitro diferencirajo v različne tipe celic: nevrone, nevroglijo, žilni endotelij, hematopoetske celice, mišične in endodermalne celice.

Alternativni viri embrionalnih matičnih celic

Alternativni vir linij človeških ESC so lahko hibridne celice. Vsaditev heterogenega konstrukta, pridobljenega s fuzijo z elektroporacijo somatskih celic človeškega ploda s kravjim jajcem, iz katerega je predhodno odstranjen pronukleus, v maternico psevdobrejih krav omogoča pridobitev notranje celične mase iz umetnega zarodka predimplantacijskih stopenj razvoja. V ta namen se v prvi fazi iz kravjega jajca pridobi blastocista s presajenim jedrom človeške celice.

V drugi fazi se iz blastociste izolira embrioblast, iz njega pa se z uporabo Thomsonove metode izolirajo ESC. Omeniti velja, da so bili najboljši rezultati pri izolaciji linij ESC s to metodo doseženi z uporabo jeder folikularnih celic ali primarnih zarodnih celic, ki ostanejo v človeškem telesu v stanju hibernacije. To je posledica dejstva, da morajo imeti jedra človeških celic, presajenih v kravje jajčece, neskrajšane telomere in visoko telomeazno aktivnost, kar pomaga preprečiti prezgodnje staranje klonov ESC, pridobljenih iz hibridnega jajčeca (Repin, 2001). Znano je, da so najpomembnejši znotrajcelični markerji ESC Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, ki spadajo med tako imenovane proteine utišatelje kromatina. Utišatelje zagotavljajo posebej kompaktno embalažo heterokromatina, ki preprečuje nastanek evkromatinskih zank. Pakiranje kromatina, ki ga posredujejo ti proteini, je povezano s totipotentnostjo genoma ESC. Do danes je bilo ugotovljeno, da so zrele goveje in človeške oocite edina vrsta specializiranih celic, ki v citoplazmi vsebujejo visoke koncentracije proteinov utišalcev. Na tej podlagi je bila razvita metoda za pridobivanje hibridnih ESC s prenosom jeder somatskih celic v enukleirane goveje oocite. Predhodne študije in vitro so pokazale, da citoplazma govejih oocitov po 12–24 urah gojenja obnovi totipotentnost genoma jeder človeških somatskih celic.

Posebej zanimivi so podatki o posebnostih predimplantacijskega razvoja človeških zarodkov, ki kažejo na kasnejšo zamenjavo totipotentnih celic s populacijo pluripotentnih celic kot pri miših. Študija celičnih transformacij je pokazala, da poleg ESC iz celic notranje celične mase človeških blastocist nastanejo tudi trofoblastne celice, kar kaže na njihovo skupno potenco.

Znano je, da v fazi blastociste nastaneta dve različno vezani celični populaciji. Ena od njih tvori zunanjo plast blastociste - trofektoderm, katerega derivati so trofoblastne celice in druge embrionalne komponente posteljice. Druga populacija celic je združena v gosto maso, ki se dotika notranje površine trofektoderma. Derivati populacije celic notranje celične mase so vsa tkiva in začetki organov zarodka. V fazi pozne blastociste se iz notranje celične mase oblikuje ekstraembrionalni endoderm in nastane epiblast (primarni ektoderm). V tem primeru epiblastne celice ohranijo pluripotentnost, medtem ko je sposobnost diferenciacije celic ekstraembrionalnega endoderma omejena.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Pridobivanje človeških embrionalnih matičnih celic

Do nedavnega je veljalo prepričanje, da je nemogoče pridobiti ESC iz trofoblasta. Vendar pa se linija diploidnih trofektodermnih matičnih celic, izoliranih iz blastociste, razmnoži in transformira v matične celice v gojišču, ki vsebuje FGF2 in heparin namesto LIF. Če FGF2 odstranimo iz gojišča, se trofektodermne celice prenehajo množiti, v njih se začne endoreduplikacija kromosomov in celični elementi trofektoderma se postopoma transformirajo v orjaške trofoblastne celice. Verjetno LIF ne spodbuja proliferacije trofektodermnih celic, ker FGF2 sproži drugačen mehanizem transsignacije, saj FGF2, ki se veže na plazemski receptor (FGFR2), aktivira MAP kinaze v citoplazmi - ERK1 in ERK2. Posledično se ob aktivaciji ene signalne poti (LIF - gpl30 - JAK kinaza - STAT3) v celicah blastociste celice notranje celične mase transformirajo v pluripotentne ESC, ob aktivaciji drugega mehanizma transmembranske signalne transdukcije (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaza ERK1/ERK2) pa se v blastocisti tvorijo trofektodermne matične celice. Izbira signalne poti pa je odvisna od aktivnosti gena oct4. Ta gen, ki spada v domeno POU, se nahaja v lokusu t avtosoma 17 in se izraža med oogenezo, med obdobjem cepitve, pa tudi v celicah notranje celične mase blastociste in v primarnih zarodnih celicah. Funkcionalna vloga gena oct4 je kodiranje transkripcijskega faktorja, potrebnega za nastanek pluripotentnih celic, njihovo diferenciacijo in dediferenciacijo.

Izražanje gena oct4 v embrionalnih matičnih celicah (ESC) se spreminja glede na interakcijo tega transkripcijskega faktorja s kofaktorji. Usmerjena regulacija izražanja oct4 v blastocistah je pokazala, da ko je njegova aktivnost zmanjšana, polovica celic tvori trofektoderm, medtem ko ko se inducirana ekspresija oct4 poveča, nastanejo pretežno ESC.

V poskusu ESC ni mogoče prenesti v linijo med gojenjem totipotentnih blastomerov v fazi cepitve, pa tudi v fazi gastrulacije in kasnejših fazah embrionalnega razvoja. Mišje ESC običajno izoliramo 3,5-4,5 dneva nosečnosti, kar ustreza šesti (enoslojna blastocista) in sedmi fazi (dvoslojna blastocista - zgodnji jajčni valj) normalne embriogeneze. Očitno mišji zarodki vsebujejo celične populacije, ki se lahko transformirajo v ESC, le v predimplantacijskem obdobju. Posledično je izolacija linij ESC mogoča le v določenih fazah embriogeneze. Zigota in blastomeri, ki nastanejo med cepitvijo, so totipotentni z vidika možnosti razvoja sposobnega zarodka z embrionalnimi membranami in posteljico. Izguba celotne potencialnosti zarodnih celic se začne v pozni fazi morule, ko je nadaljnja zavezanost blastomerov odvisna od njihove lokacije. Zgodnji blastomeri morule ohranijo totipotentnost, saj eksperimentalne manipulacije s spremembami njihove lokalizacije, kot je inverzija njihove lokacije, ne preprečijo razvoja polnopravnega zarodka.

Ugotovljeno je bilo, da na učinkovitost izolacije embrionalnih matičnih celic (EMC) v linijo vpliva stanje blastocist v času njihove eksplantacije. Uporaba blastocist po modeliranju sedemdnevne diapavze v reproduktivnem traktu miši, ki so jim 3,5 dneva nosečnosti odvzeli jajčnike in so jim dali progesteron, omogoča uspešnejšo izolacijo linij embrionalnih matičnih celic. Domneva se, da se v takih pogojih poveča število blastomerov, ki tvorijo notranjo celično maso. Možno je tudi, da se celični cikel podaljša in večina blastomerov vstopi v fazo G0.

Poleg tega je nastanek stabilnih pluripotentnih linij ESC odvisen od genotipa zarodkov: ESC je dokaj enostavno izolirati iz blastocist mišje linije 129, veliko težje jih je pridobiti z mišmi CS7BL/6, praktično pa je nemogoče izolirati linijo ESC iz blastocist miši CBA/Ca. Očitno imajo zgodnji zarodki nekatere genetske značilnosti, ki vplivajo na razvoj pluripotentne linije ESC. Kljub temu so bile pri gojenju izoliranih epiblastov, pa tudi s selektivno selekcijo diferenciacijskih celic, linije ESC kljub temu izolirane iz zgodnjih zarodkov miši CBA/Ca.

Preizkušena standardna tehnika za pridobivanje linij ESC iz blastocist je podana v laboratorijskih priročnikih o tehniki poskusov z zgodnjimi zarodki. Eksperimentalne linije ESC je mogoče pridobiti tudi z gojenjem izoliranega epiblasta (primarnega ektoderma) 4,5 dni starih mišjih zarodkov z uporabo precej kompleksne mikrokirurške tehnike in spremenjenih pogojev gojenja. Delovna intenzivnost tega postopka je upravičena, saj se je pogostost nastajanja linij ESC v tem primeru izkazala za bistveno višjo kot pri delih z notranjo celično maso blastociste.

Za izolacijo linij ESC se vsak klon prenese v mikrovdolbinico, kjer se vzgoji agregat 40–60 celic in nato ponovno dispergira. Večkratne ponovitve tega postopka nam omogočajo, da dobimo imortalizirano linijo ESC z največjo stopnjo proliferacije normokariotipskih celic, pritrjenih na plastiko, ki po 50–100 pasažah ohranijo totipotentnost in visoko telomerazno aktivnost. V procesu vzdrževanja linij ESC je največja nevarnost kontaminacija gojišča ali seruma z bakterijskimi endotoksini – že sledi endotoksina v gojišču povzročijo množično smrt nezrelih zarodnih celic. S skrbnim spremljanjem linearne rasti in pravočasno disperzijo so ESC v kulturi sposobne simetrične delitve, pri kateri obe hčerinski celici ostaneta pluripotentni in sposobni izvajati neomejeno število celičnih ciklov, pri čemer ohranjata diploidni kariotip in skupno potenco.

Selekcijo čiste populacije človeških ESC je mogoče izvesti po transfekciji njihovega genoma z rekombinantnimi molekulami DNA, ki vsebujejo gen, ki kodira sintezo zelenega fluorescentnega proteina (GFP). Izražanje GFP se poveča, ko ESC gojimo v pogojih, ki podpirajo njihovo proliferacijo, medtem ko se z začetkom diferenciacije raven izražanja tega gena zmanjša, kar omogoča selekcijo čistih stabilnih pluripotentnih celičnih linij na selektivnem gojišču. Pri gojenju ESC, izoliranih z uporabo selekcije GFP, se pogostost nastajanja kolonij večkrat poveča, saj se močan antiproliferativni učinek diferenciranih celic v pogojih selekcijskih kultur odpravi.

Prevajanje človeških embrionalnih matičnih celic v linijo se izvede z metodo njihove izolacije iz predimplantacijskih zarodkov (v fazi 80-120 celic), ki ostanejo po postopku oploditve in vitro. V ta namen se umetno pridobljeni "presežni" zarodki mehansko dispergirajo v Delbecco-Eagleovem mediju. Po označevanju celic s selektivnimi monoklonskimi protitelesi s fluorescentnim označevalcem se izolirajo embrioblastne celice. Embrioblast se dispergira v posamezne celice z uporabo mešanice dispaze in kolagenaze. Disociirane celice se gojijo v posebnem mediju (80 % Delbeccov medij + 20 % fetalnega telečjega seruma v prisotnosti 500 μg/ml IL-6, LIF in SCF) preko hranilne monosloje embrionalnih fibroblastov prvih 3 pasaž. V tem primeru se preživetje in proliferacija matičnih in progenitorskih celic ohrani zaradi učinka IL-6, LIF in SCF. V takšnem gojišču ESC rastejo kot suspenzijski kloni nepritrjenih zgostih celic, ki jih je treba disociirati z mehkim, ponavljajočim se pipetiranjem. Novi kloni se v suspendirani kulturi pojavijo 5. do 7. dan. Največja stopnja rasti ESC se doseže s ponavljajočo se disociacijo klonov v fazi 10-15 celic. Nato se vsak klon prenese v mikrovdolbinico in goji do agregata 40-50 celic. Postopek se večkrat ponovi v pasažah, s čimer se volumen kulture poveča na gostoto 5-10 milijonov celic na 6-cm ploščo. S takim pasiranjem je Thomson izoliral 10 nesmrtnih klonov človeških ESC, ki so po 100 pasažah ohranili visoko telomerazno aktivnost, sposobnost močnega razmnoževanja, minimalne fenotipske značilnosti in skupno potenco s sposobnostjo diferenciacije v katero koli od 350 specializiranih celičnih linij, ki izhajajo iz ekto-, mezo- in endoderma. Diferenciacija človeških ESC se je začela (po spremembi medija, dodatku seruma in izločitvi LIF) s pritrditvijo celic na substrat, kar kaže na razvoj citoskeleta in izražanje adhezijskih receptorjev. Pomembno je, da so človeške ESC z neomejeno proliferacijo ohranile normalen kariotip.

Druga metoda izolacije linij človeških ESC temelji na uporabi primarnih zarodnih celic. Eksperimentalne študije so pokazale, da je mogoče linije celic E pridobiti iz genitalnih gub 12,5 dni starih mišjih zarodkov. Vendar pa je bila v teh primerih pogostost nastajanja linij progenitorskih celic bistveno nižja kot v poskusih s starejšimi zarodki. Hkrati se primarne zarodne celice iz gonad mišjih zarodkov, starih 13,5 dni, sploh ne morejo preoblikovati v linije.

Prve stabilne linije pluripotentnih človeških EG celic so bile pridobljene iz primarnih gonocitov, izoliranih iz gonad 5-9 tednov starih zarodkov. Izolirane celice so gojili na substratu inaktiviranih mišjih embrionalnih fibroblastov v DMEM mediju s fetalnim serumom, dopolnjenim z merkaptoetanolom, forskolinom in rekombinantnimi človeškimi rastnimi faktorji (FGF in LIF). Po 7-12 dneh so se v kulturi pojavile večcelične kolonije, ki so po morfoloških značilnostih in molekularnih markerjih ustrezale človeškim EG celicam. Po agregaciji so te celice tvorile embrioidna telesca, z nadaljnjim razvojem katerih so se pojavile specializirane celice, značilne za derivate vseh treh zarodnih plasti. V 10-20 pasažah so EG celične linije ohranile normalen kariotip in niso izgubile pluripotence.

Dokazano je tudi, da kombinirano delovanje LIF, membransko vezanih in topnih Steel faktorjev ter TGF-β spremeni razvojni program primordialnih zarodnih celic. Namesto da bi prenehale z mitotičnimi delitvami in se začele diferencirati v smeri oogeneze ali spermatogeneze, primordialne zarodne celice še naprej proliferirajo. Po več dodatnih mitotičnih ciklih postanejo podobne epiblastnim celicam in se, izgubijoč lastnosti predhodnikov zarodnih celic, transformirajo v pluripotentne embrionalne matične EG celice.

Tako so bile leta 1998 iz genitalnega rudimenta tkiva človeškega ploda, pridobljenega obdukcijo, prvič izolirane immortalizirane linije primordialnih zarodnih celic. V človeški embriogenezi se primordialne zarodne celice pojavijo v rumenjakovi vrečki v 3. tednu razvoja, v 4. do 5. tednu pa te celice migrirajo v cono genitalnega tuberkula, kjer tvorijo mirujoče populacije primarnih gonocitov. V neaktivnem stanju se primordialne zarodne celice ohranijo v zarodku do rojstva. Linije primordialnih zarodnih celic so izolirane iz fetalnega genitalnega tuberkula 5-9 tednov starih zarodkov, katerih ekstrahirano tkivo se ex tempore obdela z mešanico kolagenaz tipov IV-V, hialuronidaze in DNaze, da se poveča kvantitativni in kvalitativni izkoristek celic. Primordialne zarodne celice v tkivu fetalnega genitalnega tuberkula so obdane s stromalnimi (mezenhimskimi) Sertolijevimi celicami. Funkcionalni namen Sertolijevih celic je proizvodnja antiapoptotičnih faktorjev (Fas ligand), mitogenov in imunosupresivov, ki ščitijo zarodne celice pred imunskim napadom telesa. Poleg tega ima stromalno mikrookolje genitalnega tuberkula pomembno vlogo pri zorenju gamet. Izolirane primarne zarodne celice so posajene v kulturi čez hranilno stromalno plast, ki jo sestavljajo fetalni fibroblasti prvih treh pasaž. Najučinkovitejša kombinacija mitogenov je kompleks, ki ga sestavljajo LIF, FGF in forskolin (stimulator tvorbe cAMP). Proliferacija primarnih zarodnih celic in vitro zahteva dodatek fetalnega seruma, v prisotnosti katerega razmnoževanje primarnih gonocitov v kulturi spremlja tvorba klonov sferičnih celic, ki niso pritrjene na substrat.

Na Nacionalnem inštitutu za zdravje v ZDA so na podlagi povzetka obstoječih podatkov o metodah za izolacijo linij človeških matičnih celic (EMC) iz blastocist sprejeli predhodni sklep, da je uspešna izolacija ESC najverjetnejša pri gojenju blastocist z dobro oblikovano notranjo celično maso (Matic cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). S tega vidika je optimalen vir ESC za ustvarjanje linij človeške blastociste 5. dan razvoja, iz katerih je treba pri izolaciji notranje celične mase skrbno odstraniti trofektoderm. Izolirano notranjo celično maso, ki v tej fazi sestavlja 30-35 celic, je treba gojiti na substratu embrionalnih mišjih fibroblastov, kar je odločilni pogoj za nastanek kolonij ESC v kulturi.

Analiza fenotipskih značilnosti embrionalnih matičnih celic

Posebej zanimiva je medvrstna primerjalna analiza fenotipskih značilnosti matičnih celic (ESC). Ugotovljeno je bilo, da so kolonije človeških ESC gosti skupki sploščenih, epiteliju podobnih celic, medtem ko mišja embrioidna telesa sestavlja rahel konglomerat zaobljenih celic. V človeških ESC je indeks razmerja med jedrom in plazmo nižji kot v mišjih ESC. Embrionalne matične celice opic tvorijo bolj sploščene kolonije celic z neenakomernimi robovi. Posamezne celice so v zgodnjih klonih primatov ESC dobro vidne. Proliferirajoče ESC vseh preučevanih živalskih vrst ne izražajo molekul MHC razreda I in II. Hkrati človeške ESC pozitivno reagirajo na protitelesa TERA 1-60 in GCTM-2, kar kaže na prisotnost proteoglikanov keratin/hondroitin sulfat na njihovi površini, značilnih za matične celice embrio-(terato)-karcinoma. Izražanje gena oct4 v ESC vseh živalskih vrst kaže, da je kljub fenotipskim razlikam v človeških in mišjih ESC očitno aktiviran isti nabor genov, odgovornih za ohranjanje pluripotence (Peru, 2001). Poleg tega imajo linije ESC, izolirane iz zarodkov podgan, prašičev, kuncev, primatov in goveda, podobne morfološke značilnosti, podoben nabor molekularnih identifikacijskih markerjev in skoraj enak molekularni mehanizem za izvajanje programov embriogeneze, kar nam omogoča nov pogled na problem ksenotransplantacije.

Za razliko od normalne embriogeneze in vivo proliferacije embriogenez (ESC) in vitro ne spremlja nastanek zarodnih plasti in se pojavlja na ozadju blokiranja homeotičnih Hox genov, tj. brez organogeneze. Ker segmentacijski geni ne delujejo, je v kulturi ESC nemogoče reproducirati takšna obdobja embriogeneze, kot so polaganje somitov, segmentacija zarodka, nastanek rumenjakove vrečke, alantoisa in drugih začasnih organov in tkiv. Zdi se, da so gojene ESC zamrznjene na začetku procesa nastajanja 350 restrikcijskih linij specializiranih celic. Tako klon hčerinskih progenitorskih celic in centralno lokalizirana ESC predstavljata le model zarodka, med razvojem katerega se hkrati v različnih tkivnih regijah tvorijo različne linije specializiranih celic, ki pa izvirajo iz skupnih predhodnikov. Kljub minimalni ravni receptorjev na površini ESC ohranjajo sposobnost izvajanja primitivnih morfogenetskih procesov, ki posnemajo volumetrične strukture zgodnjega zarodka: suspenzija ESC v kulturi se agregira in tvori strukture, ki spominjajo na blastociste ali celo kasnejše zarodke (jajčne valje). Takšni suspenzijski agregati se imenujejo preprosta in kompleksna embrioidna telesca.

Pri mešani diferenciaciji se zgodnji geni ektoderma (oct3, fgf-5, nodal), endoderma (gata-4), mezoderma (brachyury), kardiogenega mezoderma (pkh-2.5), nevralne cevi (msx3) in hematopoeze (elkf) hkrati izražajo v različnih celicah enega embrioidnega telesa. Z uporabo različnih kombinacij rastnih faktorjev in citokinov za ciljno usmerjeno delovanje na nastanek celic zarodne plasti in vitro je bilo v številnih primerih mogoče pridobiti embrioidna telesa, v katerih so bili prednostno izraženi geni ektoderma ali mezoderma, kar odpira pot modeliranju gastrulacije in začetnih faz organogeneze.

Klonska rast ESC je dokaz asimetrične celične delitve, pri kateri le en ESC v središču klona ohrani neomejen proliferacijski potencial, medtem ko druga hčerinska celica ustvari generacijo progenitorskih celic, ki so že v procesu diferenciacije. Zato je stopnja proliferacije klonov na obrobju embrioidnega telesa višja kot v središču. Marginalne celice rastočega klona se spontano neurejeno diferencirajo, migrirajo ali umrejo zaradi apoptotičnih mehanizmov. Ti dogodki določajo usodo klona: če stopnja proliferacije preseže stopnjo migracije in apoptotične celične smrti, se klon še naprej povečuje, stabilizacija se pojavi, ko sta stopnja apoptoze in stopnja nastajanja novih celic enaki, regresija pa se pojavi, ko je razmerje teh procesov obratno. Progenitorske celice se delijo simetrično, tj. obe hčerinski celici se nato diferencirata v zrele specializirane celične linije. Razmerje med ESC in progenitorskimi celicami se spreminja, vendar je število ESC vedno le delček odstotka populacije progenitorskih celic. Zato lahko le skrbno pipetiranje in pravočasna disagregacija klonov poveča število ESC v kulturi. Razgradnja klonov v fazi 10-12 celic se je izkazala za najučinkovitejšo za doseganje največjega izkoristka ESC. Smer in stopnja diferenciacije celic v embrioidnem telesu sta odvisni od njihove lokacije. Zunanje celice embrioidnega telesa ne izražajo gena oct4 in se diferencirajo v celice primarnega endoderma, iz katerega se nato oblikujejo epiteliju podobne celice parietalnega in visceralnega ekstraembrionalnega endoderma. Notranje celice embrioidnega telesa izražajo gen oct4 in ohranijo pluripotentnost 48 ur gojenja. Vendar se kultura nato morfološko preoblikuje v epitelijski monosloj in začne se izražanje genov, ki nadzorujejo razvoj primarnega ektoderma. Nato se začne proces popolne neurejene citodiferenciacije s pojavom različnih tipov celic, ki so derivati vseh treh zarodnih plasti. V procesu spontane diferenciacije celic embrioidnega telesa se najprej pojavijo agregati z endodermnimi markerji v obliki fragmentov (cist) rumenjakove vrečke. Nato se v teh strukturah pojavijo angioblasti in endotelijske celice rastočih kapilar. V končnih fazah spontane diferenciacije se iz notranjih celic embrioidnega telesa razvijejo različne terminalno diferencirane celice, vključno z nevroni, glialnimi elementi, kardiomiociti, makrofagi in eritrociti. Do določene mere (ob upoštevanju prostorske inverzije nastanka plasti zarodnega tkiva) je z uporabo embrioidnih teles mogoče in vitro preučevati morfogenetske procese in analizirati molekularne mehanizme začetnih obdobij embrionalne citodiferenciacije.kot tudi ugotoviti vlogo specifičnih genov pri izvajanju teh procesov.

Tako so znotraj klona celice, v katerih so bili odkriti različni programi genetskega razvoja - ESC, zgodnji progenitorji in diferenciirajoče se populacije progenitorjev. Gojenje ESC z metodo viseče kapljice ali množične kulture brez hranilne plasti in brez dodajanja LIF v medij neizogibno vodi do nastanka embrioidnih teles. Morfologija celic zunanje in notranje plasti embrioidnih teles se razlikuje. Zunanja plast je sestavljena iz velikih, razvejanih celic. Njihova površina, obrnjena proti okolju, je prekrita s številnimi mikroresicami. Zunanja plast celic je od notranje plasti ločena z bazalno membrano, ki spominja na Reichertovo membrano, medtem ko so celice notranje plasti embrioidnih teles stebričasti epitelij. Morfološko notranja plast, čeprav vsebuje veliko delitvenih celic, bolj spominja na nediferencirane kolonije ESC.

Značilnosti človeških embrionalnih matičnih celic

Odsotnost parenhimsko-mezenhimskih signalnih interakcij na ozadju blokiranja genov homeoze vodi do motene rasti ESC v kulturi, saj to moti nastanek in razvoj infrastrukture začasnih organov. Neorganizirana rast in motena spontana diferenciacija ESC v kulturi sta posledica odsotnosti mezenhimske oznake stromalnega ogrodja bodočih organov: in vitro je povsem mogoče oblikovati milijone hepatocitov, vendar je nemogoče dobiti en sam jetrni lobulus, ki vključuje takšne strukturne in funkcionalne elemente, kot so sinusi, Dissejevi prostori in Kupfferjeve celice.

Domneva se, da se pluripotentnost embriogeneze (ESC) uresničuje izključno v embriogenezi z nastankom tkiv in organov zarodka, medtem ko sta posteljica in popkovina derivata trofoblasta. ESC, zaprti v trofektodermalni membrani, zaporedno ustvarjajo klonove začasnih celic, ki izvajajo razvojni program prek kombinatorične mRNA volumetrične topografske matrike Nokhteyova, ki vnaprej določajo prostorsko razporeditev, obliko in velikost, število celic začasnih in dokončnih organov ter sestavljanje parenhima v strukturne in funkcionalne enote. Hkrati ESC ostajajo edina vrsta celic, pri katerih je molekularni mehanizem za izvajanje njihovih potencialov popolnoma ločen od genetskega razvojnega programa, same ESC pa so zaradi blokiranja tako zaznavanja receptorjev kot transsignalnih sistemov prikrajšane za sposobnost interakcije z drugimi celicami. Vendar pa ustrezna aktivacija ESC vodi do postopnega razvoja programa embriogeneze, ki se konča z rojstvom popolnoma oblikovanega organizma, sestavljenega iz milijard celic, pripravljenih na zunajmaternično življenje. Na tej kratkoročni, a nepredstavljivo dolgoročni poti v celičnem prostoru neizogibno nastanejo napake tako v molekularnih mehanizmih, ki zagotavljajo vitalno aktivnost celic, kot v programih, ki nadzorujejo njihovo proliferacijo, diferenciacijo in specializacijo. Zato se v sodobni farmakogenomiki bolezni molekularne strukture in bolezni celičnega programiranja obravnavajo ločeno. Poleg tega je delovanje večine novih zdravil usmerjeno v popravljanje programov diferenciacije, proliferacije in organogeneze ter regeneracijo organov in tkiv. V odraslem organizmu ESC omogočajo nadzor nad vedenjem matičnih/progenitorskih celic, presajenih v možgane, jetra, vranico, kostni mozeg in druge človeške organe, da se obnovi poškodovan parenhim organov prejemnika z diferenciacijo in specializacijo donorskih celic na ohranjenem mezenhimskem matriksu. V bistvu se program totipotentnosti začne uresničevati na ravni genomov oocitov, zigot in blastomer; vendar te celice še niso bile klonirane in pasažirane v količinah, potrebnih za potrebe eksperimentalne in praktične medicine. Zato ESC ostajajo edinstven vir genetskih informacij, ki vsebujejo kode za tridimenzionalni zemljevid zarodka in kode za linearno restrikcijo specializiranih celičnih linij med gastrulacijo.

Praktično neomejen regenerativni potencial ESC je posledica dejstva, da njihov genom, za razliko od genetskega aparata diferenciranih somatskih celic, ohranja pluripotentnost. Ena od manifestacij mirujočega stanja genetskih informacij, vgrajenih v ESC, je tako imenovani minimalni fenotip - na površini ESC se izraža omejeno število receptorjev, zato se za interakcijo jedrnega aparata celice z njenim mikrookoljem uporablja zelo malo transsignalnih programov. Ob ozadju hibernacije genov, odgovornih za omejevanje specializiranih celičnih linij in diferenciacijo celic, se aktivira le približno 30 od 500 genov, katerih produkti zagotavljajo povezavo celice z okoliškim mikrookoljem. Z metodo serijske analize genske ekspresije je bilo dokazano, da imajo slednje ob skupnem delu glavnih funkcionalnih polj genoma, ki uravnavajo energetiko in presnovo v somatskih celicah in ESC, zelo nizko raven mRNA receptorjev, G proteinov, sekundarnih prenašalcev, transkriptaz, kofaktorjev ekspresije in represije, tj. celotnega sistema transmembranskega prenosa regulatornega signala v celico. To je posledica odsotnosti ali zelo nizke ekspresije transsignalnih genov. Med obdobjem inducirane diferenciacije v genomu ESC 18 delujočih genov sinhrono preneha delovati na ozadju aktivacije 61 transsignalnih genov, ki nadzorujejo sintezo receptorjev celične adhezije, komponent zunajceličnega matriksa, restrikcijskih transkriptaz in elementov sistema za prenos signalov v jedrni aparat iz receptorjev celične plazemske membrane. Hkrati je blokirana ekspresija genov, odgovornih za sintezo proteinov dušilcev, in soinhibitorjev ekspresije genov, ki zagotavljajo totipotentnost genoma ESC.

Za celice vseh treh zarodnih plasti so bili najdeni genski označevalci. Identifikacija ektodermalne celične plasti se izvede z izražanjem genov nodal, oct3 in fgf-5, mezodermnih celic z geni brahiurija in zeta-globin, endodermnih celic pa z izražanjem gena gata-4. V normalni embriogenezi med obdobjem gastrulacije opazimo aktivno migracijo nezrelih populacij matičnih in progenitorskih celic, ki lokalno označujejo razvojna območja obraznih kosti lobanje, nekaterih delov možganov, perifernega živčnega sistema, srčnega prevodnega sistema in timusa, katerih tkiva so oblikovana iz klonov migrantnih celic. Označevanje celic z zgodnjimi geni zarodnih plasti olajša topografsko analizo procesov migracije prekurzorskih celic v razvijajočem se zarodku. Zlasti je bilo ugotovljeno, da se v agregatih celic embriokarcinoma P19 izražanje prvega mezodermnega gena brahiurija začne v obdobju zmanjšane ekspresije genov tkivnega aktivatorja plazminogena, a-fetoproteina, keratina 8 in keratina 19, ki so označevalci prvih migracijskih populacij mezoderma. Posledično se tvorba tkiv mezodermalnega izvora začne šele po zaključku procesa točkovne migracije in razpršitve mezodermalnih progenitorskih celic.

Kljub izjemno omejenim fenotipskim značilnostim in odsotnosti večine trans-signalnih enot, ESC še vedno izražajo nekatere receptorske molekule, ki jih je mogoče uporabiti za njihovo identifikacijo. Omeniti velja, da so se markerni antigeni ESC pri ljudeh in primatih izkazali za pogoste. Najpogosteje se za označevanje ESC uporabljajo označena protitelesa proti membransko vezanim antigenom SSEA-3, SSEA-4 (edinstveni lipidni antigeni, ki predstavljajo kompleks glikolipida GL7 s sialno kislino), pa tudi visokopolimerni glikoproteini TRA-1-81, TRA-1-60. Poleg tega ESC izražajo specifični embrionalni antigen SSEA-1 in endogeno alkalno fosfatazo ter specifični transkripcijski faktor Oct4. Slednji je potreben za vzdrževanje mehanizmov proliferacije ESC - specifični transkripcijski faktor Oct4 aktivira izražanje gena fibroblastnega rastnega faktorja 4 in stabilizira izražanje skupine genov, odgovornih za neomejeno replikacijo DNK v nezrelih celicah. Najpomembnejši znotrajcelični markerni proteini so Oct3, Oct4, Tcf in Groucho, ki so povezani s proteini, ki utišajo kromatin.

Skoraj takoj po mnogih letih uspešnih poskusov gojenja matičnih celic (ESC) zunaj telesa in pridobitvi prvih kultur matičnih celic, izoliranih iz mišjih blastocist, ter kultur primarnih zarodnih celic se je začela faza raziskav pluripotentnega potenciala ESC, ko so jih v zgodnjih fazah razvoja vnesli v zarodke. Pokazalo se je, da so ESC v fazah morule in blastociste sposobne tvoriti himerne zarodke, v katerih so potomci donorskih ESC odkriti v vseh somatskih tkivih in celo v gametah. Tako je bil v razvojni biologiji z uporabo ESC vzpostavljen "most" med eksperimentalnimi študijami in vivo in in vitro, kar je znatno razširilo možnosti za preučevanje procesov odlaganja primarnih tkiv in organov, njihove diferenciacije in embrionalne organogeneze.

Jasno je ugotovljeno, da se in vivo med embriogenezo matične celice (EMC) integrirajo v celično maso zgodnjega zarodka, njihovi derivati pa se nahajajo v vseh organih in tkivih. ESC kolonizirajo linijo zarodnih celic v himernem zarodku, katerih potomci tvorijo polnopravna jajčeca in spermije. Embrionalne matične celice so klonogene – ena sama ESC je sposobna ustvariti genetsko identično kolonijo celic z molekularnimi markerji, ki vključujejo izražanje gena oct4 in alkalne fosfataze, visoko aktivnost telomeraze in izražanje določenih embrionalnih antigenov.

Za preučevanje mehanizmov embriogeneze z uporabo ESC je bila razvita metoda himerizacije morul z ustvarjanjem biološkega konstrukta, zunaj katerega je plast prejemniških tetraploidnih blastomerov, v notranjost pa so vnesene donorske ESC. Tako se iz potomcev prejemnikovih tetraploidnih blastomerov oblikuje trofoblast, ki zagotavlja implantacijo in placentacijo, donorske ESC pa delujejo kot notranja celična masa, iz katere se oblikuje telo živega zarodka in linija primarnih progenitorskih zarodnih celic. Raziskovalna vrednost ESC ni le v tem, da se med in vitro manipulacijami z njihovim genomom ohrani pluripotentnost, temveč tudi v tem, da se ohrani sposobnost ESC za sodelovanje pri nastanku primarnih zarodnih celic himernega zarodka. Dokazano je, da potomci samo ene gensko spremenjene ESC naseljujejo vse primarne rudimente in razvijajoča se tkiva himernega zarodka, pridobljenega z agregacijo ali sokultivacijo te celice z 8-celičnim zarodkom. Ko so ESC, transficirane z genom za zeleno fluorescentno beljakovino, presadili v morulo miši, so v vseh preučevanih tkivih razvijajočega se zarodka našli fluorescentne potomce te celice (Shimada, 1999). Presaditev ESC v morulo omogoča ustvarjanje živih miši, katerih organizem sestavljajo le potomci darovalčeve ESC, kar odpira možnosti za različne možnosti terapevtskega kloniranja. Ta metodološki pristop se zdaj uspešno uporablja za preučevanje problemov razvojne biologije, zlasti za analizo mehanizmov genetske inaktivacije kromosoma X ali epigenetske nestabilnosti ESC. Presaditev ESC v zgodnji zarodek se uporablja tudi v kmetijski biotehnologiji, pa tudi v poskusih genske terapije.

Presaditev gensko spremenjenih ESC se uporablja za testiranje ciljnih celic mutiranih genov. ESC, gojene in vitro, se uporabljajo v biotehnologiji za ustvarjanje miši z izločitvijo. V ta namen se gen, ki ga je treba preučevati, odstrani iz ESC s homologno rekombinacijo (izločitvijo) in celice, ki jim ta gen manjka, se izolirajo na selektivnih gojiščih. Izločene ESC se nato vnesejo v blastocisto ali združijo z blastomeri morule. Tako pridobljeni himerni zgodnji zarodki se presadijo v prejemnice, med novorojenimi mišmi pa se izberejo posamezniki z gametami, ki so nulizygotne za dani gen. Ta tehnologija je bila uporabljena za ustvarjanje številnih linij miši z izločitvijo, ki se pogosto uporabljajo v eksperimentalni biologiji in eksperimentalni medicini. Takšni biološki modeli se uporabljajo za preučevanje pomena določenih genov v embrionalnem razvoju, pa tudi njihove vloge v mehanizmih človeških bolezni in patoloških stanj. Poleg tega se linije živali z izločitvijo uporabljajo v predkliničnem testiranju novih metod genske terapije. Na primer, s transfekcijo normalnega alela mutantnega gena v genom ESC je mogoče učinkovito popraviti mutacijo, ki vpliva na hematopoetski sistem. Vnos tujih genov v ESC omogoča hitro ustvarjanje linij homozigotnih transgenih laboratorijskih živali. Vendar je treba opozoriti, da je bila tehnika ciljne rekombinacijske delecije genov doslej zanesljivo razvita le v povezavi z mišjimi ESC. Z uporabo dvojno izključenih mišjih ESC je bila ugotovljena funkcionalna vloga regije genskega grozda na kromosomu 7 (kopija genomske regije na človeškem kromosomu 19) in proksimalne regije kromosoma 11 (kopija človeškega kromosoma 5g) - delecija teh genov v mišjih ESC je omogočila oceno delovanja njihovih analogov pri ljudeh.

Možnosti preučevanja delovanja genov človeške embriogeneze so se razširile, katerih transfekcija v genom embriogenih matičnih celic laboratorijskih živali je omogočila zlasti razjasnitev vloge kripto gena pri nastanku in razvoju kardiogenega mezoderma, gena pax-6 pa pri embriogenezi očesa. Sestavljajo se prvi zemljevidi izražanja genov v nezrelih proliferirajočih embriogenih matičnih celicah teratokarcinoma in blastocist miši, potrjena pa je tudi supresivna represija transsignalnih genov v embriogenih matičnih celicah. Kombinacija 60-80 mutiranih embriogenih matičnih celic in 20-30 celic normalnih predimplantacijskih mišjih zarodkov vodi do razvoja himernih zarodkov, pri katerih organske primordije sestavljajo donorske in prejemniške celice, kar omogoča razjasnitev vloge neznanih genov pri gastrulaciji in organogenezi. Funkcionalni zemljevid genov razvijajočih se mišjih zarodkov je bil dopolnjen z informacijami o vlogi gena sf-1 pri nastanku nadledvične žleze in spolnih žlez, gena wt-1 pri nastanku ledvic, genov družine myoD pri nastanku skeletnih mišic in genov družine gata-1-4 pri restrikcijskem zorenju rudimentov eritropoeze in limfopoeze.

Usmerjeno izklapljanje materinskih in očetovskih alelov genov v ESC z uporabo vektorskih rekombinaz je omogočilo razjasnitev funkcij različnih genov v zgodnjem obdobju embriogeneze, tehnologija usmerjenega prenosa neznanih človeških genov v mišje ESC pa prispeva k odkritju novih mutantnih genov, odgovornih za razvoj hude dedne patologije. Z metodo knockout je bil določen obvezni pomen nekaterih genov za nastanek embrionalnih tkiv: gata-4 - za miokard, gata-1 - za eritroidno linijo hematopoetskega tkiva, myoD - za skeletne mišice, brahiurija - za mezoderm, restrikcijske transkriptaze hnf3 in hnf4 - za jetrne matične celice, rag-2 - za nastanek klonov T- in B-limfocitov (Repin, 2001). Dvojna delecija genov v ESC je odprla dostop do preučevanja funkcionalne vloge genov zarodne plasti, segmentacije in homeoze, presaditev ESC pa je omogočila pridobitev sposobnih za preživetje medvrstnih hibridnih zarodkov. Z izboljšano tehniko presaditve enojne donorske ESC v 8-celični zarodek je bilo dokazano dejstvo himerizacije na celični ravni številnih organov prejemniškega zarodka. Treba je opozoriti, da so bili po vnosu človeških hematopoetskih matičnih celic v blastocisto v organih prejemniških miši najdeni celični kalčki človeškega tkiva. Ugotovljeno je bilo, da pluripotentne ESC krožijo v krvi mišjih zarodkov v obdobju nastajanja organov. Možno je, da je njihova biološka funkcija v embrionalni organizaciji bodočega imunskega sistema. S pomočjo ESC so bili v laboratorijskih pogojih reproducirani ustrezni modeli človeške genetske patologije: dvojni izpad gena za distrofin pri miših pri Duchennovi mišični distrofiji in zaustavitev gena atm (nadzor sinteze kromatinske signalne kinaze) - ataksija-telangektazija. Pri tej smrtonosni dedni bolezni pri otrocih se zaradi okvar v reparaciji DNK razvije degeneracija Purkinjejevih celic v malem mozgu, ki jo spremlja involucija timusa zaradi smrti proliferirajočih celic. Klinična slika, patofiziologija in patomorfologija ataksije-telangektazije, reproducirane z vnosom patoloških genetskih informacij v embrionalne matične celice (ESC), pri himernih miših ustrezajo tistim pri ljudeh. Poleg ataksije-telangektazije so bili z uporabo ESC in knockout miši razviti eksperimentalni modeli nekaterih dednih homozigotnih človeških bolezni, povezanih s patologijo presnove ogljikovih hidratov in lipidov, katabolizma aminokislin ter izločanja bakra in bilirubina, kar je znatno razširilo zmogljivosti eksperimentalne medicine v fazi predkliničnega testiranja novih metod za zdravljenje ustreznih človeških bolezni.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Uporaba citohibridov matičnih celic

Hibridne celice, pridobljene z zlitjem ESC s somatskimi celicami, so ustrezen in obetaven model za preučevanje pluripotence matičnih celic in reprogramiranje kromosomov diferenciranih celic. Citohibridi, pridobljeni z zlitjem ESC z diferenciranimi celicami odrasle živali, omogočajo preučevanje odnosov med genomi različnih "starosti": edinstvena situacija nastane, ko se homologni kromosomi, ki izvirajo iz celic v različnih fazah diferenciacije in različnih stopnjah zrelosti, nahajajo v istem jedru, kjer lahko zlahka izmenjujejo trans-aktujoče regulatorne signale. Težko je napovedati, kako se bodo cisregulatorni epigenetski sistemi homolognih kromosomov, ki so nastali med individualnim razvojem, odzvali na vpliv trans-aktujočih signalov, ki izhajajo iz embrionalno sorodnih genomov. Poleg tega v hibridnih celicah pride do segregacije starševskih kromosomov, kar nam omogoča preučevanje interakcije genomov na ravni posameznih kromosomov, torej potencialno prepoznavanje sodelovanja specifičnih kromosomov pri ohranjanju pluripotence ali, nasprotno, izhodu v diferenciacijo.

Citohibridi, pridobljeni z zlitjem pluripotentnih teratokarcinomskih in diferenciranih somatskih celic, so bili uporabljeni kot prvi eksperimentalni model za preučevanje interakcije genomov z različnimi "razvojnimi zgodovinami". V nekaterih primerih so takšne hibridne celice ohranile pluripotentne lastnosti na dokaj visoki ravni. Zlasti so in vivo hibridne celice teratokarcinoma in somatske celice povzročile razvoj pravih teratomov, ki vsebujejo derivate vseh treh zarodnih plasti, in vitro v suspenzijskih kulturah pa so tvorile embrioidna telesca. Tudi pri interspecifičnih citohibridih te vrste je bila prisotnost embrionalnih antigenov opažena v primerih, ko so bili somatski partnerji pri zlitju s celicami teratokarcinoma limfociti ali timociti. Omeniti velja, da so citohibridi, ustvarjeni z zlitjem celic teratokarcinoma s fibroblasti, po fenotipu ustrezali fibroblastom.

Najpomembnejše ugotovljeno dejstvo je, da so se v hibridnih celicah teratokarcinoma in somatskih celic pojavili znaki reprogramiranja diferenciranega celičnega genoma, za katerega je bila značilna reaktivacija bodisi posameznih genov bodisi neaktivnega kromosoma X somatskega partnerja. Rezultati študij citohibridov celičnega tipa teratokarcinoma in somatskih celic tako kažejo, da se v hibridnih celicah pogosto ohranja pluripotenca in da obstajajo znaki reprogramiranja genoma somatskega partnerja.

V poskusih pridobivanja intraspecifičnih embrionalnih hibridnih celic z zlitjem mišjih ESC z odraslimi splenociti so preučevali značilnosti takšnih citohibridov, analizirali segregacijo starševskih kromosomov in ocenili pluripotentnost hibridnega genoma. Intraspecifični hibridni celici, pridobljeni z zlitjem celic teratokarcinoma s somatskimi celicami, so običajno značilni po nizki stopnji segregacije kromosomov s tetraploidnim ali skoraj tetraploidnim kariotipom. Podobna kromosomska sestava je bila opažena pri citohibridih med zlitjem primarnih zarodnih celic z limfociti. Hkrati so interspecifični hibridni celici, pridobljeni z zlitjem mišjih celic teratokarcinoma z limfociti nerca, pokazali intenzivno segregacijo kromosomov somatskega partnerja.

Kakovostno nova faza v preučevanju segregacije starševskih kromosomov pri intraspecifičnih hibridih se je začela po razvoju metode za analizo mikrosatelitov z uporabo verižne reakcije s polimerazo, zahvaljujoč kateri je bilo za vsak mišji kromosom najdenih več sto markerjev, kar omogoča zanesljivo razlikovanje katerega koli para homolognih kromosomov v hibridnih celicah.

Z zlitjem ESC (celice HM-1 s pomanjkanjem aktivnosti hipoksantin fosforiboziltransferaze, 2n = 40, XY, izolirane iz blastocist miši 129/01a) s splenociti kongenih miši DD/c je bilo mogoče dobiti niz hibridnih klonov, morfološko podobnih ESC. Vsi kloni so bili izolirani na selektivnem gojišču, v katerem lahko rastejo le celice z aktivno hipoksantin fosforiboziltransferazo. Elektroforetska analiza je pokazala, da imajo vsi kloni alelno varianto hipoksantin fosforiboziltransferaze, značilno za miši DD/c. Citogenetska analiza je pokazala, da imajo trije od štirih hibridnih klonov skoraj diploiden nabor kromosomov. En skoraj tetraploidni klon je vseboval dve populaciji hibridnih celic, od katerih je bila ena tetraploidna, druga, manjša, pa diploidna.

Mikrosatelitska analiza, ki omogoča razlikovanje katerega koli para homolognih kromosomov miši 129/01a in DD/c, je v hibridnih klonih s skoraj diploidnim naborom pokazala, da je v dveh klonih prišlo do jasne preferenčne eliminacije avtosomov somatskega partnerja. Večina avtosomov v klonih HESS2 in HESS3 je imela markerje linije 129/01a, tj. pluripotentnega partnerja. Izjema sta bila kromosoma 1 in I: v klonih HESS2 in HESS3 so bili poleg markerjev celic HM-1 v majhnih količinah prisotni tudi markerji somatskega partnerja. Takšni rezultati lahko odražajo nepopolno segregacijo kromosomov 1 in I somatskega partnerja in so skladni s citogenetskimi podatki, da je trisomija za ta kromosoma opažena v 30–40 % celic klonov HESS2 in HESS3. Klon HESS4 se je bistveno razlikoval po svoji kromosomski sestavi: veliko avtosomov v tem klonu izvira iz genoma ESC (kromosomi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 in 17), kromosomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 in 19 pa so bili predstavljeni s homologi obeh staršev. Kvantitativno razmerje mikrosatelitov, ki označujejo te homologne kromosome, je bilo približno 1:1. To je avtorjem omogočilo domnevo, da en homolog izvira iz genoma ESC, drugi pa iz diferenciranih celic. V nekaterih podklonih klona HESS4 so bili prisotni le markerji kromosomov 18 in 19 somatskega partnerja. Pridobljeni rezultati kažejo, da je v celicah klona HESS4 poleg segregacije kromosomov somatskega partnerja prišlo tudi do izločanja enega ali obeh homologov zgoraj naštetih kromosomov pluripotentnega genoma, torej je prišlo do dvostranske segregacije kromosomov obeh staršev - zelo nenavaden pojav, saj je segregacija kromosomov le enega od staršev značilna za citohibride.

Poleg tega so po 20. pasaži vsi kloni hibridnih celic vsebovali le markerje kromosoma X somatskega partnerja, tj. kromosom ESC X je bil v klonih nadomeščen s kromosomom X somatskega partnerja. To pomembno dejstvo potrjujejo podatki hibridizacije in situ z uporabo sonde, označene s FITC, specifične za mišji kromosom X: pozitiven signal je bil zaznan le na enem kromosomu. Treba je opozoriti, da so v zgodnejših fazah gojenja (pred 15. pasažo) po citogenetskih podatkih številne celice vsebovale dva kromosoma X. Zato uporaba selektivnih medijev omogoča manipulacijo kromosomske sestave hibridnih celic in selektivno izbiro klonov, ki nosijo posamezne kromosome somatskega partnerja, na ozadju genoma ESC.

Ker je edinstvena značilnost citohibridnega genoma lokalizacija starševskih genomov v enem jedru, se seveda postavlja vprašanje o ohranitvi pluripotentnih lastnosti embrionalnega genoma v hibridih ESC-somatskih celic v pogojih tesnega stika z genomom diferencirane celice. Morfološko so bili citohibridi ESC in somatskih celic podobni starševski liniji ESC. Vrednotenje pluripotence je pokazalo, da so bili vsi kloni s skoraj diploidnim naborom kromosomov sposobni tvoriti embrioidna telesa v suspenzijskih kulturah, v katerih so bili prisotni derivati treh zarodnih plasti.

Večina hibridnih celic je vsebovala antigen ECMA-7, označevalec, značilen za zgodnje mišje zarodke, in je imela tudi visoko aktivnost alkalne fosfataze. Najbolj prepričljivi podatki o visokih pluripotentnih lastnostih hibridnih celic so bili pridobljeni v poskusih pridobivanja serije injekcijskih himer, ki vključujejo hibridne celice klona HESS2. Analiza biokemijskih označevalcev je pokazala, da so potomci donorskih hibridnih celic prisotni v večini tkiv himer. Zato hibridne celice, pridobljene z zlitjem ESC in somatsko diferenciranih celic, ohranijo visoko pluripotentnost, vključno s sposobnostjo tvorbe himer, ko so injicirane v votlino blastociste.

Klona HESS2 in HESS4 sta se bistveno razlikovala v sestavi starševskih kromosomov, vendar sta imela podobne pluripotentne lastnosti. Lahko bi domnevali, da se pluripotentnost v hibridnem genomu kaže kot dominantna lastnost, vendar je možno, da v proces ohranjanja pluripotence niso vključeni vsi kromosomi embrionalnega genoma. Če je ta predpostavka pravilna, potem lahko pričakujemo, da izločanja nekaterih kromosomov pluripotentnega partnerja iz genoma hibridnih celic ne bo spremljala sprememba njihovega pluripotentnega statusa. V tem primeru bi nam analiza segregacije starševskih kromosomov v embrionalnih hibridnih celicah omogočila, da se natančneje približamo identifikaciji kromosomov, odgovornih za nadzor pluripotence embrionalnih celic.

O. Serov in sodelavci (2001) med 50 potomci, pridobljenimi s križanjem himer z normalnimi mišmi, ki so imele mišji genotip 129/01a in so nosile kromosom X miši DD, niso našli nobenega potomca. Avtorji menijo, da je to posledica zmanjšanja pluripotence v hibridnih celicah pod vplivom somatskega genoma. Alternativna razlaga je lahko negativni učinek trisomije na nekatere avtosome in neravnovesje spolnih kromosomov (XXY so bili opaženi v celicah do 15. pasaže) v hibridnih celicah med mejozo. Znano je, da celice XXY niso sposobne mejoze in tvoriti gamet. Trisomija lahko povzroči tudi zmanjšanje proliferativne aktivnosti hibridnih celic, zaradi česar lahko selektivno prednost pri razvoju himer pripada celicam prejemnega zarodka. Iz tega sledi, da je za ustrezno oceno pluripotentnega potenciala hibridnih celic potrebno pridobiti hibridne klone z normalnim diploidnim naborom kromosomov.

V poskusih O. Serova in soavtorjev (2001) je bila prvič dokazana možnost reprogramiranja kromosoma X somatske celice v genomu hibridnih celic. Ta sklep avtorjev izhaja iz analize izražanja gena hprt (označevalca kromosoma X) pri himerah: prisotnost alelne variante hprt miši DD/c je bila zaznana v vseh analiziranih himernih tkivih. Primerno je poudariti, da po vnosu hibridnih celic v votlino blastociste citohibridi padejo v neselektivne pogoje in ohranitev kromosoma X v genomu hibridnih celic pomeni, da je postal njena obligatna komponenta in ga genom ne razlikuje od kromosoma Y pluripotentnega partnerja.

Avtorji povzemajo rezultate analize interakcije somatskih in pluripotentnih genomov v hibridnih embrionalnih celicah in sklepajo, da se pri nekaterih citohibridih pluripotenca kaže kot dominantna lastnost. Hibridni genom je sposoben reprogramirati posamezne kromosome diferenciranih celic, kar pa ne izključuje možnosti obratnega učinka somatskega genoma na pluripotentnost embrionalnega genoma. Pri gojenju hibridnih celic se indukcija diferenciacije pojavlja bistveno pogosteje kot v prvotni starševski liniji embrionalnih embrionalnih celic HM-1. Podoben učinek opazimo med nastajanjem primarnih kolonij: številne primarne kolonije embrionalnih hibridnih celic se diferencirajo v zgodnjih fazah nastajanja z velikimi izgubami klonov med njihovo selekcijo in razmnoževanjem.

Tako citohibridi, ki nastanejo z zlitjem embrionalnih matičnih celic (EMC) s somatskimi celicami, kljub tesnemu stiku z genomom diferenciranih celic ohranijo pluripotentnost kot edinstveno lastnost embrionalnega genoma. Poleg tega je v takšnih hibridnih celicah možno reprogramiranje posameznih kromosomov, ki izvirajo iz diferenciranih celic. Ni jasno, v kolikšni meri se pluripotentne lastnosti embrionalnega genoma ohranijo v hibridnih celicah, zlasti njihova sposobnost sodelovanja pri nastanku zarodne linije v himerah. To zahteva pridobitev embrionalnih hibridnih celic z normalnim kariotipom. V vsakem primeru lahko pluripotentne embrionalne hibridne celice postanejo pravi genetski model za identifikacijo kromosomov, ki sodelujejo pri ohranjanju ali nadzoru pluripotence, saj dvostranska segregacija starševskih kromosomov potencialno ponuja takšno priložnost.

Nič manj privlačna ni študija pojava, ki ga O. Serov in sodelavci (2001) opredeljujejo kot »kromosomski spomin«. V hibridnem genomu so homologni kromosomi v dveh alternativnih konfiguracijah: homologi somatskega partnerja so nekoč že bili diferencirani, medtem ko se pri homologih pluripotentnega partnerja ta proces šele začenja. Posledično ohranjanje visokih pluripotentnih lastnosti hibridnih celic kaže, da je »pluripotentna« konfiguracija homologov ESC dovolj stabilna v hibridnem genomu, kljub vplivu transakcijskih faktorjev, ki izhajajo iz somatskega partnerja. Zgoraj opisani znaki reprogramiranja homolognih kromosomov diferenciranega genoma med razvojem himer ne izključujejo možnosti, da v prvih fazah nastajanja in gojenja citohibridov in vitro ohranijo svoj status, pridobljen med diferenciacijo in vivo. Glede na nedavno pridobljene podatke kažejo, da ko se embrionalne hibridne celice prenesejo v neselektivno okolje, kažejo intenzivno eliminacijo kromosomov samo somatskega partnerja, tj. genom hibridnih celic po gojenju in vitro 10–15 prehodov zlahka razlikuje homologe. Tako hibridne embrionalne celice predstavljajo obetaven eksperimentalni model za preučevanje ne le tako temeljne lastnosti embrionalnega genoma, kot je pluripotenca, temveč tudi njene alternative - embrionalne diferenciacije.

Terapevtska učinkovitost presaditve embrionalnih matičnih celic

Preden analiziramo terapevtsko učinkovitost presaditve matičnih celic (EMC) in njihovih derivatov, povzamemo zgornje gradivo. Zmogljivosti ESC v smislu popolne izvedbe embriogeneze in vitro so nezadostne, saj so razvojne napake v tem primeru posledica odsotnosti mezenhimskih matičnih celic, ki v telesu nastanejo avtonomno in neodvisno od ESC. Genetski potencial ESC je manjši od genetskega potenciala zigote, zato se ESC ne uporabljajo neposredno za kloniranje zarodkov. Edinstven biološki potencial ESC kot edinih celic, v katerih so razvojni programi v celoti izvedeni v dosledni izvedbi, se uporablja v študijah delovanja genov. S pomočjo ESC se dekodirajo prve kombinacije signalov, ki aktivirajo izražanje zgodnjih in poznih genov, ki kodirajo razvoj treh zarodnih plasti. Ohranjanje pluripotentnosti genoma ESC in vitro jih naredi edinstveno orodje za reparativno regeneracijo, ki je sposobno samodejno nadomestiti celične izgube v primeru poškodb organov in tkiv. V idealnem hipotetičnem scenariju lahko predpostavimo, da se »... pri presaditvi donorskih ESC v telo prejemnika prenesejo kompaktno zloženi programi, ki se pod ugodnimi pogoji uresničijo pri izgradnji novega tkiva«7, ki se lahko »... učinkovito integrira v telo prejemnika tako na morfološki kot funkcionalni ravni«.

Seveda se je po razvoju metod za monodiferenciacijo matičnih celic (EMC) začela in vivo študija funkcionalne aktivnosti celic, pridobljenih in vitro iz enega specializiranega klona. Proliferirajoči klon ESC ustvari populacije migrirajočih progenitorskih celic, ki so resnično sposobne aktivne integracije v območja poškodbe tkiva prejemnika, kar se uporablja v regenerativno-plastični medicini. Ugotovljeno je bilo, da presaditev DOPA nevronov v črno substanco zmanjša klinične manifestacije pri eksperimentalnem hemiparkinsonizmu. Regionalne presaditve donorskih nevronskih matičnih celic zmanjšajo stopnjo motoričnih motenj, ki jih povzročijo travme ali kontuzije hrbtenjače in možganov. Pridobljeni so bili tudi prvi pozitivni rezultati presaditve matičnih celic pri demielinizirajočih boleznih. Zdi se, da regenerativno-plastični potencial ESC odpira neomejene možnosti za uporabo presaditve celic v praktični medicini. Vendar pa se ESC pri presaditvi v ektopična območja neizogibno transformirajo v tumorje. Teratomi nastanejo, ko se ESC injicirajo subkutano imunsko pomanjkljivim mišim. Ko se suspenzije ESC presadijo pod kapsulo testisa pri singenetskih miših, se tvorijo tudi teratomi, sestavljeni iz različnih tkiv, katerih celice so derivati vseh treh zarodnih plasti. Pri takšnih teratomih so procesi zmanjšane organogeneze izjemno redki.

Številne študije ponujajo informacije o pozitivnih rezultatih presaditve zgodnjih derivatov ESC živalim z eksperimentalno patologijo. Celična nevrotransplantacija z uporabo derivatov ESC se nadalje razvija v poskusih in prvih kliničnih preskušanjih za odpravljanje funkcionalnih motenj pri poškodbah možganov in hrbtenjače ter za zdravljenje siringomielije in multiple skleroze (Repin, 2001). S prihodom tehnike in vitro nevrogeneze iz ESC se namesto uporabe embrionalnega možganskega tkiva razvijajo metode za presaditev derivatov nevrosfer, pridobljenih iz embrionalnih kultur živčnega tkiva. Takšne transplantacijske suspenzije so bistveno bolj homogene in vsebujejo predhodnike nevronov in nevroglije.

Z rednim dodajanjem retinojske kisline v odmerku 10 μg/ml v gojišče 6 tednov se v liniji človeškega embrio-(terato)-karcinoma NTERA-2 tvori več kot 80 % postmitotičnih nevronov. Popolna homogenost nevronske populacije se doseže s pretočnim sortiranjem zrelih nevronov, označenih z imunofenotipskimi markerji, kar omogoča odstranitev ostankov teratokarcinoma in nezrelih celic. Po presaditvi v različne regije možganov poskusnih živali takšni nevroni ne le preživijo, ampak se tudi integrirajo v regionalne nevronske mreže. Pri živalih z eksperimentalnimi modeli lokalnih okvar osrednjega živčevja nevrotransplantacija zmanjša klinične manifestacije človeških patologij, kot so posledice travmatske poškodbe možganov, kapi, demielinizirajočih bolezni, dednih okvar v razvoju malih možganov, bolezni odlaganja lipidov in polisaharidov.

Za optimizacijo regeneracijskih procesov pri degenerativnih boleznih osrednjega živčnega sistema se razvijajo tehnologije za pridobivanje mielin-producirajočih oligodendrocitov iz embrionalnih matičnih celic (ESC). Prva faza tradicionalno vključuje proliferacijo ESC z reprodukcijo števila celic, potrebnih za presaditev. V drugi fazi se izvede ciljno diferenciacija celic v populacijo mielin-producirajočih oligodendrocitnih predhodnikov, ki jo nadzorujejo selektivni markerni antigeni.

Odpirajo se določene možnosti za uporabo derivatov ESC za razvoj metod za odpravljanje imunskih pomanjkljivosti, ki jih povzročajo genetske okvare v zorenju timusa. V študijah na miših z izpadom (rag 1) z inducirano gensko okvaro - motnjo rekombinacijskega mehanizma lokusov V(D)J genov TCR, kar vodi do izgube funkcije T-limfocitov, presaditev zgodnjih derivatov ESC v timus živali obnovi zorenje normalnih populacij imunskih klonov, odgovornih za celično imunost. Klinična preskušanja presaditve in vitro predoblikovanih ESC za zdravljenje smrtnih dednih anemij pri otrocih so v teku.

Ugovori proti hitri uvedbi presaditve matičnih celic v kliniko temeljijo na omejenem številu stabilnih linij človeških embrionalnih matičnih celic in potrebi po njihovi standardizaciji. Za povečanje čistosti standardiziranih linij ESC, pa tudi odraslih človeških matičnih celic, se predlaga uporaba metode selekcije linij, ki temelji na molekularno-genetski analizi kratkih tandemskih ponovitev DNK. Prav tako je treba testirati linije ESC na prisotnost majhnih kromosomskih preureditev in genetskih mutacij, katerih potencial za pojav v pogojih celične kulture je precej visok. Postavljena je teza o obveznem testiranju lastnosti vseh vrst ESC in regionalnih pluripotentnih matičnih celic, saj lahko njihovo razmnoževanje in vitro privede do pojava novih značilnosti, ki niso lastne embrionalnim matičnim celicam ali dokončnim tkivom. Zlasti se domneva, da dolgotrajno gojenje v medijih s citokini približa linije ESC tumorskim celicam, saj so podvržene podobnim spremembam v poteh regulacije celičnega cikla s pridobitvijo sposobnosti izvajanja neomejenega števila celičnih delitev. Nekateri avtorji zaradi potenciala za razvoj tumorja menijo, da je presaditev zgodnjih derivatov embrionalnih matičnih celic v ljudi nepremišljena. Po njihovem mnenju je veliko varneje uporabiti zavezane potomce ESC, tj. linije diferenciranih celičnih progenitorjev. Vendar pa trenutno še ni razvita zanesljiva tehnika za pridobivanje stabilnih človeških celičnih linij, ki se diferencirajo v želeno smer.

Tako se v literaturi pojavlja vse več podatkov o pozitivnem terapevtskem učinku presaditve derivatov človeških embrionalnih matičnih celic. Vendar pa so številne od teh študij podvržene pregledu in kritikam. Nekateri raziskovalci menijo, da so rezultati zgodnjih kliničnih preskušanj predhodne narave in le kažejo, da so matične celice sposobne ugodno vplivati na klinični potek določene bolezni. Zato je treba pridobiti podatke o oddaljenih rezultatih presaditve celic. Kot argument se navajajo faze razvoja klinične nevrotransplantologije. Dejansko so sprva v literaturi prevladovale publikacije o visoki učinkovitosti presaditve fragmentov embrionalnih možganov pri Parkinsonovi bolezni, nato pa so se začela pojavljati poročila, ki so zanikala terapevtsko učinkovitost embrionalnega ali fetalnega živčnega tkiva, presajenega v možgane bolnikov.

Prve klinične študije so bile izvedene za oceno varnosti presaditve nevroblastov, pridobljenih iz ESC teratokarcinoma NTERA-2, katerih nezrele celice so bile podvržene proliferaciji v kulturi do kopičenja 100 milijonov celične mase. Nekatere tako pridobljene celice so bile uporabljene za karakterizacijo fenotipa in določanje celičnih nečistoč ter za testiranje morebitne kontaminacije z virusi in bakterijami. LIF in hranilna plast fetalnih stromalnih celic sta bila odstranjena iz gojišča, s kombinacijo citokinov in rastnih faktorjev pa so bili ustvarjeni pogoji za ciljno diferenciacijo ESC v nevroblaste. Nato so bili nevroblasti očiščeni iz nezrelih teratokarcinomskih celic na pretočnem sorterju celic. Po sekundarnem čiščenju in karakterizaciji fenotipa presajenih celic je bila suspenzija nevroblastov (10-12 milijonov) injicirana v bazalno jedro možganov bolnikov (v sedmem mesecu po hemoragični kapi) s posebno mikrokanilo in brizgo pod stereotaksičnim in računalniško tomografskim nadzorom. Enoletno presejanje posledic presaditve nevronov v območje kapi po presaditvi ni pokazalo nobenih stranskih ali neželenih učinkov. Polovica bolnikov je v obdobju od 6 do 12 mesecev po presaditvi pokazala izboljšanje motorične funkcije. Pozitivne klinične spremembe je po presaditvi celic spremljala povečana prekrvavitev območja kapi: povprečno povečanje absorpcije fluorescentno označene 2-deoksiglukoze je po pozitronski emisijski tomografiji doseglo 18 %, pri nekaterih bolnikih pa 35 %.

Vendar pa je ameriški Nacionalni inštitut za zdravje izvedel neodvisno študijo klinične učinkovitosti nevrotransplantacije pri bolnikih s parkinsonizmom. Bolnikom v prvi skupini so presadili dele embrionalnega živčnega tkiva, ki proizvajajo dopamin, medtem ko je bila druga skupina bolnikov podvržena lažni operaciji. Rezultati kažejo na ničelno klinično učinkovitost takšne nevrotransplantacije, kljub dejstvu, da so embrionalni nevroni, ki proizvajajo dopamin, preživeli v možganih prejemnikov. Poleg tega je 2 leti po presaditvi embrionalnega živčnega tkiva 15 % bolnikov razvilo perzistentno diskinezijo, ki je pri bolnikih v skupini, ki je prejemala placebo, ni bilo (Maticne celice: znanstveni napredek in prihodnje raziskovalne smeri. Nacionalni inštitut za zdravje. ZDA). Opazovanja nadaljnjega razvoja bolezni pri teh bolnikih še potekajo.

Nekateri avtorji povezujejo protislovne podatke v literaturi o oceni klinične učinkovitosti nevrotransplantacije z različnimi pristopi k izbiri skupin bolnikov, neustrezno izbiro metod za objektivno oceno njihovega stanja in, kar je najpomembneje, z različnimi obdobji razvoja embrionalnega živčnega tkiva in različnimi področji možganov, iz katerih je bilo to tkivo pridobljeno, različnimi velikostmi presadkov in metodološkimi značilnostmi kirurškega posega.

Treba je opozoriti, da so poskuse neposredne presaditve pluripotentnih embrionalnih matičnih celic v striatumsko regijo možganov podgan z eksperimentalnim hemiparkinsonizmom spremljale proliferacija embrionalnih matičnih celic (ESC) in njihova diferenciacija v dopaminergične nevrone. Domnevati je treba, da so bili novo nastali nevroni učinkovito integrirani v nevronske mreže, saj so po presaditvi ESC opazili korekcijo vedenjskih anomalij in motorične asimetrije v testu z apomorfinom. Hkrati so nekatere živali poginile zaradi transformacije presajenih ESC v možganske tumorje.

Strokovnjaki Nacionalne in Medicinske akademije ZDA ter specialisti Nacionalnega inštituta za zdravje ZDA menijo, da si klinični potencial matičnih celic zasluži najresnejšo pozornost, vendar vztrajajo pri potrebi po podrobni študiji njihovih lastnosti, verjetnosti zapletov in dolgoročnih posledic v poskusih na ustreznih bioloških modelih človeških bolezni (Matic cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

S tega vidika je pomembno, da je primerjalna histološka analiza eksperimentalnih teratomov, pridobljenih s presaditvijo suspenzije matičnih celic (ESC) v modo, s teratomi, ki so nastali kot posledica presaditve zgodnjega zarodka, ki prav tako vsebuje ESC, pokazala, da ESC, ne glede na njihov vir izvora ali interakcijo z določenimi okoliškimi celicami, svoj tumorigeni potencial uresničujejo na enak način. Dokazano je, da imajo takšni teratomi klonski izvor, saj lahko tumorji, sestavljeni iz derivatov vseh treh zarodnih plasti, nastanejo iz ene ESC (Rega, 2001). Omeniti velja, da so pri presaditvi kloniranih ESC z normalnim kariotipom v imunsko pomanjkljive miši nastali tudi teratomi, sestavljeni iz različnih vrst diferenciranih somatskih celic. Ti eksperimentalni podatki so brezhiben dokaz klonskega izvora teratomov. Z vidika razvojne biologije kažejo, da kot vir diferenciranih derivatov vseh treh zarodnih plasti, ki sestavljajo teratom, ne deluje več zavezanih progenitorskih celic, temveč ena sama pluripotentna matična celica. Vendar pa so na poti do praktične presaditve celic rezultati teh študij, če ne že prepoved, potem pa opozorilni znak potencialne nevarnosti, saj inokulacija ESC ali primordialnih zarodnih celic v različna tkiva odraslih imunsko pomanjkljivih miši neizogibno povzroči razvoj tumorjev iz presajenih matičnih celic. Neoplastično degeneracijo ektopično presajenih ESC spremlja nastanek satelitskih populacij diferenciranih celic - zaradi delne diferenciacije ESC in progenitorskih klonov v specializirane linije. Zanimivo je, da se pri presaditvi ESC v skeletne mišice nevroni najpogosteje tvorijo poleg celic teratokarcinoma. Vendar pa vnos ESC v delitveno jajčece ali blastocisto spremlja popolna integracija celic v zarodek brez nastanka neoplastičnih elementov. V tem primeru se ESC integrirajo v praktično vse organe in tkiva zarodka, vključno z genitalnim primordijem. Takšne alofenske živali so bile prvič pridobljene z vnosom celic teratokarcinoma 129 v zgodnje zarodke v celičnih fazah 8-100. Pri alofenskih miših so populacije heterogenih celic, pridobljenih iz donorskih ESC, integrirane v tkiva kostnega mozga, črevesja, kože, jeter in genitalij, kar omogoča ustvarjanje celo medvrstnih celičnih himer v poskusu. Krajše kot je obdobje razvoja zgodnjega zarodka, višji je odstotek celične himerizacije, pri čemer je najvišja stopnja himerizacije opažena v hematopoetskem sistemu, koži, živčnem sistemu, jetrih in tankem črevesu alofenskega zarodka. V odraslem organizmu so tkiva, ki jih pred imunskim sistemom prejemnika ščitijo histohematske ovire, dovzetna za himerizacijo:Presaditev primarnih zarodnih celic v parenhim testisa spremlja vključitev donorskih matičnih celic v plast zarodnega tkiva prejemnika. Vendar pa pri presaditvi ESC v blastocisto ne pride do nastanka himernih zametkov spolnih organov z nastankom donorskih primarnih zarodnih celic. Pluripotentnost ESC se lahko ob ustvarjanju posebnih pogojev uporabi tudi za kloniranje: presaditev mišjih ESC v 8-16-celični mišji zarodek, pri katerem citokalsin blokira celične mitoze, spodbuja normalno embriogenezo z razvojem zarodka iz donorskih ESC.

Zato je alternativa alogenski presaditvi ESC terapevtsko kloniranje, ki temelji na presaditvi jeder somatskih celic v enukleirano jajčece, da se ustvari blastocista, iz katere notranje celične mase se nato izolirajo linije ESC, ki so genetsko identične darovalcu somatskega jedra. Tehnično je ta ideja precej izvedljiva, saj je bila možnost ustvarjanja linij ESC iz blastocist, pridobljenih po presaditvi somatskih jeder v enukleirana jajčeca, večkrat dokazana v poskusih na laboratorijskih živalih (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Zlasti pri miših, homozigotnih za mutacijo gena rag2, so bili kot darovalci jeder uporabljeni fibroblasti, pridobljeni z gojenjem subepidermalnih tkivnih celic, ki so bila presajena v enukleirane oocite. Po aktivaciji oocitov so "zigoto" gojili do nastanka blastociste, iz katere notranje celične mase so izolirali ESC in jih prenesli v linijo celic, ki so nulizygotne za mutantni gen (rag2~/~). Mutacija enega alelnega gena je bila v takšnih ESC popravljena z metodo homologne rekombinacije. V prvi seriji poskusov so bila iz ESC z rekombinantnim obnovljenim genom pridobljena embrioidna telesa, njihove celice so bile transficirane z rekombinantnim retrovirusom (HoxB4i/GFP) in po razmnoževanju injicirane v veno miši rag2~/~. V drugi seriji so bili tetraploidni blastomeri agregirani z gensko spremenjenimi ESC in presajeni v prejemnice. Nastale imunokompetentne miši so služile kot darovalke kostnega mozga za presaditev v mutirane miši rag2~/~. V obeh serijah je bil rezultat pozitiven: po 3-4 tednih so bile pri vseh miših najdene zrele normalne mieloidne in limfoidne celice, sposobne proizvajati imunoglobuline. Tako se lahko presaditev jeder somatskih celic v oocite uporabi ne le za pridobivanje linij ESC, temveč tudi za citogenoterapijo - korekcijo dednih anomalij, pri čemer se ESC uporablja kot vektor za transport korektivnih genetskih informacij. Toda ta smer presaditve celic ima poleg bioetičnih problemov tudi svoje omejitve. Ni jasno, kako varna bo presaditev terapevtsko kloniranih celic z genotipom, ki je identičen genotipu določenega pacienta, saj lahko takšne celice vnesejo mutacije, ki ustvarjajo nagnjenost k drugim boleznim. Normalne človeške jajčeca ostajajo težko dostopen objekt, medtem ko se tudi pri presaditvi somatskih jeder v enukleirana živalska jajčeca le 15–25 % konstruiranih "zigotov" razvije do stopnje blastociste. Še ni določeno, koliko blastocist je potrebnih za pridobitev ene linije pluripotentnih kloniranih ESC. Omeniti velja tudi visoke finančne stroške, povezane z zahtevnostjo metodologije terapevtskega kloniranja.

Skratka, treba je opozoriti, da je v ESC pluripotentnost genoma s hipometilirano DNK kombinirana z visoko aktivnostjo telomeraze in kratko C^ fazo celičnega cikla, kar zagotavlja njihovo intenzivno in potencialno neskončno razmnoževanje, med katerim ESC ohranijo diploidni nabor kromosomov in "juvenilni" nabor fenotipskih značilnosti. Klonska rast ESC v kulturi ne moti njihove diferenciacije v nobeno specializirano celično linijo organizma, ko se proliferacija ustavi in se dodajo ustrezni regulatorni signali. Restrikcijska diferenciacija ESC v somatske celične linije in vitro se izvaja brez sodelovanja mezenhima, mimo Nochteyjev, zunaj organogeneze in brez nastanka zarodka. Ektopična vnos ESC in vivo neizogibno vodi do nastanka teratokarcinomov. Presaditev ESC v blastocisto ali zgodnji zarodek spremlja njihova integracija z zarodnimi tkivi in stabilna himerizacija njegovih organov.

Regenerativno-plastične tehnologije, ki temeljijo na presaditvi celic, so presečišče interesov predstavnikov celične biologije, razvojne biologije, eksperimentalne genetike, imunologije, nevrologije, kardiologije, hematologije in mnogih drugih vej eksperimentalne in praktične medicine. Najpomembnejši rezultati eksperimentalnih študij dokazujejo možnost reprogramiranja matičnih celic s ciljno usmerjeno spremembo njihovih lastnosti, kar odpira možnosti za nadzor procesov citodiferenciacije z uporabo rastnih faktorjev - za regeneracijo miokarda, obnovo lezij CNS in normalizacijo delovanja otočkov trebušne slinavke. Vendar pa je za široko uvedbo presaditve derivatov matičnih celic (EMC) v praktično medicino potrebno podrobneje preučiti lastnosti človeških matičnih celic in nadaljevati poskuse z ESC na eksperimentalnih modelih bolezni.

Bioetična vprašanja in problem zavrnitve alogenskega celičnega presadka bi lahko rešila odkrita plastičnost genoma regionalnih matičnih celic odraslega organizma. Vendar pa se začetni podatek, da se pri presaditvi izoliranih in skrbno okarakteriziranih hematopoetskih avtolognih celic v jetra, iz katerih izhajajo novi hepatociti, integrirajo v jetrne lobule, zdaj revidira in kritizira. Kljub temu so bili objavljeni podatki, da presaditev nevronskih matičnih celic v timus povzroči nastanek novih donorskih limfocitov T in B, presaditev možganskih nevronskih matičnih celic v kostni mozeg pa vodi do nastanka hematopoetskih kalčkov z dolgoročno donorsko mielo- in eritropoezo. Posledično lahko pluripotentne matične celice, ki so sposobne reprogramirati genom v potencial ESC, vztrajajo v organih odraslega organizma.

Vir pridobivanja matičnih celic (EMC) za medicinske namene ostaja človeški zarodek, kar vnaprej določa neizogibnost novega presečišča moralnih, etičnih, pravnih in verskih vprašanj na mestu nastanka človeškega življenja. Odkritje ESC je dalo močan zagon za nadaljevanje težkih razprav o tem, kje je meja med živimi celicami in materijo, bitjem in osebnostjo. Hkrati pa ni univerzalnih norm, pravil in zakonov glede uporabe ESC v medicini, kljub večkratnim poskusom, da bi jih ustvarili in sprejeli. Vsaka država v okviru svoje zakonodaje to težavo rešuje samostojno. Zdravniki po vsem svetu pa si še naprej prizadevajo, da bi regenerativno-plastično medicino presegli okvir takšnih razprav, predvsem z uporabo rezerv odraslih matičnih celic namesto embrionalnih matičnih celic.

Malo zgodovine izolacije embrionalnih matičnih celic

Celice terato(embrio)karcinoma so bile izolirane iz spontano nastalih teratomov testisov miši 129/ter-Sv, spontanih teratomov jajčnikov miši Lt/Sv in iz teratomov, pridobljenih iz ektopično presajenih embrionalnih celic ali tkiv. Med stabilnimi celičnimi linijami mišjega terato(embrio)karcinoma, pridobljenimi na ta način, so bile nekatere pluripotentne, druge so se diferencirale le v en specifičen tip celic, nekatere pa so bile popolnoma nesposobne za citodiferenciacijo.

Nekoč je bil poudarek na študijah, katerih rezultati so kazali na možnost vrnitve celic terato-(embrio)-karcinoma v normalen fenotip po njihovem vnosu v tkiva razvijajočega se zarodka, pa tudi na delu na ustvarjanju gensko spremenjenih celic terato-(embrio)-karcinoma in vitro, s pomočjo katerih so pridobili mutirane miši za biološko modeliranje dedne patologije pri ljudeh.

Za izolacijo celičnih linij terato-(embrio)-karcinoma je bila uporabljena pogojena suspenzijska gojitev. V kulturi celice terato-(embrio)-karcinoma, tako kot ESC, rastejo v embrioidna telesca in zahtevajo obvezno disociacijo za prenos linije, ohranjanje pluripotentnosti na hranilni plasti embrionalnih fibroblastov ali med suspenzijsko gojitev v pogojenem mediju. Celice pluripotentnih linij terato-(embrio)-karcinoma so velike, okrogle, zanje je značilna visoka aktivnost alkalne fosfataze, tvorijo agregate in so sposobne večsmerne diferenciacije. Ko so vnesene v blastocisto, se agregirajo z morulo, kar vodi do nastanka himernih zarodkov, v sestavi katerih različnih organov in tkiv najdemo derivate celic terato-(embrio)-karcinoma. Vendar pa velika večina takšnih himernih zarodkov umre v maternici, v organih preživelih novorojenih himer pa se tuje celice redko zaznajo in imajo nizko gostoto. Hkrati se močno poveča pojavnost tumorjev (fibrosarkom, rabdomiosarkom, druge vrste malignih tumorjev in adenom trebušne slinavke), degeneracija tumorja pa se pogosto pojavi v obdobju intrauterinega razvoja himernih zarodkov.

Večina celic terato-(embrio)-karcinoma v mikrookolju normalnih embrionalnih celic skoraj naravno pridobi značilnosti malignih neoplastičnih tumorjev. Domneva se, da je ireverzibilna malignost posledica aktivacije protoonkogenov v procesu strukturnih preureditev. Ena od izjem so celice linije embriokarcinoma SST3, pridobljene iz mišjih testikularnih teratomov (linija 129/Sv-ter), ki kažejo visoko sposobnost integracije v tkiva in organe zarodka brez poznejše tvorbe tumorja pri himernih miših. Derivati celičnih linij terato-(embrio)-karcinoma pri himernih miših praktično ne sodelujejo pri nastanku primarnih gonocitov. Očitno je to posledica visoke pogostosti kromosomskih aberacij, značilnih za večino linij terato-(embrio)-karcinoma, v celicah katerih opazimo tako anevploidijo kot kromosomske nepravilnosti.

V laboratorijskih pogojih so pridobili več stabilnih linij človeških celic terato-(embrio)-karcinoma, za katere so značilne pluripotentnost, visoka proliferativna aktivnost in sposobnost diferenciacije med rastjo v kulturah. Zlasti linija človeških celic terato-(embrio)-karcinoma NTERA-2 je bila uporabljena za preučevanje mehanizmov nevronske citodiferenciacije. Po presaditvi celic te linije v subventrikularno regijo prednjega dela možganov novorojenih podgan so opazovali njihovo migracijo in nevrogenezo. Poskusili so celo presaditi nevrone, pridobljene z gojenjem celic linije terato-(embrio)-karcinoma NTERA-2, bolnikom z možgansko kapjo, kar je po mnenju avtorjev privedlo do izboljšanja kliničnega poteka bolezni. Hkrati pri bolnikih z možgansko kapjo ni bilo primerov malignosti presajenih celic linije terato-(embrio)-karcinoma NTERA-2.

Prve linije nediferenciranih pluripotentnih mišjih embrionalnih matičnih celic sta v začetku osemdesetih let prejšnjega stoletja pridobila Evans in Martin, ki sta jih izolirala iz notranje celične mase blastociste - embrioblasta. Izolirane linije ESC so dolgo časa ohranile pluripotentnost in sposobnost diferenciacije v različne tipe celic pod vplivom dejavnikov v posebnem gojišču.

Izraz »embrionalna pluripotentna matična celica« pripada Leroyju Stevensu, ki je med preučevanjem vpliva tobačnega katrana na pojavnost razvoja tumorjev opozoril na spontani pojav teratokarcinoma testisov pri linearnih (129/v) miših kontrolne skupine. Celice teratokarcinomov testisov so imele visoko stopnjo proliferacije in so se v prisotnosti tekočine iz trebušne votline spontano diferencirale z nastankom nevronov, keratinocitov, hondrocitov, kardiomiocitov ter fragmentov las in kosti, vendar brez kakršnih koli znakov urejene citoarhitekture ustreznega tkiva. Ko so bile nameščene v kulturi, so celice teratokarcinoma rasle kot pluripotentni kloni, ki niso bili pritrjeni na substrat, in tvorile embrioidna telesa, nakar so prenehale z delitvijo in so se spontano neurejeno diferencirale v nevrone, glijo, mišične celice in kardiomiocite. Stevens je ugotovil, da mišji teratokarcinom 129/v vsebuje manj kot 1 % celic, ki se lahko diferencirajo v različne specializirane somatske linije, sama diferenciacija pa je odvisna od dejavnikov, ki nanje vplivajo (sestava peritonealne tekočine, produkti zrelih celic ali tkiv, dodanih kulturi). Potrjena je bila hipoteza Leroya Stevensona o prisotnosti embrionalnih progenitorskih celic zarodne linije med celicami teratokarcinoma: suspenzija embrioblastnih celic iz predimplantacijskih zarodkov v tkivih odraslih miši je tvorila teratokarcinome, čiste celične linije, izolirane iz njih po intraperitonealni aplikaciji prejemniškim živalim, pa so se diferencirale v nevrone, kardiomiocite in druge somatske celice, pridobljene iz vseh treh zarodnih plasti. V poskusih in vivo je presaditev embrioblastnih celic (pridobljenih iz embrioblastnih celic, ne pa tudi trofoblasta) v mišje zarodke druge linije v fazah blastomer 8-32 povzročila rojstvo himernih živali (brez razvoja tumorjev), v katerih organih so našli kalčke donorske tkiva. Himerizem so opazili celo v zarodni celični liniji.

Primarne progenitorske zarodne celice, izolirane iz genitalnega rudimenta mišjega zarodka, so se po morfologiji, imunološkem fenotipu in funkcionalnih značilnostih ujemale z embriocelularnimi matičnimi celicami (ESC), ki jih je Stevenson pridobil iz teratokarcinoma in embrioblasta. Pri himerah, rojenih po vnosu ESC v blastocisto, je bila alofenska morfogeneza organov značilna po mozaičnem menjavanju strukturnih in funkcionalnih enot darovalca in prejemnika v jetrih, pljučih in ledvicah. V nekaterih primerih so opazili nastanek črevesnih kript ali jetrnih lobulov, ki so jih sestavljale tako prejemniške kot darovalske celice. Vendar pa je bila morfogeneza vedno izvedena v skladu z genetskim programom vrste, ki ji je prejemnik pripadal, himerizem pa je bil omejen izključno na celično raven.

Takrat je bilo ugotovljeno, da proliferacija embrionalnih matičnih celic (EMC) brez citodiferenciacije na hranilni plasti celic, pridobljenih iz mezenhima (fetalni fibroblasti), poteka ob obvezni prisotnosti LIF v selektivnih hranilnih medijih, ki selektivno zagotavljajo preživetje le matičnih in progenitorskih celic, medtem ko velika večina specializiranih celičnih elementov umre. Z uporabo takšnih metod je leta 1998 James Thomson iz notranje celične mase človeške blastociste izoliral pet immortaliziranih linij embrionalnih matičnih celic. Istega leta je John Gerhart razvil metodo za izolacijo nesmrtnih linij ESC iz genitalnega tuberkula štiri do pet tednov starih človeških zarodkov. Zaradi svojih edinstvenih lastnosti so se le dve leti pozneje embrionalne matične celice in matične celice dokončnih tkiv začele uporabljati v praksi regenerativne medicine in genske terapije.