Imunofenotipizacija hemoblastoz

Pomemben napredek v hematoloških raziskavah v zadnjih letih je povezan z uporabo sodobnih imunoloških metod in avtomatiziranih sredstev za analizo in sortiranje celic periferne krvi in kostnega mozga - pretočnih citometrov. Tradicionalne morfološke in citokemijske študije celic substrata bolezni (kri, rdeči kostni mozeg, bezgavke, vranica itd.) nam v mnogih primerih, zlasti pri limfoproliferativnih boleznih, ne omogočajo identifikacije celotne raznolikosti variant med morfološko podobnimi oblikami in ugotavljanja izvora patološkega klona. Te probleme je mogoče rešiti le s preučevanjem imunoloških značilnosti celic. Vsaka stopnja diferenciacije hematopoetskih celic ustreza svojemu naboru antigenov, ki se po mednarodni klasifikaciji imenujejo diferenciacija in so razdeljeni v diferenciacijske skupine, označene kot CD.

Pri neoplastičnih spremembah lahko do blokade diferenciacije pride v kateri koli fazi normalnega celičnega razvoja, kar povzroči nastanek klona patoloških celic, ki določajo bolezenski substrat in imajo enake imunološke (ali fenotipske) značilnosti. Z izvajanjem študij teh markerjev na celicah je mogoče ugotoviti, kateri obliki in varianti bolezni ustrezajo, torej na podlagi imunološkega fenotipa celic izvesti diferencialno diagnostiko, ki je najtežja pri limfoproliferativnih boleznih, saj so glavne celice patološkega substrata bolezni morfološko skoraj identične celice.

Fenotipizacija omogoča uporabo monoklonskih protiteles za tipizacijo blastnih in zrelih krvnih celic mielo-, mono- in limfocitne serije na podlagi prisotnosti diferenciacijskih antigenov (receptorjev) v celični steni. Razdelek "Ocena imunskega statusa telesa" delno opisuje značilnosti in diagnostično vrednost študije celičnih markerjev; spodaj je kratek opis antigenskih markerjev celic v povezavi z diagnozo hemoblastoz. Na membranah krvnih celic in rdečega kostnega mozga je mogoče zaznati naslednje antigene (markerje).

• CD2 je monomerni transmembranski glikoprotein. Prisoten je na površini vseh T-limfocitov, ki krožijo v krvi, in na nekaterih NK-limfocitih. CD2 sodeluje v procesu alternativne aktivacije T-limfocitov. Detekcija CD2 z uporabo monoklonskih protiteles se v klinični praksi uporablja za fenotipizacijo akutne T-celične levkemije, limfomov, kroničnih vnetnih stanj in stanj imunske pomanjkljivosti.
• CD3 je beljakovinski kompleks, povezan z antigensko specifičnim receptorjem T-celic, in je glavni funkcionalni marker T-limfocitov. Omogoča prenos aktivacijskega signala iz membrane v celično citoplazmo. Določanje CD3 je indicirano za diagnozo akutne T-celične levkemije, limfomov (CD3 se ne izraža v limfoidnih neoplazmah, ki niso T-celične) in bolezni imunske pomanjkljivosti.
• CD4 je transmembranski glikoprotein, ki ga izraža subpopulacija T-pomožnih celic (induktorjev), ki predstavljajo 45 % limfocitov periferne krvi. V zgodnjih fazah razvoja limfocitov v timusu vsi kortikalni limfociti izražajo antigene CD4, pa tudi CD8. Medularni timociti, katerih fenotip je podoben zrelim CD4+ T-celicam periferne krvi (T-pomožne celice), že izražajo receptorje CD4 ali CD8. V periferni krvi do 5 % celic nosi tako markerje CD4 kot CD8. Manjša ekspresija CD4 je možna na nekaterih celicah monocitne serije. CD4 se izraža v večini primerov T-celičnih limfomov, vključno z fungoidno mikozo, pa tudi pri levkemiji T-celic, povezani s HTLV (HTLV - humani T-limfotropni virus).
• CD5 je enoverižni glikoprotein, prisoten na vseh zrelih limfocitih T in večini timocitov, limfociti B pa ga šibko izražajo. CD5 se zazna na neoplastičnih celicah kronične limfocitne levkemije B-celic in centrocitnega limfoma. Pri drugih vrstah malignih limfoidnih bolezni – folikularnem limfomu, dlakavocelični levkemiji, velikoceličnem limfomu – se CD5 ne izraža.
• CD7 je enoverižni protein, najzgodnejši označevalec diferenciacije celic T. Pro-T-limfociti ga izražajo še pred njihovo migracijo v timus. CD7 je zaznan na večini NK celic, šibka ekspresija pa je opazna na monocitih. B-limfociti in granulociti tega antigena ne vsebujejo. Določanje CD7 se uporablja za diagnosticiranje limfomov, otroške limfoblastne levkemije celic T.
• CD8 je protein, sestavljen iz dveh polipeptidnih verig, povezanih z disulfidnimi mostovi. Izraža ga subpopulacija citotoksičnih in supresorskih T-limfocitov, ki predstavljajo 20–35 % perifernih krvnih limfocitov. Ta antigen izražajo tudi NK-limfociti, kortikalni timociti, 30 % medularnih timocitov in subpopulacija celic rdečega kostnega mozga. CD8 se preučuje za kvantificiranje vsebnosti T-supresorjev (glejte poglavje »Supresorski T-limfociti v krvi« zgoraj).

• CD10 je endopeptidaza, povezana s celično membrano. CD10 izražajo mlade oblike limfocitov B in subpopulacija kortikalnih limfocitov. CD10 izražajo vse celice ALL.
• CD11c se na celični membrani izraža z makrofagi, monociti, granulociti, NK celicami in celicami dlakavocelične levkemije.
• CD13 je glikoprotein, ki ga izražajo celice mielomonocitne linije (progenitorske celice, nevtrofilci, bazofili, eozinofili, monociti in celice mieloidne levkemije). Ni ga v limfocitih T in B, eritrocitih in trombocitih.
• CD14 je površinski membranski glikoprotein. Izražajo ga predvsem monociti in makrofagi. CD14 je zaznan na več kot 95 % monocitov v periferni krvi in kostnem mozgu. Močno izražanje CD14 opazimo pri akutni mieloblastni levkemiji. Ta antigen se ne izraža pri akutni in kronični limfoblastni levkemiji.
• CD15 je oligosaharid. Sodeluje pri fagocitozi in kemotaksiji. Ta antigen je prisoten na površini zrelih granulocitov in Berezovsky-Sternbergovih celic. Izražanje antigena CD15 je zaznano pri Hodgkinovi bolezni. Pri ne-Hodgkinovih limfomih CD15 v večini primerov ni zaznan.
• CD16 se izraža na površini granulocitov, monocitov, makrofagov in NK celic. Vsi limfociti, ki izražajo ta antigen, imajo sposobnost celične citotoksičnosti, odvisne od protiteles. CD16 se določa med tipizacijo kroničnih mielocitnih levkemij za karakterizacijo NK celic.
• CD19 je glikoprotein, ki je prisoten na vseh perifernih limfocitih B in vseh predhodnikih celic B. V plazemskih celicah ga ni. Je najzgodnejši označevalec celic B in ima pomembno vlogo pri uravnavanju aktivacije in proliferacije celic B. CD19 se izraža na vseh neoplastičnih celicah akutne levkemije B-celičnega izvora in je prisoten tudi pri nekaterih oblikah akutne monoblastne levkemije.
• CD20 je neglikoziliran protein. V ontogenezi B-limfocitov se antigen CD20 pojavi po CD19 v fazi pred-B-celične diferenciacije limfocitov. V plazemski membrani plazemskih celic ga ni. Izraža se pri ALL, kronični limfocitni levkemiji B-celic, dlakavocelični levkemiji, Burkittovem limfomu in zelo redko pri akutni monoblastni levkemiji.
• CD21 je glikoprotein, ki je v znatnih količinah prisoten na B-limfocitih v limfoidnih organih in v majhnih količinah na B-celicah v periferni krvi. CD21 je receptor za virus Epstein-Barr.
• CD22 je protein, sestavljen iz dveh polipeptidnih verig. Izraža se na membrani večine limfocitov B, vključno s celicami prekurzorji (prolimfociti). Antigen se po aktivaciji ne izraža na limfocitih B (plazemskih celicah). Najbolj izrazita ekspresija CD22 je zaznana na celicah pri dlakavocelični levkemiji, šibka pa pri mieloidni levkemiji in ne-T-celični ALL.
• CD23 je glikoprotein, ki ga v veliko večji meri izražajo aktivirani periferni krvni limfociti B. CD23 posreduje pri IgE-odvisno citotoksičnost in fagocitozo makrofagov in eozinofilov.
• CD25 je enoverižni glikoprotein, ki je opredeljen kot receptor z nizko afiniteto za IL-2. Ta receptor se izraža na aktiviranih limfocitih T in v manjši gostoti na aktiviranih celicah B. V periferni krvi zdravih posameznikov je antigen prisoten na več kot 5 % limfoidnih celic.
• CD29 je fibronektinski receptor. Široko je razširjen v tkivih in ga izražajo levkociti. Detekcija CD29 na perifernih krvnih celicah se uporablja za tipizacijo subpopulacije celic T s fenotipom CD4+CD29+, ki jih imenujemo pomočniki tipa 2 (Th2). Te celice sodelujejo v humoralnem imunskem odzivu s proizvodnjo limfokinov.
• CD33 je transmembranski glikoprotein. Prisoten je na površini celic mieloidne in monocitne serije. Najdemo ga na površini monocitov in v manjši meri granulocitov v periferni krvi. Približno 30 % celic rdečega kostnega mozga izraža CD33, vključno z mieloblasti, promielociti in mielociti. Antigen ni prisoten v membranah pluripotentnih matičnih celic. Določanje CD33 se uporablja za karakterizacijo celic pri levkemijah mieloidnega izvora. Levkemične celice limfoidnega in eritroidnega izvora ne izražajo CD33.
• CD34 je fosfoglikoprotein, ki ga izražajo hematopoetske progenitorske celice, vključno z monopotentnimi matičnimi celicami. Najbolj izrazito izražanje Ag opazimo v zgodnjih progenitorskih celicah; ko celice dozorijo, se izražanje markerjev zmanjša. CD34 najdemo tudi na endotelijskih celicah. Določanje CD34 se uporablja za karakterizacijo celic pri akutni mieloblastni in limfoblastni levkemiji. Pri kronični limfocitni levkemiji in limfomih izražanja antigena CD34 ne zaznamo.

• CD41a izražajo trombociti in megakariociti. Monoklonska protitelesa za odkrivanje CD41a se uporabljajo za diagnosticiranje megakarioblastne levkemije. Pri Glanzmannovi trombasteniji je izražanje tega antigena odsotno ali znatno zmanjšano.
• CD42b je membranski glikoprotein, sestavljen iz dveh polipeptidnih verig. Marker se zazna na površini trombocitov in megakariocitov. V klinični praksi se odkrivanje CD42b uporablja za diagnosticiranje trombocitopatije - Bernard-Soulierjevega sindroma.
• CD45RA spada v razred transmembranskih glikoproteinov. Je pogost levkocitni antigen. Izraža se na celični membrani limfocitov B, v manjši meri na limfocitih T in na zrelih medularnih timocitih. Granulociti ga ne izražajo.
• CD45RO je nizkomolekularna izoforma CD45RA, pogostega levkocitnega antigena. Zazna se na celicah T (spominski T limfociti), subpopulaciji B limfocitov, monocitih in makrofagih. Monoklonska protitelesa proti CD45RO interagirajo z večino timocitov, subpopulacijo mirujočih CD4+ in CD8+ T limfocitov ter zrelimi aktiviranimi T celicami. Ta antigen nosijo tudi celice mielomonocitnega izvora, granulociti in monociti. Zazna se v centroblastnih in imunoblastnih limfomih.
• CD46 je O-glikoziliran dimer. Široko je porazdeljen v tkivih in ga izražajo limfociti T in B, monociti, granulociti, celice NK, trombociti, endotelijske celice in fibroblasti, vendar ga na površini rdečih krvničk ni. CD46 zagotavlja zaščito tkiva pred komplementom.
• CD61 je trombocitni antigen. Izraža se na trombocitih periferne krvi in rdečega kostnega mozga, pa tudi na megakariocitih in megakarioblastih. Njegovo določanje se uporablja kot marker pri akutni megakarioblastni levkemiji. Pri bolnikih z Glanzmannovo trombastenijo je izražanje antigena odsotno ali pa je zavirano.
• CD95, imenovan tudi Fas ali APO-1, je transmembranski glikoprotein, član družine receptorjev faktorja tumorske nekroze. V znatnih količinah se izraža na limfocitih T (CD4+ in CD8+) v periferni krvi in v manjši meri na limfocitih B in celicah NK. Ta antigen se izraža tudi na granulocitih, monocitih, tkivnih celicah in neoplastičnih celicah. Vezava CD95 na ligand Fas (CD95L) povzroči apoptozo v celicah.
• CD95L ali Fas ligand je membranski protein, ki spada v družino receptorjev faktorja tumorske nekroze. Ta antigen izražajo citotoksični limfociti T, celice NK in zelo pogosto tumorske celice; je glavni povzročitelj apoptoze v celicah.
• HLA-DR je monomorfni determinant molekul razreda II človeškega glavnega kompleksa histokompatibilnosti (HLA). Marker se izraža na Langerhansovih celicah, dendritičnih celicah limfoidnih organov, nekaterih vrstah makrofagov, limfocitih B, aktiviranih celicah T in timičnih epitelijskih celicah. Študija tega markerja se uporablja za kvantitativno določanje aktiviranih limfocitov T s fenotipom CD3+ HLA-DR+.

Z uporabo drugačnega izbora monoklonskih protiteles proti markerjem je mogoče ustvariti fenotipski portret celic, značilnih za določeno obliko levkemije.

Poleg uporabe imunofenotipizacijskih metod za diagnostiko in diferencialno diagnostiko hemoblastoz se je izkazala za še posebej pomembno njihovo uporabo v procesu zdravljenja za oceno stanja remisije in preostale populacije levkemičnih celic. Poznavanje fenotipskega "portreta" blastnih celic v obdobju diagnoze omogoča, da ti označevalci odkrijejo celice levkemičnega klona v obdobju remisije in s povečanjem njihovega števila napovejo razvoj recidiva že dolgo pred (1-4 mesece) pojavom njegovih kliničnih in morfoloških znakov.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]