Mezenhimske matične celice

Med regionalnimi matičnimi celicami imajo posebno mesto mezenhimske matične celice (MSC), katerih derivati sestavljajo stromalni matriks vseh organov in tkiv človeškega telesa. Prednost pri raziskavah MSC imajo predstavniki ruske biološke znanosti.

Sredi prejšnjega stoletja so v laboratoriju A. Friedensteina prvič izolirali homogeno kulturo multipotentnih stromalnih matičnih celic kostnega mozga. Mezenhimske matične celice, pritrjene na substrat, so dolgo časa ohranjale visoko intenzivnost proliferacije, v kulturah z nizko gostoto setve pa so po fiksaciji na substrat tvorile klone celic, podobnih fibroblastom, ki niso imele fagocitne aktivnosti. Prenehanje proliferacije MSC se je končalo z njihovo spontano diferenciacijo in vitro v celice kosti, maščobe, hrustanca, mišic ali vezivnega tkiva. Nadaljnje študije so omogočile ugotovitev osteogenega potenciala celic, podobnih fibroblastom, strome kostnega mozga različnih vrst sesalcev, pa tudi njihove aktivnosti tvorbe kolonij. Poskusi in vivo so pokazali, da tako hetero- kot ortotopska presaditev celic, podobnih fibroblastom, ki tvorijo kolonije, povzroči nastanek kostnega, hrustančnega, vlaknatega in maščobnega tkiva. Ker so stromalne matične celice kostnega mozga značilne po visoki sposobnosti samoobnavljanja in večplastni diferenciaciji znotraj ene same celične linije, jih imenujemo multipotentne mezenhimske progenitorske celice.

Treba je opozoriti, da so bili v več kot 45 letih temeljnih raziskav mezenhimskih matičnih celic ustvarjeni resnični pogoji za uporabo njihovih derivatov v klinični praksi.

Danes ni dvoma, da vsa tkiva človeškega telesa nastanejo iz matičnih celic različnih celičnih linij kot posledica procesov proliferacije, migracije, diferenciacije in zorenja. Vendar pa je do nedavnega veljalo prepričanje, da so matične celice v odraslem organizmu tkivno specifične, tj. da so sposobne proizvajati linije specializiranih celic le tistih tkiv, v katerih se nahajajo. To konceptualno stališče so ovrgla dejstva o transformaciji hematopoetskih matičnih celic ne le v celične elemente periferne krvi, temveč tudi v ovalne celice jeter. Poleg tega se je izkazalo, da so nevronske matične celice sposobne ustvariti tako nevrone kot glialne elemente, pa tudi zgodnje zavezane linije hematopoetskih progenitorskih celic. Mezenhimske matične celice, ki običajno proizvajajo celične elemente kosti, hrustanca in maščobnega tkiva, so sposobne transformacije v nevronske matične celice. Domneva se, da se v procesu rasti, fiziološke in reparativne regeneracije tkiva iz tkivno nespecifičnih matičnih rezerv tvorijo nezavezane progenitorske celice. Na primer, obnova mišičnega tkiva se lahko doseže zaradi migracije mezenhimskih matičnih celic iz kostnega mozga v skeletne mišice.

Čeprav takšne navzkrižne zamenljivosti matičnih celic ne priznavajo vsi raziskovalci, nihče več ne oporeka možnosti klinične uporabe mezenhimskih matičnih celic kot vira za presaditev celic in celičnega vektorja genetskih informacij, prav tako ne oporeka nihče več multipotentnosti stromalnih matičnih celic kostnega mozga, ki jih je mogoče relativno enostavno izolirati in razširiti v in vitro kulturi. Hkrati se v znanstveni literaturi še naprej pojavljajo poročila o potencialni pluripotentnosti stromalnih matičnih celic kostnega mozga. Kot dokaz se navajajo raziskovalni protokoli, v katerih se pod vplivom specifičnih induktorjev transdiferenciacije MSC transformirajo v živčne celice, kardiomiocite in hepatocite. Vendar pa nekateri znanstveniki resno dvomijo o možnosti ponovne aktivacije in izražanja genov iz obdobja zgodnje embriogeneze. Hkrati pa vsi razumejo, da če se najdejo pogoji za razširitev multipotentnosti mezenhimskih matičnih celic na pluripotentnost ESC, se bodo številni etični, moralni, verski in pravni problemi v regenerativni plastični medicini samodejno rešili. Poleg tega, ker v tem primeru vir regenerativnega matičnega potenciala postanejo pacientove avtologne stromalne celice, je rešen tudi problem imunske zavrnitve celičnega presadka. Bližnja prihodnost bo pokazala, kako realne so te možnosti.

[ 1 ], [ 2 ]

Uporaba mezenhimskih matičnih celic v medicini

V kliniki je uporaba derivatov mezenhimskih matičnih celic povezana predvsem z obnovo tkivnih defektov, ki nastanejo pri obsežnih in globokih termičnih kožnih lezijah. V predklinični fazi je bila izvedena eksperimentalna ocena izvedljivosti uporabe alogenskih fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic za zdravljenje globokih opeklin. Pokazalo se je, da mezenhimske matične celice, podobne fibroblastom, v kulturi tvorijo monosloj, kar omogoča njihovo presaditev za optimizacijo procesov regeneracije globokih opeklinskih ran. Avtorji ugotavljajo, da imajo embrionalni fibroblasti podobno lastnost, vendar je njihova klinična uporaba omejena zaradi obstoječih etičnih in pravnih težav. Globoka termična opeklina s poškodbo vseh plasti kože je bila modelirana na podganah Wistar. Površina opekline je bila 18–20 % celotne površine kože. Prva poskusna skupina je vključevala podgane z globoko termično opeklino in presaditvijo alogenskih fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic. Drugo skupino so sestavljale živali z globoko termično opeklino in presaditvijo alogenskih embrionalnih fibroblastov. Tretjo skupino so predstavljale kontrolne podgane z globoko termično opeklino, ki niso bile podvržene celični terapiji. Na površino opeklinske rane je bila s pipeto nanesena suspenzija fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic in embrionalnih fibroblastov v količini 2 x 10⁻⁴ ^.celice drugi dan po modeliranju opekline in izrezu nastale nekrotične kraste. Po presaditvi celic je bila površina opekline prekrita z gazo, navlaženo z izotonično raztopino natrijevega klorida z gentamicinom. Celice kostnega mozga so bile zbrane za pridobitev MSC z njihovo poznejšo indukcijo v linijo fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic odraslih podgan Wistar iz stegnenic. Embrionalni fibroblasti so bili pridobljeni iz pljuč 14-17 dni starih zarodkov. Embrionalni fibroblasti in celice kostnega mozga za pridobitev MSC so bili predhodno gojeni v petrijevkah pri temperaturi 37 °C v CO2 inkubatorju, v atmosferi s 5 % CO2 pri 95 % vlažnosti. Embrionalni fibroblasti so bili gojeni 4-6 dni, medtem ko je za nastanek monosloja MSC potrebovali od 14 do 17 dni. Nato so bile MSC kriokonzervirane kot izvorni material za fibroblastom podobne mezenhimske matične celice, ki so bile pridobljene z odmrzovanjem in 4-dnevnim gojenjem MSC. Število nastalih fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic je bilo več kot 3-krat večje od števila embrionalnih fibroblastov, ki so nastale v istem obdobju gojenja. Za identifikacijo presajenih celic v opeklinskih ranah v fazi gojenja je bil njihov genom označen z virusnim vektorjem, ki temelji na rekombinantnem adenovirusu tipa V, ki nosi gen 1ac-2, ki kodira β-galaktozidazo E. coli. Žive celice v različnih časih po presaditvi so bile imunohistokemično zaznane v kriosekcijah z dodatkom substrata X-Gal, ki daje značilno modro-zeleno barvo. Kot rezultat dinamične vizualne, planimetrične in histološke ocene stanja opeklinske rane je bilo ugotovljeno, da se že 3. dan po presaditvi celic v izbranih skupinah pojavijo pomembne razlike v poteku procesa rane. Ta razlika je postala še posebej izrazita 7. dan po presaditvi celic. Pri živalih prve skupine, ki so jim presadili fibroblastom podobne mezenhimske matične celice, je rana dobila enakomerno intenzivno rožnato barvo, granulacijsko tkivo je po celotni površini zraslo do nivoja epidermisa, površina opekline pa se je znatno zmanjšala. Kolagenski film, ki je nastal na površini rane, je postal nekoliko tanjši, vendar je še naprej pokrival celotno površino opekline. Pri živalih druge skupine, ki so jim presadili embrionalne fibroblaste, se je granulacijsko tkivo dvignilo do nivoja epidermisa robov rane, vendar le ponekod, medtem ko je bila plazmoreja iz rane intenzivnejša kot v 1. skupini, prvotno nastali kolagenski film pa je praktično izginil. Pri živalih, ki niso prejemale celične terapije, je bila opeklinska rana 7. dan bleda, jamkasta, z nekrotičnim tkivom, prekritim s fibrinom. Plazmoreja je bila opažena po celotni površini opekline. Histološko so živali 1. in 2. skupine pokazale zmanjšanje celične infiltracije in razvoj žilne mreže.in ti znaki začetnega regenerativnega procesa so bili bolj izraziti pri podganah 1. skupine. V kontrolni skupini so opazili znake celične infiltracije rane, histološki vzorec novo nastalih žil pa je bil odsoten. Od 15. do 30. dne opazovanja je bila površina opeklinske površine pri živalih 1. skupine bistveno manjša kot pri podganah drugih skupin, granulacijska površina pa je bila bolj razvita. Pri živalih 2. skupine se je površina opeklinske površine prav tako zmanjšala v primerjavi z velikostjo opeklinskih ran pri podganah kontrolne skupine, kar je nastalo zaradi marginalne epitelizacije. V kontrolni skupini je opeklinska površina ostala ponekod bleda z redkimi granulacijami, na njej so se pojavile žilne zvezdice, prisotni so bili otočki fibrinske obloge, zmerna plazmoreja se je nadaljevala po celotni površini opekline, ponekod pa je ostala krasta, ki jo je bilo težko ločiti. Na splošno se je pri živalih 3. skupine tudi velikost rane zmanjšala, robovi rane pa so ostali spodkopani.

Tako je bila med primerjalno študijo hitrosti celjenja ran z uporabo fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic in embrionalnih fibroblastov, kot tudi brez uporabe celične terapije, opažena pospešitev hitrosti celjenja opekline kot posledica presaditve fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic in embrionalnih fibroblastov. Vendar pa je bila v primeru uporabe alogenskih fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic hitrost celjenja ran višja kot pri presaditvi embrionalnih fibroblastov. To se je izrazilo v pospešitvi spremembe faz regenerativnega procesa - skrajšali so se roki celične infiltracije, povečala se je hitrost rasti žilne mreže in tvorbe granulacijskega tkiva.

Rezultati dinamične planimetrije kažejo, da je bila stopnja spontanega celjenja opeklinske rane (brez uporabe celične terapije) najnižja. 15. in 30. dan po presaditvi alogenskih fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic je bila stopnja celjenja ran višja kot pri presaditvi embrionalnih fibroblastov. Histokemična metoda za odkrivanje beta-galaktozidaze je pokazala, da po presaditvi fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic in embrionalnih fibroblastov presajene celice ostanejo sposobne preživetja na površini in v globini regenerirajočih se ran skozi celotno obdobje opazovanja. Avtorji menijo, da je višja stopnja regeneracije opeklinske rane z uporabo fibroblastom podobnih mezenhimskih matičnih celic posledica sproščanja biološko aktivnih rastno stimulirajočih faktorjev s strani teh celic med procesom zorenja.

V klinični praksi se uporablja tudi presaditev avto- ali alogenskih keratinocitov in alogenskih fibroblastov za zdravljenje opeklinskih ran. Treba je opozoriti, da je kirurško zdravljenje otrok z obsežnimi globokimi opeklinami zapletena naloga zaradi visoke travmatične narave in večkratnih kirurških posegov, znatne izgube krvi in različnih reakcij na uporabljene infuzijske medije. Glavne težave pri izvajanju kožnih plastičnih operacij pri obsežnih globokih opeklinah, katerih površina presega 40 % telesne površine, so posledica resnosti stanja žrtev in pomanjkanja virov donorske kože. Uporaba mrežastih presadkov z visokim koeficientom perforacije problema ne reši, saj celice, ki nastanejo po perforaciji, epitelizirajo zelo počasi, kožni loputi pa se pogosto lizirajo ali izsušijo. Takšne obloge za opeklinske rane, kot so ksenoskina, kadaverski alografti, sintetične filmske obloge, niso vedno dovolj učinkovite, zato se razvijajo nove metode prekrivanja opeklinskih površin s plastmi gojenih keratinocitov in fibroblastov. Predvsem je bila predlagana metoda prekrivanja opeklinskih površin s pomočjo gojenih alofibroblastov, ki imajo po presaditvi izrazit spodbudni učinek na proliferacijo epidermocitiv, ohranjenih v rani pri mejnih opeklinah, pa tudi keratinocitov v septumah mrežastih presadkov. Delo L. Budkevicha in soavtorjev (2000) predstavlja rezultate uporabe te metode za zdravljenje opeklin pri otrocih. V študijo je bilo vključenih 31 otrok s toplotno travmo, starih od 1 leta do 14 let. Pri treh otrocih je bila skupna površina opeklinskih ran stopnje IIIA-B - IV 40 %, pri 25 - 50-70 %, pri nadaljnjih treh - 71-85 % telesne površine. Zgodnja kirurška nekrektomija je bila kombinirana s presaditvijo gojenih alofibroblastov in avtodermoplastiko. Prva faza zdravljenja je vključevala ekscizijo nekrotičnih tkiv, druga faza je vključevala presaditev gojenih alofibroblastov na nosilne filme, tretja faza (48 ur po presaditvi gojenih alofibroblastov) pa je vključevala odstranitev matrice in avtodermoplastiko s kožnimi loputami z razmerjem perforacije 1:4. Trem bolnikom, sprejetim v kliniko s hudo opeklinsko boleznijo, so gojene alofibroblaste presadili na granulirajoče rane. Presaditev gojenih alofibroblastov je bila opravljena enkrat pri 18 otrocih, dvakrat pri 11 otrocih in trikrat pri dveh bolnikih. Površina rane, prekrita s celično kulturo, se je gibala od 30 do 3500 cm2. Učinkovitost gojenih alofibroblastov je bila ocenjena s skupnim odstotkom prijetja kožnega presadka, časom celjenja opeklin in številom smrtnih primerov zaradi hude toplotne travme. Prijetje presadka je bilo popolno pri 86 % bolnikov. Delno neprijetje kožnih presadkov je bilo opaženo v 14 % primerov. Kljub zdravljenju je umrlo šest (19,3 %) otrok. Skupna površina poškodbe kože pri njih se je gibala od 40 do 70 % telesne površine.Presaditev gojenih alofibroblastov pri nobenem bolniku ni bila povezana s smrtnostjo pri opeklinah.

Avtorji pri analizi rezultatov zdravljenja ugotavljajo, da so bile predhodno globoke termične poškodbe kože, ki so pokrivale 35–40 % telesne površine, ocenjene kot nezdružljive z življenjem (za mlajše otroke – do 3. leta starosti – so kritične globoke opekline, ki so pokrivale 30 % telesne površine, za starejše otroke – več kot 40 % telesne površine). Pri izvajanju kirurške nekrektomije s presaditvijo gojenih alofibroblastov in naknadno avtodermoplastiko s kožnimi loputami z visokim koeficientom perforacije ostajajo opekline IIIB–IV stopnje kritične, vendar trenutno obstajajo možnosti za rešitev življenj tudi takšnih žrtev v mnogih primerih. Kirurška nekrektomija v kombinaciji s presaditvijo gojenih alofibroblastov in avtodermoplastiko pri otrocih z globokimi opeklinami se je izkazala za še posebej učinkovito pri bolnikih z razširjenimi kožnimi lezijami s pomanjkanjem donorskih mest. Aktivna kirurška taktika in presaditev gojenih alofibroblastov prispevata k hitri stabilizaciji splošnega stanja takšnih bolnikov, zmanjšanju števila infekcijskih zapletov opeklinske bolezni, ustvarjanju ugodnih pogojev za prijemanje presadkov, skrajšanju časa obnove izgubljene kože in trajanja bolnišničnega zdravljenja ter zmanjšanju pogostosti smrtnih izidov pri žrtvah z obsežnimi opeklinami. Tako presaditev gojenih alofibroblastov s poznejšo avtodermoplastiko s kožnimi loputami omogoča okrevanje pri otrocih s hudimi opeklinami, ki so prej veljali za obsojene na propad.

Splošno sprejeto je, da je primarni cilj zdravljenja opeklin čim bolj popolna in hitra obnova poškodovane kože, da se preprečijo toksični učinki, infekcijski zapleti in dehidracija. Rezultati uporabe gojenih celic so v veliki meri odvisni od pripravljenosti same opeklinske rane za presaditev. V primerih presaditve gojenih keratinocitov na površino rane po kirurški nekrektomiji se v povprečju 55 % (po površini) presajenih celic prime, medtem ko se pri granulirajočih ranah stopnja primesa zmanjša na 15 %. Zato uspešno zdravljenje obsežnih globokih opeklin kože zahteva predvsem aktivno kirurško taktiko. Pri opeklinskih ranah IIIB-IV stopnje se površina opekline takoj očisti nekrotičnega tkiva, da se zmanjša zastrupitev in zmanjša število zapletov opeklin. Uporaba takšne taktike je ključ do skrajšanja časa od trenutka opekline do zaprtja ran in dolžine bivanja bolnikov z obsežnimi opeklinami v bolnišnici, poleg tega pa znatno zmanjša število smrtnih izidov.

Prva poročila o uspešni uporabi gojenih keratinocitov za prekrivanje opeklinskih površin so se pojavila v zgodnjih osemdesetih letih prejšnjega stoletja. Kasneje so to manipulacijo izvajali z uporabo plasti gojenih keratinocitov, najpogosteje pridobljenih iz avtocelic, veliko redkeje iz alokeratinocitov. Vendar pa tehnologija avtokeratinocitoplastike ne omogoča ustvarjanja celične banke, medtem ko je čas, potreben za izdelavo presadka keratinocitov zadostne površine, dolg in znaša 3-4 tedne. V tem obdobju se tveganje za razvoj infekcijskih in drugih zapletov opeklinske bolezni močno poveča, kar znatno podaljša skupni čas bivanja bolnikov v bolnišnici. Poleg tega se avtokeratinociti praktično ne ukoreninijo pri presaditvi na granulirajoče opeklinske rane, visoki stroški posebnih rastnih medijev in biološko aktivnih stimulatorjev rasti keratinocitov pa znatno omejujejo njihovo klinično uporabo. Druge biotehnološke metode, kot so kolagenoplastika, presaditev krioprezervirane ksenoskene in uporaba različnih biopolimernih premazov, povečujejo učinkovitost zdravljenja obsežnih površinskih, ne pa globokih opeklin. Metoda prekrivanja površine rane z gojenimi fibroblasti se bistveno razlikuje po tem, da se kot glavna sestavina plasti gojenih celic uporabljajo fibroblasti in ne keratinociti.

Predpogoj za razvoj metode je bil podatek, da so periciti, ki obdajajo majhne žile, progenitorske mezenhimske celice, ki se lahko transformirajo v fibroblaste, ki proizvajajo številne rastne faktorje in zagotavljajo celjenje ran zaradi močnega stimulativnega učinka na proliferacijo in adhezijo keratinocitov. Uporaba gojenih fibroblastov za zapiranje ranskih površin je takoj razkrila številne pomembne prednosti te metode v primerjavi z uporabo gojenih keratinocitov. Zlasti pridobivanje fibroblastov v kulturi ne zahteva uporabe posebnih hranilnih medijev in rastnih stimulansov, kar zmanjša stroške presaditve za več kot 10-krat v primerjavi s stroški pridobivanja keratinocitov. Fibroblasti se zlahka pasivizirajo, pri čemer delno izgubijo površinske antigene histokompatibilnosti, kar posledično odpira možnost uporabe alogenskih celic za izdelavo presadkov in ustvarjanje njihovih bank. Čas, potreben za pridobitev presadkov, pripravljenih za uporabo v kliniki, se skrajša s 3 tednov (za keratinocite) na 1-2 dni (za fibroblaste). Primarno kulturo fibroblastov lahko dobimo z gojenjem celic iz fragmentov kože, odvzetih med avtodermoplastiko, gostota sejanja celic za pridobitev subkultur človeških fibroblastov pa je le 20 x 10³ ^na 1 ^cm².

Za preučevanje vpliva fibroblastov in njihovih regulatornih proteinov na proliferacijo in diferenciacijo keratinocitov je bila izvedena primerjalna analiza morfologije in proliferacije keratinocitov na substratih kolagena tipov I in III ter fibronektina v skupni kulturi s človeškimi fibroblasti. Človeški keratinociti so bili izolirani iz fragmentov kože bolnikov z opeklinami, odvzetih med avtodermoplastiko. Gostota zasejanja keratinocitov je bila 50 x 103 celic na 1 cm2. Klinična učinkovitost presaditve gojenih fibroblastov je bila ocenjena pri 517 bolnikih. Vsi bolniki so bili razdeljeni v dve skupini: Skupina 1 - odrasli bolniki z opeklinami IIA, B - IV stopnje; Skupina 2 - otroci z globokimi opeklinami IIIB - IV stopnje. Ocena dinamike strukturne in funkcionalne organizacije fibroblastov v monoslojni kulturi ob upoštevanju vloge glikozaminoglikanov, fibronektina in kolagena v procesih regeneracije je avtorjem omogočila, da so 3. dan določili kot najugodnejše obdobje za uporabo kultur fibroblastov za izdelavo presaditev. Študija vpliva fibroblastov na proliferacijo in diferenciacijo keratinocitov je pokazala, da imajo fibroblasti in vitro izrazit stimulativni učinek, predvsem na procese adhezije keratinocitov, saj povečajo število pritrjenih celic in hitrost njihove fiksacije za več kot 2-krat. Stimulacijo adhezijskih procesov spremlja povečanje intenzivnosti sinteze DNK in stopnje proliferacije keratinocitov. Poleg tega se je izkazalo, da je prisotnost fibroblastov in zunajceličnega matriksa, ki ga tvorijo, nujen pogoj za nastanek tonofibrilarnega aparata keratinocitov, medceličnih povezav in končno za diferenciacijo keratinocitov in nastanek bazalne membrane. Pri zdravljenju otrok z globokimi opeklinami je bila ugotovljena visoka klinična učinkovitost presaditve kulture alofibroblastov, zlasti v skupini bolnikov z obsežnimi kožnimi lezijami v pogojih pomanjkanja donorskega mesta. Celovita morfofunkcionalna študija je pokazala, da so za presaditvene fibroblaste značilna aktivna sinteza DNK, pa tudi kolagena, fibronektina in glikozaminoglikanov, ki so del zunajceličnega matriksa, ki ga tvorijo celice. Avtorji opozarjajo na visok odstotek prijema presajenih fibroblastov (do 96 %), močno skrajšanje časa njihovega prejema (v 24–48 urah namesto 2–3 tednih v primeru uporabe keratinocitov), znatno pospešitev epitelizacije opekline, pa tudi znatno zmanjšanje stroškov (za 10-krat) tehnologije za gojenje presadka iz fibroblastov v primerjavi s presaditvijo keratinocitov. Uporaba presaditve gojenih alofibroblastov omogoča reševanje življenj otrok s kritičnimi opeklinami – toplotno poškodbo več kot 50 % telesne površine,kar je prej veljalo za nezdružljivo z življenjem. Treba je opozoriti, da je bila s presaditvijo alogenskih embrionalnih fibroblastov prepričljivo dokazana ne le hitrejša regeneracija ran in okrevanje bolnikov z različnimi stopnjami in območji opeklin, temveč tudi znatno zmanjšanje njihove umrljivosti.

Avtologni fibroblasti se uporabljajo tudi na tako kompleksnem področju plastične kirurgije, kot je rekonstruktivna korekcija poškodb glasilk. Za ta namen se običajno uporablja goveji kolagen, katerega trajanje delovanja je omejeno z njegovo imunogenostjo. Ker je goveji kolagen tuja beljakovina, je občutljiv na kolagenazo prejemnika in lahko povzroči imunske reakcije, za zmanjšanje tveganja zanje pa so bile razvite tehnologije za pridobivanje kolagenskih pripravkov, zamreženih z glutaraldehidom. Njihova prednost je v večji stabilnosti in nižji imunogenosti, kar je našlo praktično uporabo pri odpravljanju okvar in atrofije glasilk. Injekcije avtolognega kolagena so bile prvič uporabljene leta 1995. Tehnika je zagotovila ohranitev primarne strukture avtolognih kolagenskih vlaken, vključno z intramolekularnimi encimsko kataliziranimi zamreženimi povezavami. Dejstvo je, da so naravna kolagena vlakna bolj odporna na uničenje s proteazami kot rekonstituirani kolagen, v katerem so telopeptidi prerezani. Celovitost telopeptidov je pomembna za kvartarno strukturo kolagenskih vlaken in nastanek zamreženih povezav med sosednjimi molekulami kolagena. Za razliko od pripravkov govejega kolagena avtologni kolagen pri prejemniku ne povzroča imunskih reakcij, vendar ni dovolj učinkovit kot obnavljajoče sredstvo. Stabilno korekcijo je mogoče doseči z lokalno proizvodnjo kolagena s presaditvijo avtolognih fibroblastov. Vendar pa so bile med preučevanjem učinkovitosti avtologne presaditve fibroblastov v kliniki ugotovljene določene težave. V zgodnjem obdobju po presaditvi fibroblastov je bil klinični učinek šibkejši v primerjavi s tistim po uvedbi govejega kolagena. Pri gojenju avtolognih fibroblastov ni mogoče izključiti možnosti transformacije normalnih fibroblastov v patološke, tako imenovane miofibroblaste, ki so odgovorni za razvoj fibroze in nastanek brazgotin, kar dokazuje krčenje kolagenskega gela, ki ga povzroča specifična interakcija fibroblastov in kolagenskih fibril. Poleg tega fibroblasti po serijskem pasiranju in vitro izgubijo sposobnost sinteze beljakovin zunajceličnega matriksa.

Vendar pa je bila eksperimentalno razvita metoda za gojenje avtolognih človeških fibroblastov, ki odpravlja zgoraj omenjene pomanjkljivosti in ne povzroča onkogene transformacije normalnih fibroblastov. Avtologni fibroblasti, pridobljeni s to metodo, se uporabljajo za obnovo okvar mehkih tkiv obraza. V študiji G. Kellerja in sodelavcev (2000) je bilo zdravljenih 20 bolnikov, starih od 37 do 61 let, z gubami in atrofičnimi brazgotinami. Kožne biopsije (4 mm) iz retroavrikularne regije so bile v laboratorij prenesene v sterilnih epruvetah, ki so vsebovale 10 ml gojišča (Eagleov medij z antibiotikom, mikoseptikom, piruvatom in fetalnim telečjim serumom). Material je bil nameščen v 3–5 gojitvenih posodic s premerom 60 mm in inkubiran v termostatu z atmosfero, ki je vsebovala 5 % CO2. Po enem tednu so bile celice s tripsinizacijo odstranjene iz posodic in nameščene v 25 cm2 viale. Celice so bile injicirane pacientom v količini 4 x 107. Pomemben in trajen klinični učinek so opazili pri pacientih med korekcijo nazolabialnih gub, pa tudi pri pacientih z brazgotinami 7 in 12 mesecev po tretji presaditvi avtolognih fibroblastov. Po podatkih pretočne citometrije so gojeni fibroblasti proizvedli veliko količino kolagena tipa I. Študije in vitro so pokazale normalno kontraktilnost injiciranih fibroblastov. Dva meseca po subkutani aplikaciji gojenih fibroblastov v odmerku 4 x 107 celic pri golih miših niso odkrili tumorjev. Injicirani fibroblasti pri pacientih niso povzročili brazgotinjenja ali difuzne fibroze. Po mnenju avtorja so presajeni avtologni fibroblasti sposobni nenehno proizvajati kolagen, kar bo zagotovilo kozmetični pomlajevalni učinek. Hkrati so fibroblasti, odvzeti mlademu pacientu, ker je življenjska doba diferenciranih celic omejena, učinkovitejši od tistih, pridobljenih od starejših ljudi. V prihodnosti se predvideva, da bo mogoče krioprezervirati kulturo fibroblastov, odvzetih mlademu darovalcu, da bi kasneje presadili lastne mlade celice starejšemu pacientu. Skratka, ni povsem pravilno sklepati, da so avtologni fibroblasti, če so funkcionalno ohranjeni, idealno sredstvo za odpravljanje napak mehkih tkiv obraza. Hkrati avtor sam ugotavlja, da so se med študijo pojavile nekatere problematične situacije, povezane z uporabo avtolognega sistema fibroblast-kolagen. Klinični učinek je bil pogosto šibkejši kot pri uporabi govejega kolagena, kar je pri pacientih povzročalo razočaranje.

Na splošno so podatki iz literature o možnostih klinične uporabe mezenhimskih matičnih celic precej optimistični. Poskusi uporabe avtolognih multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic kostnega mozga za zdravljenje degenerativnih sklepnih lezij so v teku. Izvajajo se prva klinična preskušanja uporabe gojenih mezenhimskih progenitorskih celic pri zdravljenju kompleksnih zlomov kosti. Avto- in alogenske mezenhimske stromalne celice kostnega mozga se uporabljajo za ustvarjanje hrustančnega tkiva za presaditev pri korekciji okvar sklepnega hrustanca zaradi travme ali avtoimunskih lezij. Razvijajo se metode za klinično uporabo multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic za odpravo kostnih okvar pri otrocih s hudo obliko nepopolne osteogeneze, ki jo povzročajo mutacije v genu za kolagen tipa I. Po mieloablaciji se otrokom prejemnikom presadi kostni mozeg zdravih darovalcev, združljivih s HLA, saj lahko nefrakcioniran kostni mozeg vsebuje zadostno število mezenhimskih matičnih celic za kompenzacijo hude kostne okvare. Po presaditvi alogenskega kostnega mozga so taki otroci pokazali pozitivne histološke spremembe v trabekularnih kosteh, povečanje stopnje rasti in zmanjšanje incidence zlomov kosti. V nekaterih primerih se pozitiven klinični rezultat doseže s presaditvijo tesno sorodnega alogenskega kostnega mozga in osteoblastov. Presaditev mezenhimskih matičnih celic (MSC) se uporablja tudi za zdravljenje prirojene krhkosti kosti, ki jo povzroča neravnovesje osteoblastov in osteoklastov v kostnem tkivu. V tem primeru se obnovitev tvorbe kosti doseže s himerizacijo bazena matičnih in progenitornih stromalnih celic v kostnem tkivu bolnikov.

Izboljšanje metod genske modifikacije donorskih mezenhimskih matičnih celic z namenom odprave genetskih okvar stromalnih tkiv se nadaljuje. Predvideva se, da se bodo mezenhimske progenitorske celice v bližnji prihodnosti uporabljale v nevrologiji za ciljno himerizacijo možganskih celic in ustvarjanje zdravega nabora celic, ki bodo sposobne proizvajati pomanjkljiv encim ali faktor, odgovoren za klinične manifestacije bolezni. Presaditev mezenhimskih matičnih celic se lahko uporabi za obnovo strome kostnega mozga pri bolnikih z rakom po radio- in kemoterapiji, v kombinaciji s celicami kostnega mozga pa za obnovo hematopoeze. Razvoj nadomestne terapije, namenjene odpravljanju okvar mišično-skeletnega sistema s pomočjo mezenhimskih matičnih celic, spodbujajo inženirski dosežki na področju oblikovanja matričnih biomaterialov ali biomimetikov, ki tvorijo ogrodja, naseljena s potomci mezenhimskih matičnih celic.

Viri mezenhimskih matičnih celic

Glavni vir mezenhimskih matičnih celic je kostni mozeg, katerega hematopoetske matične celice se v telesu sesalcev nenehno diferencirajo v krvne in imunske celice, medtem ko mezenhimske matične celice predstavlja majhna populacija fibroblastom podobnih celic strome kostnega mozga in prispeva k ohranjanju nediferenciranega stanja hematopoetskih matičnih celic. Pod določenimi pogoji se mezenhimske matične celice diferencirajo v celice hrustanca in kostnega tkiva. Ko so zasejane na gojišče v pogojih nizke gostote setve, mononuklearne stromalne celice kostnega mozga tvorijo kolonije adhezivnih celic, ki so pravzaprav fibroblastom podobne multipotentne mezenhimske progenitorske celice. Nekateri avtorji menijo, da se v kostnem mozgu odlagajo nevezane mezenhimske matične celice, ki zaradi svoje sposobnosti samoobnavljanja in visokega potenciala diferenciacije oskrbujejo vsa tkiva v telesu z mezenhimskimi predhodniki stromalnih elementov skozi celotno življenje sesalskega organizma.

V kostnem mozgu stromalni celični elementi tvorijo mrežo, ki zapolnjuje prostor med sinusoidi in kostnim tkivom. Vsebnost mirujočih MSC v kostnem mozgu odrasle osebe je primerljiva s količino hematopoetskih matičnih celic in ne presega 0,01–0,001 %. Mezenhimske matične celice, izolirane iz kostnega mozga in ne gojene, so brez adhezijskih molekul. Takšne MSC ne izražajo CD34, ICAM, VCAM, kolagena tipa I in III, CD44 in CD29. Posledično in vitro na substrat kulture niso fiksirane mezenhimske matične celice, temveč naprednejši progenitorni derivati mezenhimskih matičnih celic, ki so že oblikovali komponente citoskeleta in receptorski aparat molekul celične adhezije. Stromalne celice s fenotipom CD34 najdemo celo v periferni krvi, čeprav jih je v kostnem mozgu bistveno manj kot CD34-pozitivnih mononuklearnih celic. Celice CD34, izolirane iz krvi in prenesene v kulturo, se pritrdijo na substrat in tvorijo kolonije celic, podobnih fibroblastom.

Znano je, da v embrionalnem obdobju stromalna osnova vseh organov in tkiv sesalcev in ljudi izhaja iz skupnega nabora mezenhimskih matičnih celic pred in v fazi organogeneze. Zato velja, da bi morala biti v zrelem organizmu večina mezenhimskih matičnih celic v vezivnem in kostnem tkivu. Ugotovljeno je bilo, da glavni del celičnih elementov strome rahlega vezivnega in kostnega tkiva predstavljajo zavezane progenitorske celice, ki pa ohranijo sposobnost proliferacije in tvorbe klonov in vitro. Ko takšne celice vnesemo v splošni krvni obtok, se več kot 20 % mezenhimskih progenitorskih celic vsadi med stromalne elemente hematopoetskega tkiva in parenhimskih organov.

Potencialni vir mezenhimskih matičnih celic je maščobno tkivo, med matičnimi celicami katerega so bili identificirani adipocitni prekurzorji v različni stopnji. Najmanj zreli progenitorni elementi maščobnega tkiva so stromalno-žilne celice, ki se tako kot multipotentne mezenhimske prekurzorske celice kostnega mozga lahko diferencirajo v adipocite pod vplivom glukokortikoidov, insulinu podobnega rastnega faktorja in insulina. V kulturi se stromalno-žilne celice diferencirajo v adipocite in hondrocite, v maščobnem tkivu kostnega mozga pa so celice, ki tvorijo adipocite in osteoblaste.

Stromalne matične celice so bile najdene tudi v mišicah. V primarni kulturi celic, izoliranih iz človeških skeletnih mišic, so bile odkrite zvezdaste celice in večjedrne miotube. V prisotnosti konjskega seruma se zvezdaste celice in vitro razmnožujejo brez znakov citodiferenciacije, po dodatku deksametazona v hranilni medij pa je njihova diferenciacija značilna po pojavu celičnih elementov s fenotipom skeletnih in gladkih mišičnih celic, kosti, hrustanca in maščobnega tkiva. Zato so v človeškem mišičnem tkivu prisotne tako zavezane kot nezavezane multipotentne mezenhimske progenitorske celice. Dokazano je, da populacija progenitorskih celic, prisotnih v skeletnih mišicah, izvira iz nezavezanih multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic kostnega mozga in se razlikuje od miogenih satelitskih celic.

V miokardiju novorojenih podgan so bile najdene tudi adhezivne zvezdaste celice, ki po diferenciacijskem potencialu ustrezajo multipotentnim mezenhimskim progenitornim celicam, saj se pod vplivom deksametazona diferencirajo v adipocite, osteoblaste, hondrocite, gladkomišične celice, miotube skeletnih mišic in kardiomiocite. Dokazano je bilo, da so žilne gladkomišične celice (periciti) derivati nediferenciranih perivaskularnih multipotentnih mezenhimskih progenitornih celic. V kulturi perivaskularne mezenhimske matične celice izražajo gladkomišični α-aktin in receptor za rastni faktor, pridobljen iz trombocitov, ter so sposobne diferenciacije vsaj v gladkomišične celice.

Posebno mesto z vidika matičnih rezerv zavzema hrustančno tkivo, katerega izjemno nizek reparativni potencial naj bi bil posledica pomanjkanja multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic oziroma diferenciacijskih in rastnih faktorjev. Domneva se, da multipotentne mezenhimske progenitorske celice, predhodno zavezane hondro- in osteogenezi, vstopajo v hrustančno tkivo iz drugih tkivnih virov.

Prav tako niso bili ugotovljeni tkivni izvor in pogoji vezave mezenhimskih progenitorskih celic v tetive. Eksperimentalna opazovanja kažejo, da celice Ahilove tetive kuncev v zgodnjem postnatalnem obdobju v primarnih kulturah in pri prvem pasiranju ohranijo izražanje kolagena tipa I in dekorina, vendar z nadaljnjo kultivacijo izgubijo diferenciacijske markerje tenocitov.

Treba je opozoriti, da odgovor na vprašanje, ali so multipotentne mezenhimske progenitorske celice, lokalizirane v različnih tkivih, dejansko stalno prisotne v njihovi stromi ali pa se tkivni bazen mezenhimskih matičnih celic polni z migracijo stromalnih matičnih celic kostnega mozga, še ni bil prejet.

Poleg kostnega mozga in drugih mezenhimskih tkivnih con odraslega organizma je lahko popkovnična kri še en vir MSC. Dokazano je, da popkovnična venska kri vsebuje celice, ki imajo podobne morfološke in antigenske značilnosti kot multipotentne mezenhimske progenitorne celice, so sposobne adhezije in niso slabše od multipotentnih mezenhimskih progenitornih celic kostnega mozga v potencialu diferenciacije. V kulturah mezenhimskih matičnih celic popkovnične krvi so našli od 5 do 10 % nevezanih multipotentnih mezenhimskih progenitornih celic. Izkazalo se je, da je njihovo število v popkovnični krvi obratno sorazmerno z gestacijsko starostjo, kar posredno kaže na migracijo multipotentnih mezenhimskih progenitornih celic v različna tkiva med fetalnim razvojem. Pojavile so se prve informacije o klinični uporabi mezenhimskih matičnih celic, izoliranih iz popkovnične krvi, pa tudi tistih, pridobljenih iz embrionalnega biomateriala, kar temelji na znani sposobnosti fetalnih matičnih celic, da se integrirajo, primejo in delujejo v organih in tkivnih sistemih odraslih prejemnikov.

Iskanje novih virov mezenhimskih matičnih celic

Uporaba mezenhimskih matičnih celic embrionalnega izvora, pa tudi drugih fetalnih celic, ustvarja številne etične, pravne, sodne in zakonodajne težave. Zato se iskanje materiala zunajembrionalnih darovalcev celic nadaljuje. Poskus klinične uporabe človeških kožnih fibroblastov ni bil uspešen, kar ni bilo vnaprej določeno le z visoko finančno zmogljivostjo tehnologije, temveč tudi s hitro diferenciacijo fibroblastov v fibrocite, ki imajo bistveno nižji proliferacijski potencial in proizvajajo omejeno število rastnih faktorjev. Nadaljnji napredek pri preučevanju biologije MSC in multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic kostnega mozga nam je omogočil razvoj strategije za klinično uporabo avtolognih mezenhimskih matičnih celic. Tehnologija njihove izolacije, gojenja, razmnoževanja ex vivo in ciljne diferenciacije je zahtevala predvsem preučevanje spektra molekularnih markerjev MSC. Njihova analiza je pokazala, da primarne kulture človeškega kostnega tkiva vsebujejo več vrst multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic. Proosteoblastni fenotip so odkrili v celicah, ki izražajo marker stromalnih progenitorskih celic STRO-1, vendar ne nosijo osteoblastnega markerja - alkalne fosfataze. Za take celice je značilna nizka sposobnost tvorbe mineraliziranega kostnega matriksa, pa tudi odsotnost izražanja osteopontina in receptorjev za paratiroidni hormon. Derivati STRO-1-pozitivnih celic, ki ne izražajo alkalne fosfataze, so predstavljeni s srednje in popolnoma diferenciranimi osteoblasti. Ugotovljeno je bilo, da so celični elementi kloniranih linij STRO-1-pozitivnih človeških trabekularnih kostnih celic sposobni diferenciacije v zrele osteocite in adipocite. Smer diferenciacije teh celic je odvisna od učinka polinenasičenih maščobnih kislin, provnetnih citokinov - IL-1b in faktorja tumorske nekroze a (TNF-a), pa tudi od protivnetnega in imunosupresivnega TGF-b.

Kasneje je bilo ugotovljeno, da multipotentne mezenhimske progenitorske celice nimajo specifičnega fenotipa, ki je lasten samo njim, vendar izražajo kompleks markerjev, značilnih za mezenhimske, endotelijske, epitelijske in mišične celice, če ni izražanja imunofenotipskih antigenov hematopoetskih celic - CD45, CD34 in CD14. Poleg tega mezenhimske matične celice konstitutivno in inducibilno proizvajajo hematopoetske in nehematopoetske rastne faktorje, interlevkine in kemokine, na multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celicah pa se izražajo receptorji za nekatere citokine in rastne faktorje. Med celicami stromalnega matriksa človeškega telesa so bile najdene mirujoče ali počivajoče celice z imunofenotipom, ki je skoraj enak antigenskemu profilu multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic, neobdelanih s 5-fluorouracilom - obe celici izražata CD117, ki označuje "odrasle" matične celice.

Torej celični označevalec, edinstven za mezenhimske matične celice, še ni bil identificiran. Domneva se, da mirujoče celice predstavljajo populacijo nevezanih multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic, saj ne izražajo označevalcev celic, vezanih na osteo- (Cbfa-1) ali adipogenezo (PPAR-γ-2). Dolgotrajna izpostavljenost počasi proliferirajočih mirujočih celic fetalnemu govejemu serumu vodi do nastanka terminalno diferencirajočih se vezanih progenitorjev, za katere je značilna hitra rast. Klonsko ekspanzijo takšnih mezenhimskih matičnih celic podpira FGF2. Zdi se, da je genom stromalnih matičnih celic precej tesno "zaprt". Obstajajo poročila o odsotnosti spontane diferenciacije v MSC - brez posebnih pogojev za vezavo se ne transformirajo niti v celice mezenhimske linije.

Za preučevanje populacijske strukture derivatov mezenhimskih matičnih celic se izvaja iskanje markerjev diferenciacije na stromalnih celičnih linijah in v primarnih kulturah. In vitro klonska analiza celic, ki tvorijo kolonije kostnega mozga, je pokazala, da EGF poveča povprečno velikost kolonije in zmanjša klonsko izražanje alkalne fosfataze, ko se nanese na primarne kulture, medtem ko dodatek hidrokortizona aktivira izražanje alkalne fosfataze, ki je marker osteogene smeri diferenciacije MSC. Monoklonska protitelesa proti STRO-1 so omogočila ločitev in preučevanje populacije adhezivnih celic, pozitivnih na STRO-1, v heterogenem sistemu Dexterjevih kultur. Določen je bil spekter citokinov, ki uravnavajo ne le proliferacijo in diferenciacijo hematopoetskih in limfoidnih celic, temveč sodelujejo tudi pri nastanku, tvorbi in resorpciji skeletnih tkiv prek para-, avto- in endokrinih mehanizmov. Za analizo markerjev različnih kategorij celic stromalnega tkiva, ki izražajo ustrezne receptorje, se uporablja tudi sproščanje sekundarnih prenašalcev, kot so cAMP, diacilglicerol, inozitol trifosfat in Ca2+, ki ga posredujejo receptorji. Uporaba monoklonskih protiteles kot markerjev je omogočila ugotovitev pripadnosti retikularnih celic strome limfoidnih organov T- in B-odvisnim conam.

Nekaj časa so se nadaljevale znanstvene razprave o vprašanju možnosti izvora MSC iz hematopoetskih matičnih celic. Dejansko, ko suspenzije celic kostnega mozga eksplantiramo v monoslojne kulture, v njih rastejo diskretne kolonije fibroblastov. Vendar pa se je pokazalo, da prisotnost predhodnikov kolonij fibroblastov in različnih kalčkov diferenciacije hematopoetskega tkiva v kostnem mozgu ni dokaz njihovega skupnega izvora iz hematopoetske matične celice. Z diskriminantno analizo matičnih celic kostnega mozga je bilo ugotovljeno, da se mikrookolje med heterotopno presaditvijo kostnega mozga ne prenaša s hematopoetskimi celicami, kar dokazuje obstoj populacije MSC v kostnem mozgu, ki je histogenetsko neodvisna od hematopoetskih celic.

Poleg tega je metoda selektivnega kloniranja omogočila identifikacijo nove kategorije stromalnih progenitorskih celic v monoslojnih kulturah celic kostnega mozga, določitev njihovega števila ter preučevanje njihovih lastnosti, proliferativnih in diferenciacijskih potencialov. Izkazalo se je, da se stromalne fibroblastu podobne celice razmnožujejo in vitro in tvorijo diploidne kolonije, ki po presaditvi nazaj v telo omogočajo nastanek novih hematopoetskih organov. Rezultati študije posameznih klonov kažejo, da med stromalnimi progenitorskimi celicami obstaja populacija celic, ki lahko s svojim proliferativnim in diferenciacijskim potencialom prevzamejo vlogo matičnih celic stromalnega tkiva, histogenetsko neodvisnih od hematopoetskih matičnih celic. Celice te populacije so značilne po samovzdržni rasti in se diferencirajo v progenitorske celične elemente kosti, hrustanca in retikularnega tkiva kostnega mozga.

Zelo zanimivi so rezultati študij R. Chailakhyana in soavtorjev (1997–2001), ki so gojili stromalne progenitorske celice kostnega mozga kuncev, morskih prašičkov in miši na hranilnem mediju a-MEM z dodatkom fetalnega telečjega seruma. Avtorji so izvedli eksplantacijo z začetno gostoto 2–4 x 103 celic kostnega mozga na 1 cm2. Kot hranilnik so uporabili homologne ali heterologne celice kostnega mozga, inaktivirane z obsevanjem, v odmerku, ki je ohranil učinek hranilnika, vendar je popolnoma blokiral njihovo proliferacijo. Dva tedna stare primarne diskretne kolonije fibroblastov so tripsinizirali, da so dobili monoklonske seve. Dokazi o klonskem izvoru kolonij so bili pridobljeni z uporabo kromosomskega markerja v mešanih kulturah kostnega mozga samcev in samic morskih prašičkov, časovno zamaknjene fotografije živih kultur in v mešanih kulturah singenetskega kostnega mozga miši CBA in CBAT6T6. Presaditev suspenzije sveže izoliranih celic kostnega mozga ali in vitro vzgojenih stromalnih fibroblastov pod ledvično kapsulo je bila izvedena v poroznih nosilcih iz ivalona ali želatine, kot tudi v inaktivirani gobasti kostni matriks zajcev. Za presaditev klonov v kostni ovojnici so bile stegnenice morskih prašičkov očiščene mehkega tkiva in periosteuma, epifize obrezane, kostni mozeg pa temeljito izprani. Kost je bila razrezana na fragmente (3-5 mm), posušena in obsevana z odmerkom 60 Gy. Posamezne kolonije fibroblastov so bile nameščene v kostne ovojnice in intramuskularno vstavljene. Za intraperitonealno presaditev stromalnih fibroblastov, vzgojenih in vitro, so bile uporabljene difuzijske komore tipa A (V=0,015 cm3, v=0,1 mm) in O (V=0,15 cm3, v=2 mm).

Pri proučevanju dinamike rasti klonskih sevov so R. Chailakhyan in sodelavci (2001) ugotovili, da imajo posamezne celice, ki tvorijo kolonije fibroblastov, kot tudi njihovi potomci, ogromen proliferativni potencial. Do 10. pasaže je bilo število fibroblastov v nekaterih sevih 1,2–7,2 x 109 ^celic. Med svojim razvojem so izvedli do 31–34 podvojitev celic. V tem primeru je heterotopna presaditev sevov, pridobljenih iz kostnega mozga, ki so jih tvorili stromalni predhodniki več deset klonov, povzročila prenos mikrookolja kostnega mozga in nastanek novega hematopoetskega organa v območju presaditve. Avtorji so si zastavili vprašanje, ali so posamezni kloni sposobni prenesti mikrookolje kostnega mozga stromalnih celic ali je za to potrebno sodelovanje več različnih klonogenih stromalnih predhodnikov? In če so posamezni kloni sposobni prenesti mikrookolje, ali bo to popolno za vse tri hematopoetske kalčke ali pa različni kloni zagotavljajo nastanek mikrookolja za različne hematopoetske kalčke? Za rešitev teh težav je bila razvita tehnologija za gojenje stromalnih progenitorskih celic na kolagenskem gelu, ki omogoča odstranitev zraslih kolonij fibroblastov s površine za kasnejšo heterotopno presaditev. Posamezne klone stromalnih fibroblastov, vzgojenih iz celic kostnega mozga miši CBA in morskih prašičkov, so izrezali skupaj s fragmentom gelske prevleke in jih heterotopno presadili - pod ledvično kapsulo singenetskih miši ali v trebušno mišico avtolognih morskih prašičkov. Po presaditvi v mišico so kolonije na gelu namestili v kostne ovojnice.

Avtorji so ugotovili, da so 50–90 dni po presaditvi kolonij fibroblastov kostnega mozga v 20 % primerov v območju presaditve opazili razvoj kosti ali kostnega in hematopoetskega tkiva. Pri 5 % prejemnih živali so nastala žarišča kostnega tkiva vsebovala votlino, napolnjeno s kostnim mozgom. Znotraj kostnih valjev so imela taka žarišča zaobljeno obliko in kapsulo, zgrajeno iz kostnega tkiva z osteociti in dobro razvito osteoblastno plastjo. Votlina kostnega mozga je vsebovala retikularno tkivo z mieloidnimi in eritroidnimi celicami, katerih sorazmerno razmerje se ni razlikovalo od tistega v normalnem kostnem mozgu. V ledvici je bil presadek tipičen organ kostnega mozga, ki je nastal med presaditvijo naravnega kostnega mozga, pri čemer je kostna kapsula pokrivala votlino kostnega mozga le s strani ledvične kapsule. Hematopoetsko tkivo je vključevalo mieloidne, eritroidne in megakariocitne elemente. Stroma votline kostnega mozga je imela dobro razvit sinusni sistem in je vsebovala tipične maščobne celice. Hkrati so v območju presaditve nekaterih kolonij pod ledvično kapsulo našli kostno tkivo brez znakov hematopoeze. Študija proliferativnih in diferenciacijskih potencialov posameznih klonov se je nadaljevala na monoklonskih sevih kostnega mozga kuncev, katerih celice so bile resuspendirane v hranilnem mediju in v ločeni ivalonski gobici z maso 1-2 mg presajene pod ledvično kapsulo darovalca kostnega mozga kuncev. Celice 21 monoklonskih sevov so bile podvržene takšni avtotransplantaciji. Rezultati so bili upoštevani po 2-3 mesecih. Avtorji so ugotovili, da so v 14 % primerov presajeni monoklonski sevi tvorili organ kostnega mozga, sestavljen iz kostnega tkiva in votline kostnega mozga, napolnjene s hematopoetskimi celicami. V 33 % primerov so presajeni sevi tvorili kompaktno kost različnih velikosti z osteociti, vzidanimi v votline, in razvito osteoblastno plastjo. V nekaterih primerih se je v gobah s presajenimi kloni razvilo retikularno tkivo brez kosti ali hematopoetskih elementov. Včasih se je oblikovala retikularna stroma z dobro razvito mrežo sinusoidov, ki pa ni bila naseljena s hematopoetskimi celicami. Tako so bili dobljeni rezultati podobni podatkom, pridobljenim med presaditvijo klonov na kolagenski gel. Če pa je presaditev klonov, vzgojenih na substratu, povzročila nastanek tkiva kostnega mozga v 5 % primerov, kostnega tkiva v 15 % in retikularnega tkiva v 80 % primerov, potem je bila pri presaditvi monoklonskih sevov tvorba elementov kostnega mozga opažena v 14 % primerov, kostnega tkiva v 53 % in retikularnega tkiva v 53 % primerov. Po mnenju avtorjev to kaže, da so bili pogoji za uresničitev proliferativnega in diferenciacijskega potenciala stromalnih fibroblastov med presaditvijo na porozne nosilce bolj optimalni kot med njihovo presaditvijo v kostne ovojnice in na kolagenski substrat.Možno je, da lahko uporaba naprednejših metod gojenja in reverzne presaditve klonov izboljša pogoje za uresničitev njihovega diferenciacijskega potenciala s strani klonov in spremeni ta razmerja. Tako ali drugače, vendar je glavni pomen izvedenih študij ta, da so nekateri kloni stromalnih celic sposobni tvoriti kostno tkivo in hkrati zagotavljati stromalno hematopoetsko mikrookolje za tri kalčke hematopoeze kostnega mozga hkrati: eritroidno, mieloidno in megakariocitno, kar ustvarja precej velike platforme hematopoetskega tkiva in nekaj kostne mase.

Avtorji so se nato lotili vprašanja sposobnosti posameznih klonogenih stromalnih progenitorskih celic, da se v zaprtem sistemu difuzijskih komor podvržejo tem vrstam celične diferenciacije. Poleg tega je bilo treba ugotoviti, ali imajo posamezni kloni polipotentnost ali pa manifestacija diferenciacijskega potenciala zahteva kooperativno interakcijo več klonov s fiksno lastnostjo citodiferenciacije, katere različna razmerja določajo prednostno tvorbo kostnega, retikularnega ali hrustančnega tkiva. Z združitvijo dveh metodoloških pristopov - pridobivanjem monoklonskih sevov stromalnih progenitorskih celic kostnega mozga in njihovo presaditvijo v difuzijske komore - so R. Chailakhyan in soavtorji (2001) dobili rezultate, ki so jim omogočili bližje razumevanju strukturne organizacije strome kostnega mozga. Presaditev monoklonskih sevov stromalnih progenitorskih celic v komore tipa O je povzročila nastanek tako kostnega kot hrustančnega tkiva, kar kaže na sposobnost potomcev ene same celice, ki tvori stromalno kolonijo, da hkrati tvorijo kostno in hrustančno tkivo. Predpostavka, da kostno in hrustančno tkivo izvira iz skupne stromalne progenitorske celice, je bila večkrat podana. Vendar ta hipoteza ni imela pravilne eksperimentalne potrditve. Nastanek kosti in hrustanca v difuzijskih komorah je bil nujen dokaz za obstoj skupne progenitorske celice za ti dve vrsti tkiva med stromalnimi matičnimi celicami kostnega mozga.

Nato je bilo 29 klonskih sevov drugega do tretjega pasaža, pridobljenih iz primarnih kultur kunčjega kostnega mozga, nameščenih v difuzijske komore in intraperitonealno vsadljenih v homologne živali. Študije so pokazale, da ima 45 % monoklonskih sevov kostnega mozga osteogeni potencial. Devet komor je vsebovalo izključno retikularno tkivo, vendar je bilo prisotno skupaj s kostnim in hrustančnim tkivom v dodatnih 13 komorah, kar je predstavljalo 76 % vseh sevov. V komorah tipa O, kjer je bila možna diferenciacija tako kostnega kot hrustančnega tkiva, je bilo preučenih 16 sevov. V štirih komorah (25 %) sta nastala tako kostno kot hrustančno tkivo. Še enkrat je treba opozoriti, da so v študijah R. Chailakhyana in sodelavcev (2001) posamezne progenitorske celice znotraj celičnega seva doživele 31 do 34 podvojitev, njihovi potomci pa so obsegali 0,9–2,0 x ¹⁰⁹ celic. Število mitoz, ki so jih doživele progenitorske celice poliklonskih sevov, je bilo praktično enako številu monoklonskih sevov. Hitrost razvoja poliklonskih sevov, zlasti v prvi fazi njihovega nastanka, je bila v veliki meri odvisna od števila kolonij, uporabljenih za začetek sevov. Diploidni sevi človeških embrionalnih fibroblastov (WI-38) so pri rekloniranju na 12.–15. stopnji podvojitve prav tako tvorili kolonije, ki so se razlikovale po premeru in vsebnosti celic. Velike kolonije, ki so vsebovale več kot 103 celic, so predstavljale le 5–10 %. Z naraščanjem števila delitev se je odstotek velikih kolonij zmanjšal. Mono- in poliklonski sevi stromalnih fibroblastov kostnega mozga so po 20 ali več podvojitvah ohranili diploidni nabor kromosomov, tendenca njihovega razvoja pa je bila primerljiva z dinamiko razvoja diploidnih sevov embrionalnih fibroblastov. Analiza diferenciacijskega potenciala posameznih stromalnih progenitorskih celic kostnega mozga, izvedena s presaditvijo monoklonskih sevov v difuzijske komore, je pokazala, da je bila polovica teh osteogenih. Velike kolonije so predstavljale 10 % njihovega skupnega števila. Posledično je število osteogenih celic, ki tvorijo kolonije, ustrezalo približno 5 % njihove celotne populacije. Skupna masa osteogenih progenitorskih celic, ki so jih identificirali avtorji, je vključevala celice, ki so sposobne hkrati tvoriti kostno in hrustančno tkivo. Poleg tega je bilo prvič ugotovljeno, da imata ti dve vrsti tkiva v odraslem organizmu skupno progenitorsko celico: 25 % testiranih klonov je nastalo s takimi celicami, njihovo število med celotno populacijo progenitorskih celic pa je bilo vsaj 2,5 %.

Heterotopska presaditev posameznih klonov fibroblastov kostnega mozga je tako razkrila nove vidike strukturne organizacije populacije mezenhimskih progenitorskih celic. Ugotovljene so bile stromalne progenitorske celice, ki so sposobne prenesti specifično mikrookolje za vse hematopoetske kalčke hkrati, katerih število med velikimi kloni, preučevanimi v različnih modelih, se giblje od 5 do 15 % (0,5–1,5 % celotnega števila zaznanih progenitorskih celic). Poleg klonov, ki prenašajo celotno mikrookolje kostnega mozga, obstajajo tudi progenitorske celice, ki so namenjene le osteogenezi, vendar ob prenosu v odprt sistem tvorijo kostno tkivo, ki ne podpira razvoja hematopoeze. Njihovo število od celotnega števila progenitorskih celic je 1,5–3 %. Nekatere od teh celic so sposobne tvoriti kostno tkivo z omejenim obdobjem samovzdrževanja. Posledično je populacija stromalnih progenitorskih celic heterogena v svojem potencialu diferenciacije. Med njimi obstaja kategorija celic, ki trdijo, da so stromalne matične celice, sposobne diferenciacije v vse tri smeri, značilne za stromalno tkivo kostnega mozga, pri čemer tvorijo kostno, hrustančno in retikularno tkivo. Predstavljeni podatki nam dajejo upanje, da bo z uporabo različnih celičnih markerjev mogoče določiti prispevek vsake vrste stromalnih celic k organizaciji specifičnega mikrookolja in podpori hematopoeze v Dexterjevih kulturah.

Značilnosti mezenhimskih matičnih celic

V zadnjih letih je bilo ugotovljeno, da so v stacionarnih kulturah kostnega mozga multipotentne mezenhimske progenitorske celice predstavljene z omejeno populacijo majhnih agranularnih celic (celice RS-1), za katere je značilna nizka sposobnost tvorbe kolonij in odsotnost izražanja antigena Ki-67, specifičnega za proliferirajoče celice. Antigenski parametri mirujočih celic RS-1 se razlikujejo od spektra antigenov hitro proliferirajočih zavezanih stromalnih progenitorskih celic. Ugotovljeno je bilo, da se visoka stopnja proliferacije zavezanih progenitorskih celic opazi le v prisotnosti celic RS-1. Celice RS-1 pa povečajo svojo stopnjo rasti pod vplivom dejavnikov, ki jih izločajo najbolj zreli derivati multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic. Zdi se, da so celice RS-1 podrazred nezavezanih MSC, ki so sposobne recikliranja. In vitro so za stromalne progenitorske celice kostnega mozga, odporne na 5-fluorouracil, značilne nizka vsebnost RNA in visoka ekspresija gena ornitin dekarboksilaze, označevalca neproliferirajočih celic.

Intenzivna proliferacija stromalnih progenitorskih celic se začne po njihovi fiksaciji na substratu. V tem primeru se izrazi profil markerjev slabo diferenciranih celic: SH2 (receptor TGF-(3)), SH3 (domena signalnega proteina), kolagen tipa I in III, fibronektin, adhezijski receptorji VCAM-1 (CD106) in ICAM (CD54), kadherin-11, CD44, CD71 (receptor za transferin), CD90, CD120a in CD124, vendar brez izražanja značilnih markerjev hematopoetskih matičnih celic (CD34, CD14, CD45). Klonska rast omogoča večkratno pasiranje mezenhimskih matičnih celic z nastankom številnih genetsko homogenih pluripotentnih stromalnih progenitorskih celic v kulturi. Po 2-3 pasažah njihovo število doseže 50-300 milijonov. V kulturi zadostne gostote se stromalne progenitorske celice, za razliko od fibroblastov hematopoetskega tkiva, po prenehanju proliferacije diferencirajo v adipocite, miocite, hrustančne in kostne celice. Kombinacija treh regulatornih diferenciacijskih signalov, vključno z 1-metilizobutilksantinom (induktorjem znotrajcelične tvorbe cAMP), deksametazonom (zaviralec fosfolipaz A in C) in indometacinom (zaviralec ciklooksigenaze, ki prav tako zmanjšuje aktivnost tromboksan sintaze), pretvori do 95 % progenitorskih mezenhimskih celic v adipocite. Nastanek adipocitov iz nezrelih stromalnih elementov potrjujejo izražanje gena lipoproteinske lipaze, histokemična detekcija apolipoproteinov in peroksisomskih receptorjev. Celice istega klona pod vplivom TGF-β v mediju brez seruma ustvarijo homogeno populacijo hondrocitov. Večplastno celično kulturo tega hrustančnega tkiva zaznamuje razvit medcelični matriks, ki ga sestavljajo proteoglikani in kolagen tipa II. V hranilnem mediju z 10 % Učinek kompleksa diferenciacijskega signala, ki ga sestavljajo b-glicerofosfat (anorganski donor fosfata), askorbinska kislina in deksametazon v isti kulturi stromalnih progenitorskih celic, vodi do nastanka celičnih agregatov. V takih celicah opazimo postopno povečanje aktivnosti alkalne fosfataze in ravni osteopontina, kar kaže na nastanek kostnega tkiva, katerega mineralizacijo celic potrjuje postopno povečanje vsebnosti kalcija v celicah.

Po nekaterih podatkih je sposobnost mezenhimskih matičnih celic za neomejeno delitev in razmnoževanje različnih vrst celic mezenhimske diferenciacijske linije združena z visoko stopnjo plastičnosti. Ko so vnesene v ventrikle ali belo snov možganov, mezenhimske matične celice migrirajo v parenhim živčnega tkiva in se diferencirajo v derivate glialne ali nevronske celične linije. Poleg tega obstajajo informacije o transdiferenciaciji MSC v hematopoetske matične celice tako in vitro kot in vivo. Poglobljena analiza v nekaterih študijah je ugotovila izjemno visoko plastičnost MSC, ki se kaže v njihovi sposobnosti diferenciacije v astrocite, oligodendrocite, nevrone, kardiomiocite, gladkomišične celice in skeletne mišične celice. Številne študije o transdiferenciacijskem potencialu MSC in vitro in in vivo so pokazale, da se multipotentne mezenhimske progenitorske celice kostnega mozga terminalno diferencirajo v celične linije, ki tvorijo kostno, hrustančno, mišično, živčno in maščobno tkivo ter kite in stromo, ki podpirajo hematopoezo.

Vendar pa druge študije niso pokazale nobenih znakov omejitve pluripotence genoma mezenhimskih matičnih celic in progenitorskih populacij stromalnih celic, čeprav je bilo za testiranje morebitne pluripotence stromalnih celic preučenih več kot 200 klonov MSC, izoliranih iz ene primarne kulture. Velika večina klonov in vitro je ohranila sposobnost diferenciacije v osteogeni, hondrogeni in adipogeni smeri. Če izključimo verjetnost migracije prejemniških celic s presaditvijo mezenhimskih matičnih celic pod ledvično kapsulo ali v difuzijske komore, se je izkazalo, da stromalne progenitorske celice in situ ohranijo heterogeni fenotip, kar kaže bodisi na odsotnost restrikcijskih faktorjev v območju presaditve bodisi na odsotnost pluripotence MSC kot take. Hkrati je dovoljen obstoj redke vrste somatskih pluripotentnih matičnih celic, ki so skupni predhodniki vseh odraslih matičnih celic.

Multi-, ne pa pluripotentnost pravih mezenhimskih matičnih celic, ki predstavljajo zelo majhen delež celic kostnega mozga in so sposobne proliferacije pod določenimi pogoji med gojenjem in vitro brez diferenciacije, se kaže v njihovi inducirani vezavi na kostne, hrustančne, maščobne in mišične tkivne celice, pa tudi na tenocite in stromalne elemente, ki podpirajo hematopoezo. Praviloma dolgotrajna izpostavljenost gojišču s fetalnim telečjim serumom izzove sproščanje MSC v vezane stromalne progenitorske celice, katerih potomci se spontano terminalno diferencirajo. In vitro je mogoče doseči ciljno tvorbo osteoblastov z dodajanjem deksametazona, ß-glicerofosfata in askorbinske kisline v gojišče, medtem ko kombinacija signalov deksametazona in inzulinske diferenciacije sproži tvorbo adipocitov.

Ugotovljeno je bilo, da se pred vstopom v fazo terminalne diferenciacije MSC kostnega mozga pod določenimi pogoji gojenja sprva diferencirajo v fibroblastu podobne mezenhimske matične celice. Derivati teh celic in vivo sodelujejo pri tvorbi kosti, hrustanca, kit, maščobnega in mišičnega tkiva ter strome, ki podpira hematopoezo. Mnogi avtorji razumejo izraz "multipotentne mezenhimske progenitorske celice" tako kot same MSC kot tudi zavezane stromalne progenitorske celice kostnega mozga in mezenhimskih tkiv. Klonska analiza multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic kostnega mozga je pokazala, da se nekaj več kot tretjina vseh klonov diferencira v osteo-, hondro- in adipocite, medtem ko imajo celice preostalih klonov le osteogeni potencial in tvorijo le hondro- in osteocite. Klon multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic, kot je BMC-9, se v ustreznih mikrookolju pogojenih pogojih diferencira v celice s fenotipom in funkcionalnimi značilnostmi ne le osteoblastov, hondrocitov in adipocitov, temveč tudi stromalnih celic, ki podpirajo hematopoezo. Klon celic RCJ3.1, izoliranih iz kostnega mozga podganjih plodov, se diferencira v mezenhimske celice različnih fenotipov. Pod skupnim delovanjem askorbinske kisline, b-glicerofosfata in deksametazona celični elementi tega klona najprej tvorijo večjedrne miocite, nato pa zaporedno adipocite, hondrocite in otočke mineraliziranega kostnega tkiva. Populacija granularnih celic iz periosteuma podganjih plodov ustreza nevezanim multipotentnim mezenhimskim progenitorskim celicam, saj je značilna nizka stopnja proliferacije, ne izraža markerjev diferenciacije in se v gojitvenih pogojih diferencira v hondro-, osteo- in adipocite ter gladkomišične celice.

Zato je treba priznati, da ostaja vprašanje pluri- ali multipotentnosti genoma mezenhimskih matičnih celic odprto, kar posledično vpliva tudi na predstave o diferenciacijskem potencialu stromalnih progenitorskih celic, ki prav tako ni dokončno ugotovljen.

Eksperimentalno dokazana in pomembna značilnost mezenhimskih matičnih celic je njihova sposobnost, da zapustijo tkivno nišo in krožijo v splošnem krvnem obtoku. Za aktivacijo programa genetske diferenciacije morajo takšne krožeče matične celice vstopiti v ustrezno mikrookolje. Dokazano je, da se s sistematičnim vnosom MSC v krvni obtok prejemnih živali nezrele celice vsadijo v različne organe in tkiva, kjer se nato diferencirajo v krvne celice, miocite, adipocite, hondrocite in fibroblaste. Posledično v lokalnih tkivnih conah pride do signalno-regulatornih interakcij med nevezanimi in vezanimi stromalnimi progenitornimi celicami ter med njimi in okoliškimi zrelimi celicami. Domneva se, da diferenciacijo povzročajo parakrini regulatorni dejavniki mezenhimskega in nemezenhimskega izvora (rastni faktorji, eikozanoidi, molekule zunajceličnega matriksa), ki zagotavljajo prostorske in časovne povezave v mikrookolju multipotentnih mezenhimskih progenitornih celic. Zato bi morala lokalna poškodba mezenhimskega tkiva voditi do nastanka con mikrookolja multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic, ki se kvalitativno razlikujejo od kompleksa regulatornih signalov intaktnih tkiv, v katerih potekajo fiziološki in ne reparativni regeneracijski procesi. Ta razlika je izjemno pomembna z vidika specializacije celičnega fenotipa v normalnem in s poškodbo povzročenem mikrookolju.

V skladu s koncepti so prav tukaj vgrajeni mehanizmi temeljne razlike med obema znanima procesoma - fiziološko regeneracijo in vnetno proliferacijo. Prvi se konča z obnovo specializirane celične sestave tkiva in njegove funkcije, medtem ko je rezultat izvajanja proliferacijskega procesa nastanek zrelih elementov vezivnega tkiva in izguba funkcije poškodovanega tkivnega območja. Za razvoj optimalnih programov za uporabo multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic v regenerativno-plastični medicini je torej potrebna temeljita študija značilnosti vpliva mikrookoljskih dejavnikov na diferenciacijo MSC.

Odvisnost strukture predelka matičnih celic od celičnih para- in avtokrinih regulatorjev, katerih izražanje modulirajo zunanji signali, je nedvomna. Med funkcijami regulatornih dejavnikov sta najpomembnejša nadzor asimetrične delitve MSC in izražanje genov, ki določajo stopnje zavezanosti in število celičnih delitev. Zunanje signale, od katerih je odvisen nadaljnji razvoj MSC, zagotavlja njihovo mikrookolje. V nezrelem stanju se MSC dolgo razmnožujejo, hkrati pa ohranjajo sposobnost diferenciacije v linije adipocitov, miofibroblastov, strome hematogenega tkiva, hrustančnih in kostnih celic. Ugotovljeno je bilo, da se omejena populacija CD34-negativnih stromalnih celičnih elementov, ki kroži v krvi, vrača iz splošnega krvnega obtoka v stromo kostnega mozga, kjer se transformira v linije CD34-pozitivnih hematopoetskih matičnih celic. Ta opažanja kažejo, da recirkulacija progenitorskih mezenhimskih celic v krvnem obtoku ohranja tkivno ravnovesje stromalnih matičnih celic v različnih organih z mobilizacijo skupnega bazena nezrelih stromalnih elementov kostnega mozga. Diferenciacija MSC v celice z več mezenhimskimi fenotipi in njihova vloga pri regeneraciji ali popravilu kosti, hrustanca, maščobnega tkiva in kit in vivo je bila dokazana z uporabo modelov adoptivnega prenosa pri poskusnih živalih. Po mnenju drugih avtorjev je oddaljena migracija MSC vzdolž žilnega dna kombinirana s kratkim ali lokalnim premikanjem multipotentnih mezenhimskih progenitornih celic znotraj tkiva med popravilom hrustanca, regeneracijo mišic in drugimi obnovitvenimi procesi.

Lokalne matične rezerve baze stromalnega tkiva delujejo kot vir celic v procesih fiziološke regeneracije tkiva in se dopolnjujejo z oddaljenim transportom MSC, ko se porabljajo viri stromalnega tkiva. Vendar pa v primerih potrebe po nujni mobilizaciji reparativnega celičnega potenciala, na primer v primeru politravme, celoten ešalon MSC sodeluje v procesih reparativne regeneracije, mezenhimske progenitorske celice kostnega mozga pa se s splošnim pretokom krvi rekrutirajo na periferijo.

Presaditev mezenhimskih matičnih celic

Med procesi fiziološke regeneracije tkiv in njihovim nastajanjem med intrauterinim razvojem je mogoče zaslediti določene vzporednice. V embriogenezi pri ljudeh in sesalcih nastajajo različne vrste specializiranih celic iz ekto-, mezo- in endodermalnega bazena zarodnih plasti, vendar z obveznim sodelovanjem mezenhima. Ohlapna celična mreža embrionalnega mezenhimskega tkiva opravlja številne regulatorne, presnovne, ogrodne in morfogenetske funkcije. Polaganje začasnih organov se zgodi šele po kondenzaciji mezenhima zaradi klonogene rasti progenitornih celic, ki ustvarjajo primarne morfogenetske signale organogeneze. Stromalni derivati embrionalnega mezenhima ustvarjajo celični okvir začasnih organov in tvorijo osnovo za njihovo prihodnjo energijsko-plastično oskrbo zaradi rasti primarnih krvnih in limfnih žil. Z drugimi besedami, stromalni elementi mikrocirkulacijske enote fetalnih organov nastanejo pred nastankom njihovih strukturnih in funkcionalnih enot. Poleg tega aktivna migracija mezenhimskih celic med organogenezo zagotavlja prostorsko orientacijo razvijajočih se organov z označevanjem njihovih volumskih meja z omejevanjem homeotičnih Hox-tipov. Stromalni okvir služi tudi kot osnova za sestavljanje strukturnih in funkcionalnih enot parenhimskih organov, ki pogosto vključujejo morfogenetsko in funkcionalno popolnoma različne celice. Posledično so med embriogenezo funkcije mezenhima primarne in se uresničujejo z ustvarjanjem regulatornih signalov, ki aktivirajo regionalno proliferacijo in diferenciacijo progenitorskih epitelijskih celic. Embrionalne mezenhimske celice proizvajajo rastne faktorje, kot so HGF-β, HGF-β, CSF, za katere imajo parenhimske progenitorske celice ustrezne receptorje. V diferenciranem zrelem tkivu odraslega organizma stromalna mreža celic ustvarja tudi signale za ohranjanje viabilnosti in proliferacije progenitorskih celic nemezenhimskega izvora. Vendar pa je spekter stromalnih regulatornih signalov v postnatalni ontogenezi drugačen (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF itd.) in je namenjen zagotavljanju fiziološke regeneracije ali popravila poškodovanih tkivnih con. Poleg tega so spektralne značilnosti stromalnih regulatornih faktorjev v vsaki vrsti tkiva in celo znotraj enega organa različne. Zlasti hematopoeza in limfopoeza s proliferacijo in diferenciacijo hematopoetskih in imunokompetentnih celic se pojavljata le v določenih organih, znotraj katerih deluje stromalno mikrookolje, ki zagotavlja pogoje za zorenje hematopoetskih in limfoidnih celic. Sposobnost hematopoetskih in limfoidnih celic, da ponovno naselijo določen organ, se razmnožijo in dozorijo v njegovih mikrostrukturnih nišah, je odvisna od regulatornih faktorjev mikrookolja.

Med komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih proizvajajo multipotentne mezenhimske progenitorske celice, je treba omeniti fibronektin, laminin, kolagen in proteoglikane ter CD44 (receptor za hialuronanski in osteopontinski receptor), ki imajo pomembno vlogo pri organizaciji medceličnih interakcij in tvorbi zunajceličnega matriksa v kostnem mozgu in kostnem tkivu. Dokazano je, da multipotentne mezenhimske progenitorske celice kostnega mozga ustvarjajo stromalno mikrookolje, ki zagotavlja induktivne in regulatorne signale ne le MSC, temveč tudi hematopoetskim progenitorjem in drugim nemezenhimskim matičnim celicam kostnega mozga. Znano je, da je sodelovanje MSC pri hematopoezi določeno z njihovo sposobnostjo diferenciacije v stromalne celice, ki podpirajo hematopoezo, in ta poučni signal MSC prejemajo neposredno iz hematopoetskih matičnih celic. Zato mreža stromalnih progenitorskih celic v kulturi služi kot hranilna baza za razvoj vseh klonov hematopoetskih celic.

V zrelem organizmu je intenzivnost hemo- in limfopoeze v stanju dinamičnega ravnovesja z "porabo" zrelih krvnih celic in celic imunskega sistema na periferiji. Ker se stromalne celice kostnega mozga in limfoidnih organov obnavljajo izjemno redko, do pomembnega prestrukturiranja stromalnih struktur v njih ne pride. Sistem lahko iz dinamičnega ravnovesja izvleče mehanska poškodba katerega koli od organov hemo- ali limfopoeze, kar vodi do enakomernih zaporednih sprememb, ki ne zadevajo le in ne toliko hematopoetskih ali limfoidnih elementov kot stromalnih struktur poškodovanega organa. V procesu reparativne regeneracije se najprej oblikuje stromalna baza, ki jo nato ponovno naseljujejo hematopoetske ali imunokompetentne celice. To že dolgo znano dejstvo naredi posttravmatsko regeneracijo priročen model za preučevanje stromalnega mikrookolja hematopoetskih organov. Zlasti mehansko praznjenje medularne votline cevastih kosti se uporablja za preučevanje reparativne regeneracije kostnega mozga - kiretaže, ki omogoča hitro in učinkovito odstranitev hematopoetskega tkiva iz stanja dinamičnega ravnovesja. Pri preučevanju procesov reparativne regeneracije hematopoetskih in stromalnih komponent kostnega mozga po mehanskem praznjenju medularne votline golenice morskih prašičkov je bilo ugotovljeno, da ni neposredne povezave med indeksi regeneracije hematopoetskih in stromalnih celic (število hematopoetskih celic, koncentracija in število stromalnih progenitorskih celic). Poleg tega se je izkazalo, da se povečanje populacije stromalnih progenitorskih celic pojavi prej po kiretaži, sami stromalni fibroblasti pa postanejo fosfatazno pozitivni, kar je značilno za osteogeno tkivo. Ugotovljeno je bilo tudi, da kiretaža 3-5 cevastih kosti vodi do rasti te celične populacije v kostnem mozgu neoperiranih kosti in celo v vranici, ki je pri morskih prašičkih izključno limfopoetski organ.

Morfološka slika reparativnih procesov v kostnem mozgu kiretiranih golenic morskih prašičkov se na splošno ujema s podatki, opisanimi v literaturi, pridobljenimi v poskusih na živalih drugih vrst, dinamika sprememb, ki se pojavijo po odstranitvi hematopoetskega tkiva, pa je enaka za vse živalske vrste in razlika se nanaša le na časovne parametre. Morfološko fazni vrstni red obnove hematopoeze v izpraznjeni medularni votlini sestavljajo zaporedni procesi organizacije krvnega strdka, nastanka grobega vlaknatega kostnega tkiva, njegove resorpcije, razvoja sinusoidov in nastanka retikularne strome, ki jo nato ponovno naseljujejo hematopoetski elementi. V tem primeru se število progenitorskih hematopoetskih celic v procesu regeneracije tkiva kostnega mozga povečuje vzporedno s povečanjem vsebnosti hematopoetskih matičnih celic.

Yu. Gerasimov in soavtorji (2001) so primerjali spremembe v številu hematopoetskih celic in številu stromalnih progenitorskih celic v posameznih fazah regeneracijskega procesa. Izkazalo se je, da kvantitativne spremembe celic kostnega mozga v kiretirani kosti ustrezajo dinamiki morfoloških značilnosti regeneracije. Avtorji zmanjšanje celične vsebnosti v regeneratu v prvih treh dneh povezujejo s smrtjo hematopoetskih celic zaradi neugodnega vpliva mikrookolja, ki ga ustvarja proliferirajoče retikularno tkivo v ohranjenem kostnem mozgu v epifizni regiji, pa tudi z nastankom žarišč osteoidnega tkiva v slednjem in poškodbami žil med kiretažo. 7. do 12. dan povečanje ravni jedrnih celic sovpada s pojavom posameznih žarišč mieloidne hematopoeze v conah proliferacije stromalnih elementov. 20. dan se pojavijo pomembna območja regeneriranega kostnega mozga in dobro razviti sinusi, kar spremlja znatno povečanje skupnega števila celic. Vendar pa je število hematopoetskih elementov v tem obdobju 68 % kontrolne ravni. To je skladno s prej objavljenimi podatki, da število hematopoetskih celic po kiretaži doseže normo šele 35. do 40. dan po operaciji.

V zgodnjem posttravmatskem obdobju je glavni vir za obnovo hematopoeze lokalni celični elementi, ohranjeni med kiretažo. V kasnejših fazah je glavni vir regeneracije hematopoetskega tkiva kostnega mozga matične celice, ki ponovno naseljujejo proste stromalne cone. Kar zadeva posamezne kategorije stromalnih celic (endotelijske, retikularne in osteogene), viri, ki zagotavljajo njihovo tvorbo med reorganizacijo votline kostnega mozga, ostajajo nejasni. Rezultati študije Yu. V. Gerasimova in soavtorjev (2001) kažejo, da je v kostnem mozgu, ohranjenem po kiretaži, koncentracija celic, ki tvorijo kolonije fibroblastov, bistveno višja kot v normalnem kostnem mozgu. Avtorji menijo, da kiretaža povzroči intenzivnejše selektivno izpiranje hematopoetskih celic v primerjavi s stromalnimi celicami, ki tvorijo kolonije, sodelujejo pri tvorbi strome in so močneje povezane z njeno glavno snovjo kot hematopoetske celice.

Dinamika spremembe števila celic, ki tvorijo fibroblastne kolonije, je povezana z intenzivnostjo procesov osteogeneze, posledično resorpcijo kostnih trabekul in nastankom retikularne strome, ki jo naseljujejo hematopoetske celice. Večina stromalnih progenitorskih celic v določenih obdobjih regeneracije tvori grobo vlaknato kostno tkivo in retikularno stromo. Pri zlomih stegnenice v pogojih podaljšane osteosinteze se 5. dan v regeneracijskem območju poveča koncentracija in število celic, ki tvorijo fibroblastne kolonije, v obdobju intenzivne tvorbe kosti pa se njihovo število poveča za 6-krat. Znano je, da imajo celice kostnega mozga, ki tvorijo fibroblastne kolonije, osteogene lastnosti. Število stromalnih progenitorskih celic se poveča, preden se kiretirano območje kostnega mozga naseli s hematopoetskimi celicami. To se dobro ujema s podatkom, da stromalne celice zagotavljajo nastanek hematopoetskega mikrookolja. Očitno nastanek hematopoetskega mikrookolja ustreza določeni stopnji regeneracije stromalnega tkiva, število hematopoetskih celic pa se povečuje s širitvijo stromalne platforme, primerne za hematopoezo.

Najbolj zanimivi so avtorjevi podatki, da se takoj po kiretaži poveča število stromalnih progenitorskih celic v oddaljenih delih okostja. Od šeste ure do vključno dvajsetega dne opazimo več kot dvakratno povečanje tako koncentracije kot števila celic, ki tvorijo kolonije fibroblastov v kontralateralni golenici. Mehanizem tega pojava je verjetno povezan z dejstvom, da obsežna poškodba kostnega mozga povzroči nastanek velikega števila krvnih strdkov s hkratnim uničenjem znatnega števila trombocitov in sproščanjem rastnega faktorja, pridobljenega iz trombocitov (PDGF), v kri, za katerega je znano, da povzroča proliferacijo celic, ki tvorijo kolonije fibroblastov, ki se nahajajo v telesu zunaj proliferativnega bazena. V poskusih na kuncih lokalno dajanje MSC spodbuja obnovo hrustančnega tkiva kirurško poškodovanega kolenskega sklepa, kar je lahko povezano z nastankom hondrocitov, ki izvirajo iz injiciranih MSC. Vendar pa se reparativna regeneracija kostnih defektov pri laboratorijskih podganah znatno izboljša z uporabo mezenhimskih matičnih celic, zaprtih v keramičnem ogrodju. Zato lahko domnevamo, da če ne RBOC, potem kakšen drug dejavnik, ki izvira iz poškodovanih stromalnih celic, izvaja oddaljen stimulativni učinek na proliferacijo mezenhimskih progenitorskih celic v intaktnih conah kostnega mozga in spodbuja njihovo migracijo na območje okvare kostnega mozga. To pa je v nasprotju s podatki iz literature iz prejšnjih let, ki kažejo, da stromalne celice, odgovorne za mikrookolje, za razliko od hematopoetskih celic niso sposobne migracije in izvirajo iz lokalnih virov.

Kljub temu rezultati študije Yu. Gerasimova in soavtorjev (2001) kažejo, da mehanska travma povzroči ne le ostro prestrukturiranje stromalnega tkiva v kiretirani kosti, temveč tudi pomembne spremembe strome v oddaljenih nepoškodovanih kosteh, tj. pride do sistemskega odziva stromalnega tkiva na lokalno travmo. Poleg tega se pri politravmi - večkratni kiretaži - ta reakcija okrepi in jo opazimo ne le v operirani kosti in oddaljenih delih okostja, temveč tudi v limfoidnih organih, zlasti v vranici. Mehanizem takšnega sistemskega odziva stromalnega tkiva kostnega mozga in vranice na lokalno travmo in politravmo ostaja neznan. Domneva se, da je ta proces povezan z delovanjem humoralnega faktorja, ki ga izloča mezenhimska stroma medularne votline kostnega mozga. Možnost nastajanja organsko nespecifičnega humoralnega faktorja, odgovornega za proliferacijo celic, ki tvorijo kolonije fibroblastov, s strani stromalnih celic kostnega mozga in vranice, dokazujejo podatki o njihovi kolonijsko stimulirajoči aktivnosti v monoslojnih kulturah kostnega mozga.

V zvezi s tem je treba omeniti, da se pri sistemskem dajanju multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic njihovi derivati ponovno naselijo ne le v kostnem mozgu, temveč tudi v drugih tkivih, kar se uporablja zlasti za gensko terapijo. Dokazano je, da pri intravenskem dajanju velikih količin MSC z divjim tipom genoma mišim z mutacijo v genu kolagena I donorske celice nadomestijo do 30 % celic v kostnem in hrustančnem tkivu prejemnikov, transficirane mišje mezenhimske matične celice, ki izločajo humani IL-3, pa učinkovito podpirajo hematopoezo 9 mesecev v primeru njihovega sočasnega dajanja s humanimi hematopoetskimi matičnimi celicami imunsko pomanjkljivim mišim.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetska modifikacija mezenhimskih matičnih celic

Med uspehi eksperimentalne genske modifikacije MSC velja omeniti transfekcijo gena faktorja IX v človeške MSC s poznejšim prenosom transfektantnih celic na imunsko pomanjkljive miši, kar je povzročilo pojav antihemofilnega faktorja B v krvi 8 tednov po presaditvi. V tem poskusu je bila v transficiranih celicah izvedena posttranslacijska modifikacija faktorja IX z γ-glutamil karboksilazo. Transdukcija MSC z retrovirusnim vektorjem, ki kodira človeški faktor IX, je bila manj uspešna - poznejše dajanje teh celic psu s hemofilijo B je zagotovilo terapevtsko raven faktorja IX, ki je ohranjala normalno intenzivnost koagulacijske hemostaze, le 12 dni.

Presaditev mezenhimskih matičnih celic v možganski parenhim živali je pokazala, da se nezrele celice darovalcev transformirajo v nevronske in glialne populacije. Vsaditev nevronskih derivatov zdravega mezenhimskega tkiva darovalcev teoretično omogoča odpravo genetskih nepravilnosti v presnovi možganov pri bolnikih z Gaucherjevo boleznijo in drugimi motnjami presnove lipidov, gangliozidov ali ogljikovih hidratov.

Eksperimentalno iskanje pogojev za transdiferenciacijo stromalnih matičnih celic kostnega mozga v progenitorske celice živčnega in jetrnega tkiva še poteka. Pozornost raziskovalcev je osredotočena na kombinacije induktorjev diferenciacije in posebnih pogojenih medijev. Za izolacijo primarne kulture stromalnih celic se celice kostnega mozga, oprane in resuspendirane v gojišču DMEM/F12 (1/1) z 10 % fetalnim telečjim serumom, zasejejo v gostoti 200.000/cm2. Po 24 urah se neadherentne celice odstranijo, fibroblastu podobne celice, pritrjene na plastiko, pa se gojijo en teden. Za diferenciacijo stromalnih celic kostnega mozga v nevroblaste se uporablja pogojeno gojišče, pridobljeno s tridnevno gojenjem primarne kulture mišjih embrionalnih fibroblastov, ter gojišče DMEM/F12 (1/1) z 2 % fetalnega telečjega seruma in dodatkom 20 ng/ml NF ali 10-6 M retinojske kisline (nevroinduktorja, ki se uporabljata za nevronsko diferenciacijo mišjih in človeških embrionalnih matičnih celic). Diferenciacija stromalnih celic kostnega mozga v prekurzorske celice hepatocitov se inducira v pogojenem gojišču, ki nastane kot rezultat tridnevnega gojenja primarne kulture mišjih embrionalnih jetrnih celic v gojišču DMEM/F12 (1/1) z dodatkom 10 % fetalnega telečjega seruma.

Tukaj je treba še enkrat opozoriti, da so celice strome kostnega mozga, ki tvorijo kolonije, heteromorfne in jih lahko razdelimo na dve vrsti. Prva vrsta vključuje celice, podobne fibroblastom, ki tvorijo filopodije z velikimi jedri in enim ali dvema nukleoloma. Druga vrsta je predstavljena z majhnimi vretenastimi celicami. Pri gojenju celic obeh vrst v kondicioniranem gojišču, pridobljenem na hranilni plasti primarnih mišjih embrionalnih fibroblastov, se celice, podobne nevroblastom, v kulturi pojavijo 3. do 4. dan. V tej fazi imajo najpogosteje vretenasto obliko z enim ali dvema dolgima izrastkoma, ki se končata s filopodiji. Manj pogoste so piramidne ali zvezdaste celice s kratkimi dendriti. Dendriti nekaterih nevroblastov imajo v svojem distalnem delu značilne razširitve (rastne popke) in veje, drugi pa imajo izrazite rastne stožce s filopodiji, skozi katere rastejo dendriti. Podobne morfološke značilnosti (popki in rastni stožci s filopodiji), ki so lastne nevroblastom, ki se diferencirajo v nevrone, so bile podrobno opisane v študijah o nevrogenezi. Na podlagi tega nekateri avtorji sklepajo, da so celice, ki so jih našli v kulturi, nevroblasti. Predvsem E. Shchegelskaya in soavtorji (2002) so po dveh tednih gojenja primarne kulture stromalnih celic v pogojenem mediju, ki se je menjal vsakih 3. do 4. dan, ugotovili, da so se nekatere celice razmnoževale, hkrati pa ohranile nediferencirano stanje. Navzven so bile takšne celice podobne fibroblastom in so bile v kulturi odkrite skupaj z diferencirajočimi se nevroblasti. Večina celic (približno 80 %) je bila v različnih fazah diferenciacije v celice živčnega tkiva, predvsem v nevrone. Dendritični odrastki teh celic so bili v tesnem stiku med seboj, tako da so celice postopoma tvorile dele živčnega omrežja na substratu v obliki dolgih večceličnih pramenov. Dendritični odrastki nevroblastov so postali bistveno daljši, nekateri so za 8-10-krat presegli dolžino samega telesa nevrona. Delež piramidalnih in zvezdastih celic se je postopoma povečeval. Dendriti zvezdastih celic so se razvejali. Po mnenju avtorjev kasnejša diferenciacija piramidalnih in zvezdastih celic v primerjavi z vretenastimi celicami ustreza zaporedju stopenj normalne nevrogeneze pri živalih. Avtorji posledično sklepajo, da stromalne matične celice kostnega mozga doživljajo inducirano nevrogenezo, med katero se iz nevroblastov in vitro tvorijo vse tri glavne vrste nevronov. Predhodniki živčnih celic so bili odkriti tudi med 3-4-dnevno gojenjem stromalnih celic kostnega mozga v gojišču z 2 % fetalnim serumom in 20 ng/ml LIF. Toda v tem primeru so se matične celice delile zelo počasi, diferenciacija nevroblastov se je pojavila le v 30 % primerov in niso tvorile nevronskih mrež. Z uporabo retinojske kisline kot enega od induktorjev diferenciacije živčnih celic so avtorji v kulturi pridobili do 25-30 % živčnih celic,s pretežno glialnimi elementi - astrociti in oligodendrociti. Nevroni so predstavljali le tretjino vseh živčnih celic, čeprav so bile zastopane vse tri vrste: vretenaste, piramidne in zvezdaste celice. 6. dan gojenja stromalnih celic v gojišču z retinojsko kislino so živčne celice postale bolj diferencirane, v posameznih piramidalnih nevronih pa so našli aksone, ki se v normalni nevroontogenezi pojavijo pozneje kot nastanek dendritičnih odrastkov. Po mnenju avtorjev ima metoda indukcije z retinojsko kislino kljub nizkemu izkoristku živčnih celic svoje prednosti: oligodendrociti in astrociti opravljajo mielinacijske in prehranske funkcije med rastjo dendritov in aksonov ter so potrebni za normalno tvorbo živčnega tkiva. Zato je za popravilo poškodovanih območij in vivo bolje uporabiti suspenzijo nevronov, obogateno z glialnimi celicami.

V drugi seriji poskusov so avtorji poskušali inducirati diferenciacijo stromalnih celic kostnega mozga v jetrne celice. Po treh dneh gojenja stromalnih matičnih celic kostnega mozga v pogojenem mediju, pridobljenem z inkubacijo mišjih embrionalnih hepatocitov, so bile najdene velike, sferične celice, pogosto binuklearne, s citoplazemskimi vključki različnih velikosti. Te celice so bile v različnih fazah diferenciacije in so se razlikovale po velikosti, številu jeder in vključkih v citoplazmi. V večini teh celic je bil odkrit glikogen, na podlagi česar so jih avtorji identificirali kot predhodnike hepatocitov. Ker v kulturi niso bile najdene celice, podobne nevroblastom, so sklepali, da pogojenemu mediju, pridobljenemu kot rezultat gojenja embrionalnih hepatocitov, manjkajo faktorji diferenciacije živčnih celic in, nasprotno, vsebuje faktorje, ki inducirajo diferenciacijo stromalnih celic kostnega mozga v predhodnike hepatocitov. Skratka, avtorji nakazujejo prisotnost pluripotentnosti v stromalnih celicah kostnega mozga, saj se in vitro diferencirajo v živčne ali jetrne tkivne celice, odvisno od specifičnega pogojenega medija in uporabljenih induktorjev.

Nekatere študije so dejansko pravilno pokazale diferenciacijo stromalnih celic kostnega mozga v kardiomiocite, hrustančne, kostne in živčne celice. Obstajajo dokazi, da med celicami kostnega mozga obstajajo populacije matičnih celic, ki se lahko diferencirajo v hepatocite. Glede na te podatke lahko rezultate zgornjih poskusov na miših še vedno štejemo za nadaljnjo potrditev prisotnosti pluripotentnih mezenhimskih matičnih celic v kostnem mozgu, ki se lahko diferencirajo v celice različnih tkiv odraslega organizma.

Presaditev mezenhimskih matičnih celic

V klinični transplantologiji se lahko človeške mezenhimske matične celice uporabljajo za zagotovitev širjenja hematopoetskih matičnih celic, pa tudi njihovih zgodnjih predkomitiranih potomcev. Zlasti uvedba avtolognih hematopoetskih matičnih celic in MSC bolnikom z rakom po kemoterapiji z visokimi odmerki pospeši obnovo števila nevtrofilcev in trombocitov v periferni krvi. Alo- in avtologne presaditve mezenhimskih matičnih celic se uporabljajo za zdravljenje multiplega mieloma, aplastične anemije in spontane trombocitopenije - bolezni, povezanih s primarno okvaro v stromi hematopoetskega tkiva. Učinkovitost celične terapije pri onkohematološki patologiji je v mnogih primerih večja ob sočasnem uvajanju stromalnih in hematopoetskih matičnih celic, kar se kaže v skrajšanju pooperativnega obdobja obnove hematopoeze, zmanjšanju števila smrtnih izidov zaradi neselektivnega uničenja regionalnih in krožečih rakavih celic, pri katerih umrejo tudi bolnikove lastne progenitorske hematopoetske celice. Možnosti uporabe MSC in drugih multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic v klinični praksi so posledica relativne enostavnosti njihovega pridobivanja iz aspiratov kostnega mozga, širjenja v kulturi in transfekcije terapevtskih genov. Hkrati se lahko lokalna implantacija multipotentnih mezenhimskih progenitorskih celic uporabi za kompenzacijo lokalnih tkivnih okvar, v primeru sistemskih disfunkcij tkiv mezenhimskega izvora pa ni izključen njihov vnos v splošni krvni obtok.

Avtorji del, v katerih analizirajo možnosti uporabe MSC za lokalno, sistemsko presaditev in gensko terapijo z vidika biologije stromalnih celic, so v svojem razmišljanju bolj previdni. Postnatalni kostni mozeg se tradicionalno obravnava kot organ, ki ga sestavljata dva glavna sistema jasno definiranih celičnih linij - samega hematopoetskega tkiva in z njim povezane podporne strome. Zato so bile mezenhimske matične celice kostnega mozga sprva obravnavane izključno kot vir stromalne osnove za proizvodnjo regulatornih dejavnikov hematopoetskega mikrookolja. Nato se je pozornost raziskovalcev preusmerila na preučevanje vloge MSC kot matičnega vira skeletnih tkiv. Najnovejši podatki kažejo na nepričakovan potencial za diferenciacijo stromalnih celic kostnega mozga z nastankom nevronskega ali mišičnega tkiva. Z drugimi besedami, mezenhimske matične celice kažejo transgermalno plastičnost - sposobnost diferenciacije v celične tipe, ki so fenotipsko nepovezani s celicami izvornega tkiva. Hkrati pa nekateri vidiki biologije stromalnih celic kostnega mozga ostajajo nejasni in nerešeni tako v splošnobiološkem smislu kot v posameznih podrobnostih, vključno z identifikacijo, naravo, izvorom, razvojem in delovanjem stromalnih celic kostnega mozga in vivo, pa tudi z dovoljenim potencialom diferenciacije ex vivo in možnostmi terapevtske uporabe in vivo. Podatki o potencialu mezenhimskih matičnih celic, kot tudi rezultati študij regenerativnega potenciala drugih matičnih celic, so v ostrem nasprotju z dogmami, uveljavljenimi v biologiji.

Pri gojenju pri nizki gostoti stromalne matične celice kostnega mozga tvorijo ločene kolonije, od katerih vsaka izvira iz ene same progenitorske celice. Odstotek stromalnih progenitorskih celic v jedrnih celicah kostnega mozga, ki ga določa sposobnost tvorbe kolonij, je zelo odvisen tako od pogojev gojenja kot od vrste MSC. Na primer, pri glodavcih je prisotnost obsevanih hranilnih celic kostnega mozga in seruma v kulturi nujno potrebna za pridobitev največjega števila stromalnih progenitorskih celic, medtem ko je pri ljudeh učinkovitost tvorbe kolonij mezenhimskih matičnih celic neodvisna tako od hranilnega kot od gojišča. Število znanih mitogenih dejavnikov, ki spodbujajo proliferacijo stromalnih progenitorskih celic, je omejeno. Mednje spadajo PDGF, EGF, FGF, TGF-β in IGF1. V optimalnih pogojih gojenja lahko poliklonske linije MSC prenesejo več kot 50 celičnih delitev in vitro, kar omogoča pridobitev milijard stromalnih celic kostnega mozga iz 1 ml njihovega aspirata.

Vendar pa je populacija stromalnih celic kostnega mozga heterogena, kar se kaže tako v variabilnosti velikosti kolonij, različnih stopnjah njihovega nastajanja kot tudi v raznolikosti celične morfologije, ki zajema razpon od fibroblastom podobnih vretenastih do velikih ploščatih celic. Med razvojem takšnih kultur se po 20 dneh opazi tudi fenotipska heterogenost. Nekatere kolonije so značilne po visoki ekspresiji alkalne fosfataze, druge je sploh ne izražajo, kolonije tretje vrste pa so v osrednjem delu fosfatazno pozitivne, na obrobju pa fosfatazno negativne. Posamezne kolonije tvorijo nodule kostnega tkiva (začetek mineralizacije matriksa je označen z barvanjem z alizarin rdečim ali za kalcij po Van Kossu). V drugih kolonijah pride do kopičenja maščobe, kar se identificira z G-obarvanjem z oljno rdečim. Redkeje kolonije mezenhimskih matičnih celic tvorijo hrustance, obarvane z alciansko modro.

Po ektopični presaditvi v poskusne živali poliklonske linije MGK tvorijo ektopično kost z retikularno stromo, povezano z mielopoezo in adipociti, redkeje pa s hrustančnim tkivom. Pri presaditvi monoklonskih linij stromalnih celic kostnega mozga v nekaterih primerih opazimo himerizem, pri katerem de novo kost sestoji iz celic kostnega tkiva, vsebuje stromo in adipocite donorske izvorne celice, medtem ko celice hematopoetske linije in žilnega sistema izvirajo iz prejemnika.

Rezultati teh študij potrjujejo matično naravo stromalnih progenitorskih celic kostnega mozga, iz katerih je bila izpeljana klonska linija. Prav tako kažejo, da niso vse celice, ki so klonirane v kulturi, resnično multipotentne matične celice. Nekateri raziskovalci menijo, in mi se strinjamo z njihovim mnenjem, da je najbolj zanesljive informacije o dejanskem potencialu diferenciacije posameznih klonov mogoče pridobiti le in vivo po presaditvi in ne z določanjem fenotipa njihovih derivatov in vitro. Izražanje fenotipskih markerjev osteo-, hondro- ali adipogeneze v kulturi (določeno z mRNA ali s histokemičnimi tehnikami) in celo proizvodnja mineraliziranega matriksa ne odražata stopnje pluripotence posameznega klona in vivo. Zato je identifikacija matičnih celic v skupini stromalnih celic mogoča le a posteriori, pod ustreznimi pogoji biološkega transplantacijskega testa. Zlasti hondrogeneza je zelo redko opažena v odprtih transplantacijskih sistemih, medtem ko je tvorba hrustanca daleč od redke v zaprtih sistemih, kot so difuzijske komore ali in vitro mikromasne kulture stromalnih celic, kjer se doseže lokalno nizka napetost kisika, kar spodbuja tvorbo hrustančnega tkiva. Zato tudi tehnika presaditve, pa tudi nespecifični pogoji gojenja in vitro, pomembno vplivajo na obseg diferenciacije MSC.

Eksperimentalna presaditev pod določenimi eksperimentalnimi pogoji je zlati standard za določanje diferenciacijskega potenciala stromalnih celic kostnega mozga in ključni element pri njihovi identifikaciji. Zgodovinsko gledano so študije o presaditvi stromalnih celic kostnega mozga povezane s splošnim problemom presaditve kostnega mozga. Ugotovljeno je bilo, da se hematopoetsko mikrookolje ustvari s presaditvijo stromalnih celičnih linij kostnega mozga in zagotavlja ektopični razvoj hematopoetskega tkiva v območju presaditve. Izvor mikrookolja od darovalca in hematopoetskega tkiva od gostitelja nam omogoča, da ektopično kost obravnavamo kot pravo "obrnjeno" presaditev kostnega mozga. Lokalna presaditev stromalnih celic kostnega mozga spodbuja učinkovito korekcijo kostnih napak, ki je bolj izrazita kot pri spontani reparativni regeneraciji. Več predkliničnih študij na eksperimentalnih modelih je prepričljivo dokazalo možnost uporabe presaditev stromalnih celic kostnega mozga v ortopediji, čeprav je za optimizacijo teh metod potrebno zelo skrbno delo in analiza, tudi v najpreprostejših primerih. Predvsem optimalni pogoji za ekspanzijo osteogenih stromalnih celic ex vivo še niso bili vzpostavljeni, struktura in sestava idealnega nosilca ter število celic, potrebnih za volumetrično regeneracijo kosti, ostajajo nerazviti.

Poleg uporabe ex vivo razširjenih stromalnih celic kostnega mozga za regeneracijo tkiv mezenhimskega izvora, neortodoksna plastičnost MSC odpira potencialne aplikacije za regeneracijo živčnih celic ali dostavo genskih produktov v osrednje živčevje. Načeloma to poenostavlja celično terapijo za poškodbe živčnega sistema, saj ni potrebe po pridobivanju avtolognih človeških živčnih matičnih celic. Poročali so o potencialnih aplikacijah celic kostnega mozga za generiranje kardiomiocitov in miogenih progenitornih celic tako pravega stromalnega kot ekstrastromalnega izvora.

Izvajajo se poskusi sistemske presaditve stromalnih celic kostnega mozga za zdravljenje pogostih bolezni okostja. Ni dvoma, da so stromalne celice kostnega mozga populacija, odgovorna za genetske motnje pri boleznih okostja, kar dobro ponazarja vektorski prenos genetskih informacij z uporabo teh celic, ki vodi do nastanka patološkega kostnega tkiva pri poskusnih živalih. Vendar pa sposobnost stromalnih celic, da se po vnosu v splošni krvni obtok vgnezdijo, primejo, razmnožijo in diferencirajo v skeletnih kosteh, še ni dokazana.

To je deloma zato, ker se pri standardni presaditvi kostnega mozga stroma ne presadi skupaj s hematopoetskim tkivom, zato stroga merila za oceno uspešne primesi sistemsko apliciranih stromalnih celic še niso bila razvita. Ne smemo pozabiti, da prisotnost markernih genov v tkivnih ekstraktih ali izolacija celic darovalskega izvora v kulturi ne kaže na primes celic, temveč le na njihovo preživetje. Tudi intraarterijska injekcija stromalnih celic kostnega mozga v mišji ud lahko povzroči praktično ničelno primesitev, kljub dejstvu, da se celice darovalskega izvora nahajajo v velikem številu v mikrožilju kostnega mozga. Žal so takšne celice običajno opisane kot "presajene" zgolj na podlagi odkritja markernih genov za donorske celice v kulturi ex vivo. Poleg tega je treba predložiti prepričljive dokaze o dolgoročni integraciji diferenciranih in funkcionalno aktivnih celic darovalskega izvora v preučevanih tkivih. V številnih objavljenih člankih, ki poročajo o primesi stromalnih celic kostnega mozga v okostje, je presenetljivo pomanjkanje jasnih podatkov te vrste. Vendar je treba opozoriti, da so nekateri pravilni poskusi na živalih dejansko ugotovili omejeno, a resnično presaditev stromalnih progenitorskih celic po njihovi sistemski uporabi.

Ti podatki so skladni z rezultati študij o možnosti dostave miogenih progenitorskih celic kostnega mozga v mišice prek žilnega sistema. Vendar ne smemo pozabiti, da se tako skeletno kot mišično tkivo tvorita med razvojem in rastjo na podlagi zunajžilnih gibanj celic, ki uporabljajo migracijske procese, ki ne vključujejo krvnega obtoka. Če obstaja neodvisna krvna pot za dostavo progenitorskih celic v trdna fazna tkiva, ali je mogoče domnevati obstoj fiziološko krožečih mezenhimskih progenitorskih celic? Kakšen je izvor teh celic tako v razvijajočem se kot v postnatalnem organizmu in kako prodirajo v žilno steno? Rešitev teh vprašanj se zdi nujno potrebna in zahteva najskrbnejšo predklinično analizo. Tudi po tem, ko bodo najdeni odgovori na ta vprašanja, bodo problematični kinetični vidiki, povezani z rastjo skeleta in preoblikovanjem vezivnega tkiva, ostali nerešeni. Hkrati se zdi zdravljenje motenj osteogeneze z zamenjavo celotne populacije mutiranih skeletnih progenitorskih celic z zdravimi stromalnimi elementi resnična klinična možnost. V tem primeru je mogoče lokalna območja zlomov ali deformacije zaradi patološke osteogeneze, kot tudi destruktivne spremembe v kostnem tkivu, popraviti z uporabo stromalnih matičnih celic, gojenih in vitro. Zato je priporočljivo, da se prihodnje raziskave osredotočijo na probleme transformacije ali genetske korekcije avtolognih mutiranih osteogenih progenitornih celic ex vivo.

Gensko inženirstvo celic, kratkoročno ali trajno, je postalo osnova celične in molekularne biologije, vir številnih znanstvenih odkritij o vlogi posameznih beljakovin v celičnem metabolizmu in vitro in in vivo. Uporaba molekularnih tehnologij za korekcijo dedne patologije in človeških bolezni je zelo obetavna za praktično medicino, saj lastnosti stromalnih matičnih celic kostnega mozga omogočajo razvoj edinstvenih transplantacijskih shem za korekcijo genetskih bolezni okostja. Hkrati je mogoče mezenhimske prekurzorske celice enostavno pridobiti od bodočega prejemnika, so dovzetne za genetske manipulacije in se lahko v kratkem času razmnožujejo v velikih količinah. Uporaba mezenhimskih matičnih celic omogoča, da se izognemo omejitvam in tveganjem, povezanim z neposredno dostavo genetskega informacijskega materiala pacientu prek intravaskularnih vektorskih konstruktov. Podobna strategija velja za embrionalne matične celice, vendar so avtologne postnatalne stromalne celice kostnega mozga bolj zaželen material, saj njihova uporaba izključuje morebitne imunološke zaplete po presaditvi. Za doseganje kratkoročnega učinka, na primer za pospešitev regeneracije kosti, je najbolj optimalna metoda genetska modifikacija mezenhimskih matičnih celic z uporabo elektroporacije, kemične fuzije, lipofekcije, plazmidov in adenovirusnih konstruktov. Zlasti se je virusna transfekcija v stromalne celice kostnega mozga BMP-2 izkazala za učinkovito pri pospeševanju regeneracije kosti pri eksperimentalni politravmi. Ustvarjanje adenovirusnih vektorskih konstruktov je zaželeno zaradi odsotnosti toksičnosti. Vendar pa je genetska modifikacija stromalnih celic kostnega mozga v tem primeru značilna po izjemno nizki stabilnosti. Poleg tega normalne transformirane stromalne celice kostnega mozga zahtevajo uporabo vektorskih nosilcev genetskih informacij, ki so 10-krat bolj kužni kot druge vrste celic, kar znatno poveča odstotek smrti transficiranih celic.

Zdravljenje recesivnih bolezni, ki jih povzroča nizka ali ničelna biološka aktivnost določenih genov, zahteva dolgotrajno ali trajno modifikacijo mezenhimskih matičnih celic, kar zahteva uporabo adeno-povezanih virusov, retrovirusov, lentivirusov ali adeno-retrovirusnih himer. Transportne regije teh virusov so sposobne prenašati velike transfekte DNK (do 8 kb). Znanstvena literatura je že poročala o eksogeni biološki aktivnosti stromalnih celic kostnega mozga, transficiranih z retrovirusnimi konstrukti, ki kodirajo sintezo regulatornih in markernih molekul - IL-3, CD2, faktorja VIII, pa tudi encimov, ki sodelujejo pri sintezi L-DOPA. Vendar pa avtorji tudi v teh študijah opozarjajo na številne omejitve, ki jih je treba premagati pred praktično uporabo te tehnologije. Prvi problem je optimizacija procesa modifikacije MSC ex vivo. Znano je, da dolgotrajna (3-4 tedne) proliferacija stromalnih celic kostnega mozga in vitro zmanjša njihovo transfekcijo. Hkrati je za doseganje visoke stopnje genske modifikacije MSC potrebno izvesti več ciklov transfekcije. Druga težava je povezana s trajanjem terapevtske genske ekspresije, ki še ne presega štirih mesecev. Naravno zmanjšanje učinkovite genske ekspresije je posledica inaktivacije promotorja in smrti spremenjenih celic. Glede na splošne možnosti prenosa genetskih informacij z uporabo mezenhimskih matičnih celic rezultati predhodnih študij kažejo na potrebo po nadaljnji optimizaciji metod transfekcije ex vivo, izbiri ustreznega promotorja, ki uravnava biološko aktivnost v želeni smeri, in povečanju sposobnosti spremenjenih stromalnih celic kostnega mozga za samovzdrževanje in vivo po presaditvi. Treba je opozoriti, da uporaba retrovirusnih konstruktov za spreminjanje stromalnih celic kostnega mozga v želeni smeri ne zahteva vedno njihovega obveznega presadka. Transficirane mezenhimske matične celice lahko opravljajo korektivno funkcijo v ozadju stabilnega bivanja in brez obvezne aktivne fizične vgradnje in delovanja v vezivno tkivo. V tem primeru jih je treba obravnavati kot biološko mini črpalko, ki in vivo proizvaja faktor, katerega pomanjkanje določa manifestacijo genetske patologije.

Uporaba transformiranih stromalnih celic kostnega mozga za zdravljenje dominantne genetske patologije, za katero je značilna ekspresija gena s patološko ali nenormalno biološko aktivnostjo, je veliko bolj problematična, saj je v tem primeru treba blokirati prenos ali implementacijo popačenih genetskih informacij. Ena od metod genskega inženiringa je homologna rekombinacija embrionalnih matičnih celic za ustvarjanje transgenih živali. Vendar pa izjemno nizka stopnja homologne rekombinacije v kombinaciji s težavami identifikacije, ločevanja in širjenja takšnih rekombinantov verjetno ne bo prispevala k široki uporabi te metode v bližnji prihodnosti, tudi če bodo razvite nove tehnološke metode. Drugi pristop v genski terapiji dominantne patologije temelji na samodejnem popravljanju poškodovane DNK, saj je mogoče genetske mutacije popraviti z vnosom eksogene DNK z želenim zaporedjem (kratki DNK oligonukleotidi ali himerni RNA/DNK oligonukleotidi), ki se veže na homologe v poškodovanem genomu. Tretja možnost vključuje blokiranje prenosa patoloških informacij, kar dosežemo z uporabo posebej zasnovanih oligonukleotidov, ki se vežejo na določen gen in tvorijo ternarno vijačno strukturo, ki odpravlja možnost transkripcije.

Čeprav ostaja korekcija genetske bolezni na ravni genoma najbolj optimalna in prednostna terapevtska metoda, je mRNA tudi obetaven vektor (morda celo bolj dostopen) za blokiranje dominantnega negativnega gena. Proteinske molekule z antisense oligonukleotidi ali popolnimi zaporedji, ki blokirajo vezavo mRNA na celični biosintetski aparat, se že dolgo uporabljajo za zaviranje translacije in/ali povečanje razgradnje mRNA. Poleg tega dvoverižna RNA povzroča hitro razgradnjo mRNA, katere mehanizem ostaja nejasen. Vendar pa je malo verjetno, da bo zgolj izločanje mRNA, prepisanih iz mutantnega alela s kratkimi ali posameznimi mutacijami, spodbudilo izražanje mRNA normalnega alela. Alternativa je uporaba ribosintez s kladivci in lasnicami, ki se lahko vežejo na visoko specifične regije mRNA s poznejšo indukcijo njihovega cepitve in inaktivacije med translacijo. Možnost uporabe te metode pri zdravljenju patološke osteogeneze se trenutno preučuje. Ne glede na to, kaj točno je tarča - genomski ali citoplazemski elementi, bo uspeh novih tehnologij genske terapije odvisen od učinkovitosti vključitve reagentov v stromalne celice kostnega mozga ex vivo, optimalne izbire specifičnega vektorja in stabilne sposobnosti mezenhimskih matičnih celic, da izražajo potrebne faktorje in vivo.

Odkritje mezenhimskih matičnih celic z njihovimi nepričakovanimi lastnostmi tako ustvarja novo konceptualno shemo za razvoj celičnih linij. Vendar pa so potrebne nadaljnje interdisciplinarne raziskave, da bi razumeli biološko vlogo stromalnih matičnih celic, njihovo naravo, njihovo sposobnost transdiferenciacije ali dediferenciacije, njihov fiziološki pomen med embrionalnim razvojem, postnatalno rastjo, zorenjem in staranjem, pa tudi pri človeških boleznih.