Nevronske matične celice

Eksperimentalni dokazi o možnosti regeneracije celic centralnega živčnega sistema so bili pridobljeni veliko prej kot odkritje embrionalnih matičnih celic v študijah, ki so pokazale prisotnost celic v neokorteksu, hipokampusu in vohalnih čebulicah možganov odraslih podgan, ki zajamejo 3H-timidin, tj. so sposobne sinteze in delitve beljakovin. Že v 60. letih prejšnjega stoletja so domnevali, da so te celice predhodnice nevronov in so neposredno vključene v procese učenja in spomina. Nekoliko kasneje je bila razkrita prisotnost sinaps na nevronih, ki so nastali de novo, in pojavila so se prva dela o uporabi embrionalnih matičnih celic za indukcijo nevrogeneze in vitro. Konec 20. stoletja so poskusi z usmerjeno diferenciacijo embrionalnih matičnih celic (ESC) v nevronske progenitorske celice, dopaminergične in serotonergične nevrone privedli do revizije klasičnih predstav o sposobnosti regeneracije živčnih celic sesalcev. Rezultati številnih študij so prepričljivo dokazali tako resničnost prestrukturiranja nevronskih mrež kot tudi prisotnost nevrogeneze skozi celotno obdobje postnatalnega življenja sesalskega organizma.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Viri nevronskih matičnih celic

Človeške nevronske matične celice so izolirane med operacijami na subventrikularnem predelu lateralnih prekatov in zobatem girusu hipokampusa, katerih celice v kulturi tvorijo nevrosfere (nevralne krogle), po disperziji in preformaciji slednjih pa vse glavne celične tipe centralnega živčnega sistema ali v posebnem mediju nove mikrosfere. V suspenzijskih kulturah disociiranega tkiva, izoliranega iz periventrikularnih predelov embrionalnih možganov, nastanejo tudi nevrosfere.

Markerji nezrelih možganskih celic vključujejo nestin, beta-tubulin III (marker nevronske linije), vimentin, GFAP in NCAM, ki jih imunocitokemično identificiramo z uporabo monoklonskih protiteles. Nestin (vmesni nevrofilamentni protein tipa IV) izražajo multipotentne nevroektodermalne celice. Ta protein se uporablja za identifikacijo in izolacijo multipotentnih nevroepitelnih progenitorskih celic iz osrednjega živčevja z uporabo monoklonskih protiteles Rat-401, ki lahko enajsti dan brejosti zaznajo do 95 % celic nevralne cevi v zarodkih podgan. Nestin se ne izraža na diferenciranih potomcih nevronskih matičnih celic, je pa prisoten v zgodnjih nevronskih progenitorskih celicah, postmitotičnih nevronih in zgodnjih nevroblastih. Ta marker se uporablja za identifikacijo nevroepitelnih progenitorskih celic in za dokazovanje obstoja matičnih celic v osrednjem živčevju. Vimentin (vmesni nevrofilamentni protein tipa III) izražajo nevronske in glialne progenitorske celice, pa tudi nevroni, fibroblasti in gladkomišične celice. Zato obema imunocitokemičnima označevalcema manjka specifičnost, potrebna za ločeno identifikacijo nevronskih matičnih in progenitorskih celic. Beta-tubulin III določa nevronsko smer diferenciacije matičnih celic, medtem ko astrocite tipa I identificiramo z izražanjem GFAP, oligodendrociti pa specifično izražajo galaktocerebrozid (Ga!C).

FGF2 in EGF služita kot mitogena za nevronske progenitorske celice in podpirata proliferacijo nediferenciranih progenitorskih celic v kulturi z nastankom nevrosfer. Hitrost delitve nevronskih matičnih celic se pod vplivom FGF2, pa tudi z uporabo kombinacije FGF2 + EGF, znatno poveča. Proliferativne učinke FGF2 posredujejo receptorji FGF2-R1. Heparin poveča afiniteto vezave receptorjev FGF2 in dramatično okrepi njegov mitogeni učinek na nevroepitelijske celice. V zgodnjih fazah embriogeneze se receptorji FGF2 izražajo v telencefalonu podgan, v kasnejših fazah pa je njihova lokalizacija omejena na ventrikularno cono. Vrhunec izražanja FGF2-R1 v postmitotičnih celicah opazimo po zaključku zgodnjega obdobja nevrogeneze. Začetno obdobje razvoja telencefalona je značilno po nizki ravni izražanja receptorjev EGF, predvsem v celicah ventralne regije. V kasnejših fazah embriogeneze se izražanje EGF-R poveča v dorzalni smeri. V možganih glodalcev ima EGF visoko afiniteto za receptor transformirajočega rastnega faktorja beta (TGF-beta-R), na katerega se prednostno veže. Posredni dokazi za funkcionalno vlogo EGF-R so podatki o kortikalni disgenezi sprednjega dela možganov, ki se pojavi v poznem obdobju embriogeneze in postnatalne ontogeneze, zmanjšani funkciji sprednjega dela možganov, smrti kortikalnih celic in ektopiji hipokampusa pri miših z izbitim genom receptorja EGF. Poleg tega je prisotnost TGF-a v hranilnem mediju nujno potrebna za nastanek nevrosfer. Po odstranitvi rastnih faktorjev iz pogojenega medija se celice prenehajo deliti in se spontano diferencirajo z nastankom nevronov, astrocitov in oligodendroblastov.

Ob upoštevanju tega se reagregacija disociiranih matičnih celic in gojenje nevrosfer izvajata v hranilnih medijih, ki vsebujejo EGF in bazični FGF ali FGF2, vendar brez dodajanja seruma. Dokazano je, da EGF inducira proliferacijo matičnih celic subependimalne cone lateralnih prekatov, bazični FGF pa spodbuja proliferacijo matičnih celic striatuma, hipokampusa, neokorteksa in vidnega živca zrelih možganov. Kombinacija EGF in bazičnega FGF je nujno potrebna za aktivno proliferacijo matičnih celic, izoliranih iz ependima tretjega in četrtega prekata sprednjega dela možganov, pa tudi iz hrbtenjačnega kanala prsnega in ledvenega dela hrbtenjače.

Po disociaciji se suspenzija nevronskih matičnih celic goji v plastičnih posodicah ali večjamičnih ploščah brez adhezivnega substrata, da se poveča velikost nastalih nevrosfer, kar običajno traja približno 3 tedne. Metoda večkratne disperzije in reprodukcije nevrosfer omogoča pridobitev zadostnega števila linearnih klonov multipotentnih matičnih celic za intracerebralno presaditev. To načelo je tudi osnova za ustvarjanje banke matičnih celic, izoliranih iz možganov človeškega zarodka. Njihovo dolgoročno (več let) kloniranje omogoča pridobitev stabilnih linij nevronskih matičnih celic, iz katerih med inducirano diferenciacijo nastanejo kateholaminergični nevroni.

Če nevrosfere niso dispergirane in gojene na adhezivnih substratih v medijih brez rastnih faktorjev, se proliferirajoče matične celice začnejo spontano diferencirati in tvorijo nevronske in glialne prekurzorske celice, ki izražajo markerje vseh vrst živčnih celic: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulin III (nevroni), GFAP (astrociti) in CalC, 04 (oligodendrociti). Za razliko od mišjih in podganjih celic nevroni predstavljajo več kot 40 % vseh diferenciranih celic v kulturah človeških nevronskih matičnih celic (od 1 do 5 % pri glodavcih), vendar nastane bistveno manj oligodendrocitov, kar je zelo pomembno z vidika celične terapije demielinizirajočih bolezni. Problem rešimo z dodajanjem gojišča B104, ki spodbuja nastanek celic, ki proizvajajo mielin.

Pri gojenju nevronskih progenitorskih celic iz možganov človeških zarodkov v gojišču, ki vsebuje EGF, bazični FGF in LIF, se število predhodniških celic nevronske linije poveča za 10 milijonov krat. Celice, ki se in vitro razmnožujejo, ohranijo sposobnost migracije in diferenciacije v nevronske in glialne elemente po presaditvi v možgane odraslih podgan. Vendar pa je in vivo število delitev multipotentnih predhodniških celic omejeno. Večkrat je bilo ugotovljeno, da je Hayflickova meja za "odraslo" nevronsko matično celico (približno 50 mitoz) še vedno nedosegljiva niti v poskusu - celice v obliki nevrosfer ohranijo svoje lastnosti le 7 mesecev in šele po 8 pasažah. Domneva se, da je to posledica posebnosti njihovih metod disperzije med pasažami (tripsinizacija ali mehansko delovanje), ki močno zmanjšajo proliferativno aktivnost celic zaradi motenj medceličnih stikov. Dejansko se, če namesto disperzije uporabimo metodo delitve nevrosfer na 4 dele, viabilnost celic med pasažami znatno poveča. Ta metoda omogoča gojenje človeških nevronskih matičnih celic 300 dni. Vendar pa po tem obdobju celice izgubijo mitotično aktivnost in se podvržejo degeneraciji ali pa vstopijo v fazo spontane diferenciacije z nastankom nevronov in astrocitov. Na podlagi tega avtor meni, da je 30 mitoz največje število delitev za gojene nevronske matične celice.

Ko se človeške živčne matične celice gojijo in vitro, se tvorijo pretežno GABAergični nevroni. Brez posebnih pogojev živčne progenitorske celice povzročijo nastanek dopaminergičnih nevronov (potrebnih za celično zdravljenje Parkinsonove bolezni) šele v prvih pasažah, nakar vsi nevroni v kulturi sestojijo izključno iz GABAergičnih celic. Pri glodavcih IL-1 in IL-11 ter fragmenti membran živčnih celic, LIF in GDNF, povzročajo indukcijo dopaminergičnih nevronov in vitro. Vendar se je ta metodološki pristop pri ljudeh izkazal za neuspešnega. Kljub temu pa se pri intracerebralni presaditvi GABAergičnih nevronov in vivo pod vplivom mikrookoljskih dejavnikov pojavijo živčne celice z različnimi mediatorskimi fenotipi.

Iskanje kombinacij nevrotrofičnih faktorjev je pokazalo, da FGF2 in IL-1 inducirata nastanek dopaminergičnih nevroblastov, ki pa niso sposobni proizvajati dopaminergičnih nevronov. Diferenciacija hipokampalnih matičnih celic v ekscitatorne glutamatergične in inhibitorne GABA-ergične nevrone poteka pod vplivom nevrotrofinov, EGF in IGF1 pa inducirata nastanek glutamatergičnih in GABA-ergičnih nevronov iz nevronskih progenitorskih celic človeških zarodkov. Zaporedno dodajanje retinojske kisline in nevrotrofina 3 (NT3) v kulturo znatno poveča diferenciacijo zrelih možganskih hipokampalnih matičnih celic v nevrone različne mediatorske narave, medtem ko lahko kombinacija možganskega nevrotrofičnega faktorja (BNDF), NT3 in GDNF proizvede piramidne nevrone v hipokampalnih in neokortikalnih kulturah.

Rezultati številnih študij torej kažejo, da se matične celice iz različnih možganskih struktur pod vplivom lokalnih specifičnih tkivnih dejavnikov lahko in vivo diferencirajo v nevronske fenotipe, ki so lastni tem strukturam. Drugič, ciljno inducirana diferenciacija nevronskih matičnih celic in vitro z uporabo kloniranja progenitorskih celic omogoča pridobivanje živčnih in glialnih celic z določenimi fenotipskimi značilnostmi za intracerebralno presaditev pri različnih oblikah možganske patologije.

Ni dvoma, da lahko pluripotentne matične celice, izolirane iz zarodkov ali odraslega CNS, veljajo za vir novih nevronov in se uporabljajo v kliniki za zdravljenje nevrološke patologije. Vendar pa je glavna ovira za razvoj praktične celične nevrotransplantacije dejstvo, da se večina nevronskih matičnih celic po implantaciji v nenevrogene cone zrelega CNS ne diferencira v nevrone. Da bi se tej oviri izognili, je predlagana zelo izvirna inovativna metoda, ki omogoča in vitro pridobitev čiste populacije nevronov iz človeških fetalnih nevronskih matičnih celic po presaditvi v CNS odrasle podgane. Avtorji dokazujejo, da se diferenciacija celic, vsajenih s to metodo, konča z nastankom nevronov holinergičnega fenotipa, kar je posledica vpliva dejavnikov okoliškega mikrookolja. Predlagana tehnologija je zanimiva z vidika razvoja novih vrst terapije na osnovi matičnih celic in nadomeščanja nevronov, poškodovanih zaradi poškodb ali nevrodegenerativnih bolezni, saj imajo holinergični nevroni vodilno vlogo pri razvoju motoričnih, spominskih in učnih funkcij. Predvsem holinergični nevroni, izolirani iz človeških matičnih celic, se lahko uporabijo za nadomestitev motoričnih nevronov, izgubljenih pri amiotrofični lateralni sklerozi ali poškodbah hrbtenjače. Trenutno ni informacij o metodah za proizvodnjo znatnega števila holinergičnih nevronov iz populacije z mitogenom predhodno oblikovanih matičnih celic. Avtorji predlagajo dokaj preprosto, a učinkovito metodo za spodbujanje z mitogenom predhodno oblikovanih primarnih človeških embrionalnih nevronskih matičnih celic, da se po implantaciji v nenevrogene in nevrogene cone osrednjega živčevja odrasle podgane razvijejo v praktično čiste nevrone. Najpomembnejši rezultat njihovega dela je pretvorba dovolj velikega števila presajenih celic v holinergične nevrone, ko so implantirane v srednjo membrano in hrbtenjačo.

Poleg tega je za preformacijo nevronskih matičnih celic iz 8-tedenske možganske skorje človeškega zarodka v holinergične nevrone in vitro predlagana uporaba različnih kombinacij naslednjih trofičnih faktorjev in kemičnih elementov: rekombinantni bazični FGF, EGF, LIF, mišji amino-terminalni zvočni peptid (Shh-N), trans-retinojska kislina, NGF, BDNF, NT3, NT4, naravni laminin in mišji heparin. Prvotna linija človeških nevronskih matičnih celic (K048) je bila in vitro vzdrževana dve leti in je prestala 85 pasaž brez sprememb v proliferativnih in diferenciacijskih lastnostih, hkrati pa je ohranila normalen diploidni kariotip. Nedisperzirane nevrosfere pasaž 19–55 (tedni 38–52) so bile nanesene na poli-d-lizin in laminin ter nato obdelane z zgoraj omenjenimi faktorji v različnih koncentracijah, kombinacijah in zaporedjih. Kombinacija bazičnega FGF, heparina in laminina (okrajšano FHL) je dala edinstven učinek. Po enem dnevu gojenja embrionalnih nevronskih matičnih celic v gojišču FHL z ali brez Shh-N (kombinacija Shh-N + FHL v okrajšavi SFHL) so opazili hitro proliferacijo velikih planarnih celic. Vsi drugi enodnevni protokoli (kot je osnovni FGF + laminin) pa so nasprotno privedli do omejenega radialnega širjenja vretenastih celic in te celice niso zapustile jedra nevrosfer. Po 6 dneh aktivacije in nadaljnjih 10 dneh diferenciacije v gojišču, ki je vsebovalo B27, so na robu s FHL aktiviranih sfer odkrili velike multipolarne nevronom podobne celice. V drugih protokolnih skupinah je večina nevronom podobnih celic ostala majhna in bipolarna ali unipolarna. Imunocitokemična analiza je pokazala, da so bile majhne (< 20 μm) bipolarne ali unipolarne celice bodisi GABAergične bodisi glutamatergične, medtem ko je bila večina velikih multipolarnih celic, lokaliziranih na robu s FHL aktiviranih nevrosfer, holinergičnih in so izražale markerje, značilne za holinergične nevrone (Islet-1 in ChAT). Nekateri od teh nevronov so hkrati izražali sinapsin 1. Avtorji so v petih serijah neodvisnih poskusov ugotovili, da se je celotna populacija celic v enoslojnih conah diferencirala v TuJ1+ nevrone za 45,5 %, medtem ko so holinergični (ChAT^) nevroni predstavljali le 27,8 % celic iste populacije. Po 10 dneh dodatne diferenciacije in vitro so v FHL-aktiviranih nevrosferah poleg holinergičnih nevronov našli tudi znatno število majhnih nevronov - glutamatergičnih (6,3 %), GABA-ergičnih (11,3 %), pa tudi astrocitov (35,2 %) in nestin-pozitivnih celic (18,9 %). Pri uporabi drugih kombinacij rastnih faktorjev so bili holinergični nevroni odsotni, marginalne celice nevrosfer pa so tvorile bodisi astrocite bodisi majhne glutamatergične in GABA-ergične nevrone. Spremljanje rezervnih in aktivnih potencialov z uporabo tehnike celocelične patch clamp je pokazalo, da je imela po sedmih dneh aktivacije FHL večina velikih polipolarnih celic potencial mirovanja -29,0 ± 2,0 mV v odsotnosti akcijskega potenciala. Po 2 tednih se je potencial mirovanja povečal na -63.6±3,0 mV, akcijski potenciali pa so bili opaženi v trenutku indukcije depolarizacijskih tokov in so bili blokirani z 1 M tetrodotoksinom, kar kaže na funkcionalno aktivnost holinergičnih nezrelih nevronov.

Avtorji so nadalje ugotovili, da aktivacija FHL ali SFHL in vitro sama po sebi ne povzroči nastanka zrelih nevronov, in poskušali ugotoviti, ali so matične celice, predhodno oblikovane s FHL ali SFHL, sposobne diferenciacije v holinergične nevrone, ko so presadjene v osrednje živčevje odraslih podgan. V ta namen so bile aktivirane celice injicirane v nevrogeno cono (hipokampus) in v več nenevrogenih con, vključno s prefrontalnim korteksom, srednjo membrano in hrbtenjačo odraslih podgan. Vsajene celice so bile sledene z uporabo vektorja CAO-^^p. Znano je, da OCP označuje tako celično ultrastrukturo kot celične procese (molekularna raven) brez puščanja in jih je mogoče neposredno vizualizirati. Poleg tega z OCP označene nevronske matične celice ohranjajo profil nevronske in glialne diferenciacije, ki je enak profilu netransformiranih matičnih celic embrionalnih možganov.

En do dva tedna po implantaciji 5 x 10⁴ ^aktiviranih in označenih nevronskih matičnih celic so jih našli v hrbtenjači ali možganih podgan, pri čemer so se celice OCD+ nahajale predvsem v bližini mesta injiciranja. Procese migracije in integracije so opazili že en mesec po presaditvi. Meje migracije so se razlikovale glede na mesto injiciranja: pri injiciranju v prefrontalni korteks so se celice OCD+ nahajale 0,4–2 mm od mesta injiciranja, medtem ko so se v primeru implantacije v srednjo membrano, hipokampus ali hrbtenjačo celice preselile na veliko daljše razdalje – do 1–2 cm. Presajene celice so bile lokalizirane v visoko organiziranih strukturah centralnega živčnega sistema, vključno s frontalnim korteksom, srednjo membrano, hipokampusom in hrbtenjačo. Nevronski elementi, označeni z OCD, so bili vidni že v prvem tednu po presaditvi, njihovo število pa se je en mesec po operaciji znatno povečalo. Stereološka analiza je pokazala višjo stopnjo preživetja vsajenih celic v različnih strukturah možganov v primerjavi s hrbtenjačo.

Znano je, da je v večini tkiv odraslega sesalskega organizma ohranjena populacija regionalnih matičnih celic, katerih transformacijo v zrele celice uravnavajo specifični tkivni dejavniki. Proliferacija matičnih celic, diferenciacija progenitorskih celic in nastanek nevronskih fenotipov, specifičnih za dano možgansko strukturo in vivo, so v veliko večji meri izraženi v embrionalnih možganih, kar je določeno s prisotnostjo visokih koncentracij morfogenetskih dejavnikov lokalnega mikrookolja - nevrotrofinov BDNF, NGF, NT3, NT4/5 in rastnih faktorjev FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Kje se nahajajo živčne matične celice?

Ugotovljeno je bilo, da nevronske matične celice izražajo glialni kisli fibrilarni protein, ki se med zrelimi celicami nevronske linije zadržuje le na astrocitih. Zato so astrocitne celice lahko rezerva matičnih celic v zrelem CNS. Dejansko so bili nevroni, ki izvirajo iz GFAP-pozitivnih prekurzorjev, identificirani v vohalnih čebulicah in zobatem girusu, kar je v nasprotju s tradicionalnimi predstavami o progenitorni vlogi radialne glije, ki v odrasli dobi ne izraža GFAP v zobatem girusu. Možno je, da v CNS obstajata dve populaciji matičnih celic.

Vprašanje lokalizacije matičnih celic v subventrikularni coni ostaja tudi nejasno. Po mnenju nekaterih avtorjev ependimske celice v kulturi tvorijo sferične klone, ki niso prave nevrosfere (kot kloni subependimskih celic), saj so sposobne diferenciacije le v astrocite. Po drugi strani pa se po fluorescentnem ali virusnem označevanju ependimskih celic marker zazna v celicah subependimske plasti in vohalnih čebulic. Tako označene celice in vitro tvorijo nevrosfere in se diferencirajo v nevrone, astrocite in oligodendrocite. Poleg tega je bilo dokazano, da približno 5 % celic v ependimski celici izraža matične markerje - nestin, Notch-1 in Mussashi-1. Domneva se, da je mehanizem asimetrične mitoze povezan z neenakomerno porazdelitvijo membranskega receptorja Notch-1, zaradi česar slednji ostane na membrani hčerinske celice, lokalizirane v ependimski coni, medtem ko je matična celica, ki migrira v subependimsko plast, prikrajšana za ta receptor. S tega vidika lahko subependimalno cono obravnavamo kot zbiralnik progenitorskih predhodnikov nevronov in glije, ki nastanejo iz matičnih celic ependimske plasti. Po mnenju drugih avtorjev se v kaudalnih delih subventrikularne cone tvorijo le glialne celice, vir nevrogeneze pa so celice rostralno-lateralnega dela. V tretji varianti imata sprednji in zadnji del subventrikularne cone lateralnih prekatov enak nevrogeni potencial.

Četrta različica organizacije matične rezerve v centralnem živčnem sistemu se zdi boljša, po kateri v subventrikularni coni ločimo tri glavne vrste nevronskih progenitorskih celic - A, B in C. A-celice izražajo zgodnje nevronske markerje (PSA-NCAM, TuJl) in so obdane z B-celicami, ki jih po izražanju antigenov identificiramo kot astrocite. C-celice, ki nimajo antigenih značilnosti nevronov ali glije, imajo visoko proliferativno aktivnost. Avtor je prepričljivo dokazal, da so B-celice predhodnice A-celic in de novo nevronov vohalnih čebulic. Med migracijo so A-celice obdane s prameni nevronskih progenitorskih celic, kar se bistveno razlikuje od mehanizma migracije postmitotičnih nevroblastov vzdolž radialne glije v embrionalnih možganih. Migracija se konča v vohalnih čebulicah z mitotično delitvijo obeh celic, A in B, katerih derivati se vključijo v plasti granularnih celic in v glomerularno plast vohalne cone možganov.

Razvijajoči se embrionalni možgani nimajo diferenciranih ependimskih celic, ventrikularne stene pa vsebujejo proliferirajoče matične celice ventrikularne germinalne in subventrikularne cone, kamor migrirajo primarni nevro- in glioblasti. Na podlagi tega nekateri avtorji menijo, da subependimalna regija zrelih možganov vsebuje reducirano embrionalno germinalno nevronsko tkivo, ki ga sestavljajo astrociti, nevroblasti in neidentificirane celice. Prave nevronske matične celice predstavljajo manj kot 1 % celic v germinalni coni lateralne ventrikularne stene. Delno zaradi tega in tudi v povezavi s podatki, da so astrociti subependimalne cone predhodniki nevronskih matičnih celic, ni izključena možnost transdiferenciacije astrocitnih glialnih elementov s pridobitvijo nevronskih fenotipskih značilnosti.

Glavna ovira za končno rešitev problema lokalizacije živčnih matičnih celic in vivo je pomanjkanje specifičnih markerjev za te celice. Kljub temu so s praktičnega vidika zelo zanimiva poročila, da so bile živčne matične celice izolirane iz regij centralnega živčnega sistema, ki ne vsebujejo subependimalnih con - tretjega in četrtega prekata prednjega dela možganov, hrbtenjačnega kanala prsnega in ledvenega dela hrbtenjače. Posebej pomembno je dejstvo, da poškodba hrbtenjače poveča proliferacijo ependimalnih matičnih celic centralnega kanala z nastankom progenitornih celic, ki migrirajo in se diferencirajo v astrocite gliomezodermalne brazgotine. Poleg tega so bile v nepoškodovani hrbtenjači odraslih podgan najdene tudi prekurzorske celice astro- in oligodendrocitov.

Tako literarni podatki prepričljivo dokazujejo prisotnost regionalnega matičnega rezervata v CNS odraslih sesalcev, vključno z ljudmi, katerega regenerativno-plastična sposobnost je žal sposobna zagotoviti le procese fiziološke regeneracije z nastankom novih nevronskih mrež, vendar ne zadovoljuje potreb reparativne regeneracije. To postavlja nalogo iskanja možnosti za povečanje matičnih virov CNS z eksogenimi sredstvi, kar je nerešljivo brez jasnega razumevanja mehanizmov nastajanja CNS v embrionalnem obdobju.

Danes vemo, da so med embrionalnim razvojem matične celice nevralne cevi vir treh vrst celic - nevronov, astrocitov in oligodendrocitov, torej nevroni in nevroglija izvirajo iz ene same predhodne celice. Diferenciacija ektoderma v skupke nevronskih predhodnih celic se začne pod vplivom produktov pronevralnih genov družine bHLH in jo blokira izražanje derivatov receptorskih transmembranskih proteinov genov družine Notch, ki omejujejo določanje in zgodnjo diferenciacijo nevronskih predhodnih celic. Ligandi receptorjev Notch so transmembranski delta proteini sosednjih celic, zaradi katerih zunajcelične domene potekajo neposredni medcelični stiki z induktivno interakcijo med matičnimi celicami.

Nadaljnja izvedba programa embrionalne nevrogeneze ni nič manj zapletena in bi morala biti, kot kaže, vrstno specifična. Vendar pa rezultati študij nevroksenotransplantacije kažejo, da imajo matične celice izrazit evolucijski konzervativizem, zaradi katerega se človeške nevronske matične celice lahko selijo in razvijajo, ko so presadjene v možgane podgan.

Znano je, da ima sesalski centralni živčni sistem izjemno nizko sposobnost reparativne regeneracije, za katero je značilna odsotnost kakršnih koli znakov nastanka novih celičnih elementov v zrelih možganih, ki bi nadomestili nevrone, ki so umrli zaradi poškodbe. Vendar pa se v primeru presaditve nevroblastov slednji ne le primejo, proliferirajo in diferencirajo, temveč se lahko tudi integrirajo v možganske strukture in funkcionalno nadomestijo izgubljene nevrone. Pri presaditvi zavezanih nevronskih progenitorskih celic je bil terapevtski učinek bistveno šibkejši. Dokazano je, da imajo takšne celice nizko sposobnost migracije. Poleg tega nevronske progenitorske celice ne reproducirajo arhitekture nevronskih mrež in niso funkcionalno integrirane v možgane prejemnika. V zvezi s tem se aktivno preučujejo vprašanja reparativno-plastične regeneracije med presaditvijo nepredoblikovanih multipotentnih nevronskih matičnih celic.

V študiji M. Aleksandrove in sodelavcev (2001) so bili v prvi različici poskusov prejemniki spolno zrele podganje samice, darovalci pa 15 dni stari zarodki. Prejemnikom je bil odvzet del okcipitalne možganske skorje in v votlino je bilo presadjeno mehansko suspendirano tkivo domnevne embrionalne skorje, ki je vsebovalo multipotentne matične celice ventrikularne in subventrikularne regije. V drugi različici poskusov so bile v možgane spolno zrelih podgan presadjene nevronske matične celice 9-tedenskega človeškega zarodka. Avtorji so izolirali koščke tkiva iz periventrikularne regije embrionalnih možganov, jih namestili v hranilni medij F-12 in s ponavljajočim se pipetiranjem dobili celično suspenzijo, nato pa so jih gojili v posebnem mediju NPBM z dodatkom rastnih faktorjev - FGF, EGF in NGF. Celice so gojili v suspenzijski kulturi, dokler niso nastale nevrosfere, ki so bile dispergirane in ponovno posejane v kulturo. Po 4 pasažah s skupnim obdobjem gojenja 12-16 dni so bile celice uporabljene za presaditev. Prejemniki so bili deset dni stari podganji mladiči in spolno zrele dvomesečne podgane Wistar, ki so jim v lateralni ventrikel možganov brez imunosupresije injicirali 4 μl suspenzije človeških živčnih matičnih celic. Rezultati dela so pokazali, da so disociirane celice ventrikularne in subventrikularne cone embrionalnega zaplata možganske skorje podgan nadaljevale svoj razvoj med alotransplantacijo v zrele možgane, tj. dejavniki mikrookolja diferenciranih prejemnikovih možganov niso blokirali rasti in diferenciacije živčnih matičnih celic zarodka. V zgodnjih fazah po presaditvi so multipotentne celice nadaljevale mitotično delitev in aktivno migrirale iz presaditvenega območja v prejemnikovo možgansko tkivo. Presajene embrionalne celice z ogromnim migracijskim potencialom so bile najdene v skoraj vseh plasteh prejemnikove možganske skorje vzdolž presaditvene poti in v beli snovi. Dolžina migracijskega trakta živčnih celic je bila vedno bistveno krajša (do 680 μm) od dolžine glialnih elementov (do 3 mm). Krvne žile in vlaknaste strukture možganov so služile kot strukturni vektorji za migracijo astrocitov, kar so opazili tudi v drugih študijah.

Prej je veljalo prepričanje, da je kopičenje označenih astrocitov na območju poškodbe možganske skorje prejemnika lahko povezano z nastankom glialne pregrade med tkivoma presadka in prejemnika. Vendar pa je študija strukture kompaktno lociranih celičnih presadkov pokazala, da je za njihovo citoarhitekturo značilen kaos, brez plastovite porazdelitve presajenih celic. Stopnja urejenosti presajenih nevronov se je približala stopnji urejenosti normalnih celic možganske skorje le ob odsotnosti glialne pregrade med tkivoma darovalca in prejemnika. Sicer je bila struktura presajenih celic atipična, sami nevroni pa so bili podvrženi hipertrofiji. Z uporabo nevroimunokemičnega tipiziranja presajenih celic so v presadkih našli inhibitorne GABA-ergične nevrone in zaznali izražanje proteinov PARV, CALB in NPY. Posledično zreli možgani ohranijo mikrookolje, ki lahko podpirajo proliferacijo, migracijo in specifično diferenciacijo nevronskih multipotentnih celic.

V kulturi človeških matičnih celic, izoliranih iz periventrikularne regije možganov 9-tedenskih zarodkov, so M. Aleksandrova in sodelavci (2001) v četrtem prehodu odkrili veliko število nestin-pozitivnih multipotentnih celic, od katerih so nekatere že doživele in vitro diferenciacijo in so se razvijale po nevronskem tipu, kar je ustrezalo rezultatom študij drugih avtorjev. Po presaditvi v možgane odraslih podgan so se gojene človeške matične celice mitotično delile in migrirale v tkivo ksenogenih možganov prejemnika. Pri celičnih presaditvah so avtorji opazovali dve populaciji celic - majhne in večje. Slednje so migrirale tako v parenhimu kot vzdolž vlaknastih struktur možganov prejemnika na neznatnih razdaljah - znotraj 300 μm. Največji obseg migracijske poti (do 3 mm) je bil značilen za majhne celice, od katerih so se nekatere diferencirale v astrocite, kar je bilo ugotovljeno z uporabo monoklonskih protiteles proti GFAP. Obe vrsti celic sta bili najdeni v steni lateralnega prekata, kar kaže na to, da so presajene celice vstopile v rostralni migracijski trakt. Astrocitni derivati nevralnih matičnih celic tako pri ljudeh kot pri podganah so se pretežno preselili skozi krvne kapilare in vlaknaste strukture možganov prejemnika, kar sovpada s podatki drugih avtorjev.

Analiza diferenciacije človeških matičnih celic in vivo z uporabo monoklonskih protiteles proti GFAP, CALB in VIM je pokazala nastanek tako astrocitov kot nevronov. Za razliko od celic v presaditvah podgan so bile številne človeške matične celice vimentin-pozitivne. Posledično nekatere človeške multipotentne celice niso bile podvržene diferenciaciji. Isti avtorji so pozneje pokazali, da človeške nevronske matične celice, presajene brez imunosupresije, preživijo v možganih podgan 20 dni po presaditvi, brez znakov imunske agresije glialnih elementov zrelih možganov.

Ugotovljeno je bilo, da se celo nevronske matične celice Drosophile vsadijo in diferencirajo v možganih taksona, ki je od žuželk tako oddaljen, kot je podgana. Pravilnost avtorjevega poskusa je nedvomna: transgene linije Drosophile so vsebovale gene za človeške nevrotrofične faktorje NGF, GDNF, BDNF, vstavljene v vektor CaSper pod promotorjem toplotnega šoka Drosophile, tako da je telesna temperatura sesalcev samodejno sprožila njihovo izražanje. Avtorji so celice Drosophile identificirali po produktu bakterijskega gena galaktozidaze z uporabo histokemičnega barvanja X-Gal. Poleg tega se je izkazalo, da se nevronske matične celice Drosophile specifično odzivajo na nevrotrofične faktorje, ki jih kodirajo človeški geni: pri ksenotransplantaciji celic transgene linije Drosophile, ki vsebuje gen gdnf, se je sinteza tirozin hidroksilaze v njenih diferencirajočih se nevronskih celicah močno povečala, celice z genom ngf pa so aktivno proizvajale acetilholinesterazo. Ksenotransplantacija je povzročila podobne gensko odvisne reakcije v alotransplantaciji embrionalnega nevronskega tkiva, ki je bilo presajeno skupaj z njo.

Ali to pomeni, da specifično diferenciacijo živčnih matičnih celic povzročajo vrstno nespecifični nevrotrofični dejavniki? Glede na rezultate avtorjev so imeli ksenografti, ki proizvajajo nevrotrofične dejavnike, specifičen učinek na usodo alograftov, ki so se v tem primeru razvijali intenzivneje in so bili 2-3-krat večji od alograftov, vnesenih v možgane brez dodatka ksenograftov. Posledično imajo ksenograftne celice, ki vsebujejo gene za nevrotrofine, zlasti gen, ki kodira humani glialni celični nevrotrofični faktor (GDNF), vrstno nespecifičen učinek na razvoj alografta, podoben delovanju ustreznega nevrotrofina. Znano je, da GDNF poveča preživetje dopaminergičnih nevronov v srednjih možganih podganjega zarodka in izboljša presnovo dopamina v teh celicah ter sproži diferenciacijo celic, pozitivnih na tirozin hidroksilazo, kar poveča rast aksonov in poveča velikost telesa nevronskih celic. Podobne učinke opazimo tudi pri gojenih dopaminergičnih nevronih srednjih možganov podgan.

Aktivna migracija človeških živčnih matičnih celic je bila opažena po ksenotransplantaciji v možgane odraslih podgan. Znano je, da proces migracije in diferenciacije živčnih matičnih celic nadzira niz posebnih genov. Začetni migracijski signal predhodniški celici za začetek diferenciacije daje beljakovinski produkt protoonkogena c-ret skupaj z GDNF. Naslednji signal prihaja iz gena mash-1, ki nadzoruje izbiro poti razvoja celic. Poleg tega je specifična reakcija diferencirajočih se celic odvisna tudi od α-receptorja ciliarnega nevrotrofičnega faktorja. Glede na popolnoma različno genetsko konstitucijo ksenogenih človeških živčnih matičnih celic in možganskih celic prejemnih podgan je torej treba prepoznati ne le vrstno nespecifičnost nevrotrofičnih faktorjev, temveč tudi najvišjo evolucijsko konzervativnost genov, odgovornih za specifično diferenciacijo elementov živčnih matičnih celic.

Prihodnost bo pokazala, ali bo ksenotransplantacija embrionalnega nevromateriala mogoča v nevrokirurški praksi zdravljenja nevrodegenerativnih patoloških procesov, ki jih povzroča motnja sinteze mielina z oligodendrociti. Medtem so najbolj intenzivno obravnavana vprašanja nevrotransplantacije tista, povezana s pridobivanjem alogenskih nevronskih matičnih celic iz embrionalnih ali zrelih možganov v kulturi z njihovo poznejšo usmerjeno diferenciacijo v nevroblaste ali specializirane nevrone.

Presaditev živčnih matičnih celic

Za spodbujanje proliferacije in diferenciacije živčnih matičnih celic odraslega organizma se lahko presadi embrionalno živčno tkivo. Možno je, da se matične celice embrionalnega živčnega tkiva, ki so bile prinesene z alograftom, same podvržejo proliferaciji in diferenciaciji. Znano je, da po poškodbi hrbtenjače pride do regeneracije živčnih prevodnikov z raztezanjem poškodovanih aksonov in kolateralnim brstenjem aksonov nepoškodovanih odrastkov motoričnih nevronov. Glavni dejavniki, ki preprečujejo regeneracijo hrbtenjače, so nastanek vezivnotkivne brazgotine na območju poškodbe, distrofične in degenerativne spremembe centralnih nevronov, pomanjkanje NGF in prisotnost produktov razgradnje mielina na območju poškodbe. Dokazano je, da presaditev različnih vrst celic v poškodovano hrbtenjačo - fragmentov ishiadičnega živca odraslih živali, embrionalne okcipitalne skorje, hipokampusa, hrbtenjače, Schwannovih celic, astrocitov, mikroglije, makrofagov, fibroblastov - spodbuja regeneracijo poškodovanih aksonov z brstenjem in omogoča rast novo nastalih aksonov skozi območje poškodbe hrbtenjače. Eksperimentalno je bilo dokazano, da presaditev embrionalnega živčnega tkiva v območje poškodbe hrbtenjače z delovanjem nevrotrofičnih dejavnikov pospeši rast poškodovanih aksonov, prepreči nastanek glialne brazgotine in razvoj distrofičnih in degenerativnih procesov v centralnih nevronih, medtem ko celice presajenega embrionalnega živčnega tkiva preživijo v hrbtenjači, se integrirajo s sosednjimi tkivi in spodbujajo rast aksonov skozi območje poškodbe z nastankom dendritičnih sinaps na spinalnih nevronih.

To področje regenerativno-plastične medicine je v Ukrajini doživelo največji razvoj po zaslugi dela znanstvene ekipe pod vodstvom V. I. Tsymbalyuka. Najprej gre za eksperimentalne študije učinkovitosti presaditve embrionalnega živčnega tkiva pri poškodbah hrbtenjače. Med avtotransplantacijo perifernega živca so avtorji opazili najbolj izrazite destruktivne spremembe v distalnem šivalnem območju, kjer so jih 30. dan po operaciji združili z reparativnimi procesi. Med alotransplantacijo je bilo morfofunkcionalno stanje vsajenega živca 30. dan značilno po izrazitem uničenju z maščobno degeneracijo in amiloidozo na ozadju fokalne vnetne infiltracije limfoidnih celic s pretežno atrofijo Schwannovih celic. Presaditev embrionalnega živčnega tkiva je v večji meri prispevala k obnovi prevodnosti hrbtenjače, zlasti pri živalih, ki so bile operirane v prvih 24 urah po poškodbi: ob ozadju zmanjšanja intenzivnosti vnetnih in destruktivnih procesov, hipertrofije in hiperplazije ultrastrukturnih elementov spinalnih nevronov, ki sintetizirajo beljakovine in proizvajajo energijo, so opazili hipertrofijo in hiperplazijo oligodendrocitov, amplituda mišičnega akcijskega potenciala se je obnovila za 50 %, hitrost prevajanja impulzov pa za 90 %. Pri ocenjevanju učinkovitosti presaditve embrionalnega živčnega tkiva glede na območje presaditve je bilo ugotovljeno, da so bili najboljši rezultati opaženi, ko je bil presadek vnesen neposredno v območje poškodbe hrbtenjače. Pri popolni transekciji hrbtenjače je bila presaditev embrionalnega živčnega tkiva neučinkovita. Dinamične študije so pokazale, da je optimalen čas za presaditev embrionalnega živčnega tkiva prvih 24 ur po poškodbi hrbtenjače, medtem ko je treba izvajanje operacije v obdobju izrazitih sekundarnih ishemično-vnetnih sprememb, ki se pojavijo 2. do 9. dan po poškodbi, šteti za neprimerno.

Znano je, da huda travmatska poškodba možganov izzove močno in dolgotrajno aktivacijo lipidne peroksidacije v začetnih in vmesnih fazah posttravmatskega obdobja tako v poškodovanem možganskem tkivu kot v telesu kot celoti, prav tako pa moti procese energijske presnove v poškodovanih možganih. V teh pogojih presaditev embrionalnega živčnega tkiva na območje travmatske poškodbe spodbuja stabilizacijo procesov lipidne peroksidacije in povečuje potencial antioksidativnega sistema možganov in telesa kot celote, krepi njegovo antiradikalno zaščito 35-60. dan posttravmatskega obdobja. V istem obdobju po presaditvi embrionalnega živčnega tkiva se normalizirata energijska presnova in procesi oksidativne fosforilacije v možganih. Poleg tega je bilo dokazano, da se prvi dan po eksperimentalni travmatski poškodbi možganov impedanca tkiva poškodovane hemisfere zmanjša za 30-37%, kontralateralne pa za 20%, kar kaže na razvoj generaliziranega možganskega edema. Pri živalih, ki so jim presadili embrionalno živčno tkivo, se je involucija edema pojavila bistveno hitreje - že sedmi dan je povprečna vrednost impedance tkiv poškodovane hemisfere dosegla 97,8 % kontrolne ravni. Poleg tega je bila popolna obnova vrednosti impedance 30. dan opažena le pri živalih, ki so jim presadili embrionalno živčno tkivo.

Smrt nekaterih nevronov v možganih po hudi kraniocerebralni poškodbi je eden glavnih vzrokov za posttravmatske zaplete. Nevroni integrirajočega dopaminergičnega in noradrenergičnega sistema srednjih možganov in podolgovate hrbtenjače so še posebej občutljivi na poškodbe. Znižanje ravni dopamina v striopalidalnem kompleksu in možganski skorji znatno poveča tveganje za razvoj motoričnih in duševnih motenj, epileptiformnih stanj, zmanjšanje proizvodnje dopamina v hipotalamusu pa je lahko vzrok za številne vegetativne in somatske motnje, opažene v poznem posttravmatskem obdobju. Rezultati študij, opravljenih pri eksperimentalnih kraniocerebralnih poškodbah, kažejo, da presaditev embrionalnega živčnega tkiva pomaga obnoviti raven dopamina v poškodovani možganski hemisferi, dopamina in noradrenalina v hipotalamusu ter povečati raven noradrenalina in dopamina v srednjih možganih in podolgovati hrbtenjači. Poleg tega se zaradi presaditve embrionalnega živčnega tkiva v poškodovano hemisfero možganov poskusnih živali normalizira odstotno razmerje fosfolipidov in poveča vsebnost maščobnih kislin (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Ti podatki potrjujejo stimulacijo regenerativno-plastičnih procesov s presajenim embrionalnim živčnim tkivom in kažejo na reparativno-trofični učinek presadka na možgane prejemnika kot celoto.

Posebno pozornost si zaslužijo klinične izkušnje osebja Inštituta za nevrokirurgijo A. P. Romodanova Akademije medicinskih znanosti Ukrajine pri presaditvi embrionalnega živčnega tkiva pri cerebralni paralizi, izjemno kompleksni patologiji s hudo motorično disfunkcijo. Klinične oblike cerebralne paralize so odvisne od stopnje poškodbe integralnih struktur, odgovornih za uravnavanje mišičnega tonusa in oblikovanje motoričnih stereotipov. Trenutno obstaja dovolj dokazov, ki podpirajo dejstvo, da imajo patološke spremembe v striopalidalno-talamokortikalnem sistemu motoričnega nadzora pomembno vlogo pri motnjah motorične funkcije in mišičnega tonusa. Striopalidalna povezava tega sistema izvaja kontrolno funkcijo preko nigrostriatalne proizvodnje dopamina. Neposredna pot za izvajanje talamokortikalnega nadzora se začne iz nevronov putamena, posreduje jo gama-aminomaslena kislina (GABA) in snov P ter se projicira neposredno v motorično cono notranjega segmenta globus pallidusa in substantia nigra. Posredna pot, katere učinek se realizira s sodelovanjem GABA in enkefalina, izvira iz nevronov putamena in vpliva na jedra bazalnih ganglijev preko zaporedja povezav, vključno z zunanjim segmentom globus pallidus in subtalamičnim jedrom. Motnje v prevodnosti direktne poti povzročajo hipokinezijo, medtem ko zmanjšanje prevodnosti struktur posredne poti vodi v hiperkinezijo z ustreznimi spremembami mišičnega tonusa. Celovitost GABAergičnih prevodnih poti na različnih ravneh v sistemu motoričnega nadzora in integracija dopaminergičnih povezav na ravni putamena sta bistveni za regulacijo talamokortikalnih interakcij. Najpogostejša manifestacija motorične patologije pri različnih oblikah cerebralne paralize je kršitev mišičnega tonusa in tesno povezana sprememba refleksne mišične aktivnosti.

Presaditev embrionalnega živčnega tkiva pri cerebralni paralizi zahteva temeljito analizo narave poškodbe možganskih struktur. Avtorji so na podlagi določitve ravni dopamina in GABA v subarahnoidni cerebrospinalni tekočini podrobno opredelili stopnjo motene integracije funkcionalnih možganskih struktur, kar je omogočilo objektivizacijo rezultatov kirurškega posega in korekcijo ponavljajočih se nevrotransplantacij. Embrionalno živčno tkivo (material splava 9-tedenskega zarodka) je bilo presajeno v parenhim skorje precentralnih zvitkov možganskih hemisfer, odvisno od resnosti atrofičnih sprememb. V pooperativnem obdobju niso opazili zapletov ali poslabšanja stanja bolnikov. Pozitivna dinamika je bila opažena pri 63 % bolnikov s spastičnimi oblikami, pri 82 % otrok z atonično-estetsko obliko in le pri 24 % bolnikov z mešano obliko bolezni. Ugotovljen je bil negativen vpliv visoke stopnje nevrosenzibilizacije s prisotnostjo avtoprotiteles proti nevrospecifičnim beljakovinam na rezultate operacije. Presaditev embrionalnega živčnega tkiva se je izkazala za neučinkovito pri bolnikih, starih 8-10 let in več, pa tudi v primerih hudega hiperkinetičnega sindroma in epilepsije. Klinično se je učinkovitost presaditve embrionalnega živčnega tkiva pri bolnikih s spastičnimi oblikami cerebralne paralize pokazala v oblikovanju novih statomotoričnih sposobnosti in hotnih gibov s korekcijo patološkega motoričnega stereotipa ter zmanjšanjem stopnje spastičnosti, patoloških drž in odnosov. Avtorji menijo, da je pozitiven učinek presaditve embrionalnega živčnega tkiva posledica normalizacijskega učinka na funkcionalno aktivnost supraspinalnih struktur, ki sodelujejo pri uravnavanju posturalnega tonusa in hotnih gibov. Hkrati pozitivne klinične učinke presaditve embrionalnega živčnega tkiva spremlja zmanjšanje vsebnosti nevrotransmiterjev v subarahnoidni cerebrospinalni tekočini, kar kaže na obnovo integralnih interakcij prizadetih možganskih struktur.

Obstaja še ena huda oblika nevrološke patologije - apalični sindrom, katerega problem zdravljenja žal še zdaleč ni rešen. Apalični sindrom je polietiološko subakutno ali kronično stanje, ki se pojavi kot posledica hudih organskih lezij centralnega živčnega sistema (predvsem možganske skorje) in je značilen po razvoju panapraksije in panagnozije z relativno ohranjeno funkcijo segmentno-debelnih odsekov in formacij limbično-retikularnega kompleksa možganov. Nadaljnje študije (od 1 leta do 3 let) so pokazale, da apalični sindrom ni dokončna diagnoza trajne poškodbe živčnega sistema pri otrocih, temveč se transformira bodisi v organsko demenco bodisi v kronično vegetativno stanje. Na oddelku za restavrativno nevrokirurgijo Inštituta za nevrokirurgijo A. P. Romodanova Akademije medicinskih znanosti Ukrajine je bilo 21 bolnikov s posledicami apaličnega sindroma podvrženih presaditvi embrionalnega živčnega tkiva. V splošni anesteziji so s kronskim svedrom naredili luknjo za sveder na območju najbolj izrazitih atrofičnih sprememb, ki so jih odkrili z računalniško tomografijo ali magnetno resonanco, in v prisotnosti difuzne atrofije sive ali bele snovi so presadek vnesli v precentralni in centralni girus možganov. Po odprtju dure mater so s posebno napravo intrakortično vsadili koščke tkiva iz senzomotorične skorje 8-9 tednov starih zarodkov. Število vsajenih vzorcev tkiva se je gibalo od 4 do 10, kar je bilo določeno z velikostjo luknje za sveder in velikostjo lokalnih sprememb v možganski snovi. Za razliko od drugih vrst patologije so si avtorji pri apaličnem sindromu prizadevali vsaditi čim več embrionalnega tkiva v najbolj dostopna področja možganov. Dura mater je bila zašita in izvedena je bila plastična operacija defekta lobanje. Med operacijo so vsi bolniki pokazali pomembne spremembe tako v skorji (atrofija, odsotnost zvitkov, sprememba barve in pulzacije možganske snovi) kot v možganskih ovojnicah (odebelitev dure mater, znatno odebelitev arahnoidne membrane s prisotnostjo lastnih krvnih žil, zlitje membran s spodaj ležečo možgansko snovjo). Te spremembe so bile bolj izrazite pri bolnikih z anamnezo vnetnih možganskih lezij. Pri bolnikih, ki so bili podvrženi hipoksiji osrednjega živčevja, so prevladovale difuzne atrofične spremembe možganske snovi, zlasti v skorji, s povečanjem subarahnoidnega prostora, brez pomembnih sprememb v možganskih ovojnicah. Polovica bolnikov je imela povečano krvavitev mehkih tkiv, kosti in možganske snovi. Po operacijah se je stanje v šestih mesecih do treh letih izboljšalo pri 16 bolnikih, pri petih pa je ostalo nespremenjeno. Pozitivno dinamiko so opazili tako v motorični kot v duševni sferi. Mišični tonus se je zmanjšal pri desetih bolnikih, pri 11 bolnikih se je povečala motorična aktivnost (zmanjšala se je pareza,(izboljšana koordinacija gibov), pri petih otrocih se je manipulativna sposobnost zgornjih okončin znatno povečala. Pri štirih bolnikih se je zmanjšala pogostost in resnost epileptičnih napadov, pri enem otroku pa v celotnem opazovalnem obdobju po operaciji sploh ni bilo napadov. Agresija se je zmanjšala pri dveh otrocih, pri dveh bolnikih s hudimi bulbarnimi motnjami se je izboljšalo požiranje, dva otroka sta bila sposobna samostojno žvečiti že 2 tedna po operaciji. Opazili so zmanjšanje resnosti duševnih motenj, devet otrok se je po operaciji umirilo, spanec in pozornost sta se izboljšala pri sedmih bolnikih. Trije bolniki s posledicami apaličnega sindroma so začeli prepoznavati starše, eden - slediti navodilom, dva - izgovarjati besede, pri treh pa se je stopnja dizartrije zmanjšala. Avtorji ugotavljajo, da se opazno izboljšanje stanja bolnikov začne 2 meseca po operaciji, doseže maksimum do 5-6 mesecev, nato se stopnja izboljšanja upočasni in do konca leta se proces stabilizira pri 50 % bolnikov. Pozitiven učinek nevrotransplantacije je bil osnova za ponovno operacijo pri šestih bolnikih s posledicami apalnega sindroma, vendar na drugi možganski hemisferi. Tehnika in metode druge presaditve so bile enake kot pri prvi operaciji, vendar je bil klinični učinek druge operacije manjši, čeprav po prvem ali drugem kirurškem posegu ni prišlo do resnejših zapletov. Po mnenju avtorjev je mehanizem terapevtskega učinka nevrotransplantacije povezan z nevrotrofičnim učinkom presajenega embrionalnega živčnega tkiva, ki vsebuje veliko število rastnih, hormonskih in drugih biološko aktivnih snovi, ki spodbujajo reparacijo poškodovanih nevronov in plastično reorganizacijo možganskega tkiva prejemnika. Možen je tudi aktivacijski učinek na aktivnost živčnih celic, ki so bile prej morfološko ohranjene, a so zaradi bolezni izgubile svojo funkcionalno aktivnost. Prav hiter nevrotrofični učinek lahko pojasni izboljšanje bulbarnih funkcij pri nekaterih otrocih že konec prvega ali drugega tedna po operaciji. Predvideva se, da se poleg tega do tretjega ali četrtega meseca vzpostavijo morfofunkcionalne povezave med presadkom in možgani gostitelja, prek katerih nevrotransplantat nadomesti funkcije odmrlih možganskih celic, kar je substrat za izboljšanje tako motoričnih kot duševnih funkcij bolnikov. Dva otroka sta bila sposobna samostojno žvečiti že 2 tedna po operaciji. Opazili so zmanjšanje resnosti duševnih motenj, devet otrok se je po operaciji umirilo, spanec in pozornost sta se izboljšala pri sedmih bolnikih. Trije bolniki s posledicami apaličnega sindroma so začeli prepoznavati starše, eden - slediti navodilom, dva - izgovarjati besede.Pri treh se je stopnja dizartrije zmanjšala. Avtorji ugotavljajo, da se opazno izboljšanje stanja bolnikov začne 2 meseca po operaciji, doseže maksimum do 5-6 mesecev, nato se stopnja izboljšanja upočasni in do konca leta se proces stabilizira pri 50 % bolnikov. Pozitiven učinek nevrotransplantacije je bil osnova za ponovno operacijo pri šestih bolnikih s posledicami apalnega sindroma, vendar na drugi možganski hemisferi. Tehnika in metoda druge presaditve sta bili enaki kot pri prvi operaciji, vendar je bil klinični učinek druge operacije manjši, čeprav po prvem ali drugem kirurškem posegu ni bilo resnih zapletov. Po mnenju avtorjev je mehanizem terapevtskega učinka nevrotransplantacije povezan z nevrotrofičnim učinkom presajenega embrionalnega živčnega tkiva, ki vsebuje veliko število rastnih, hormonskih in drugih biološko aktivnih snovi, ki spodbujajo reparacijo poškodovanih nevronov in plastično reorganizacijo možganskega tkiva prejemnika. Možen je tudi aktivacijski učinek na aktivnost živčnih celic, ki so bile prej morfološko ohranjene, a so zaradi bolezni izgubile svojo funkcionalno aktivnost. Prav hiter nevrotrofični učinek lahko pojasni izboljšanje bulbarnih funkcij pri nekaterih otrocih že konec prvega ali drugega tedna po operaciji. Domneva se, da se ob tem do tretjega ali četrtega meseca vzpostavijo morfofunkcionalne povezave med presadkom in možgani gostitelja, prek katerih nevrotransplantat nadomesti funkcije odmrlih možganskih celic, kar je substrat za izboljšanje tako motoričnih kot duševnih funkcij bolnikov. Dva otroka sta bila sposobna samostojno žvečiti že 2 tedna po operaciji. Opazili so zmanjšanje resnosti duševnih motenj, devet otrok se je po operaciji umirilo, spanec in pozornost sta se izboljšala pri sedmih bolnikih. Trije bolniki s posledicami apaličnega sindroma so začeli prepoznavati starše, eden - slediti navodilom, dva - izgovarjati besede, pri treh se je stopnja dizartrije zmanjšala. Avtorji ugotavljajo, da se opazno izboljšanje stanja bolnikov začne 2 meseca po operaciji, doseže maksimum do 5-6 mesecev, nato se stopnja izboljšanja upočasni in do konca leta se proces stabilizira pri 50 % bolnikov. Pozitiven učinek nevrotransplantacije je bil podlaga za ponovno operacijo pri šestih bolnikih s posledicami apalnega sindroma, vendar na drugi možganski hemisferi. Tehnika in metoda druge presaditve sta bili enaki kot pri prvi operaciji, vendar je bil klinični učinek druge operacije manjši, čeprav po prvem ali drugem kirurškem posegu ni bilo resnih zapletov. Po mnenju avtorjev,Mehanizem terapevtskega učinka nevrotransplantacije je povezan z nevrotrofičnim učinkom presajenega embrionalnega živčnega tkiva, ki vsebuje veliko število rastnih, hormonskih in drugih biološko aktivnih snovi, ki spodbujajo obnovo poškodovanih nevronov in plastično reorganizacijo možganskega tkiva prejemnika. Možen je tudi aktivacijski učinek na aktivnost živčnih celic, ki so bile prej morfološko ohranjene, a so zaradi bolezni izgubile svojo funkcionalno aktivnost. Prav hiter nevrotrofični učinek lahko pojasni izboljšanje bulbarnih funkcij pri nekaterih otrocih že konec prvega ali drugega tedna po operaciji. Domneva se, da se ob tem do tretjega ali četrtega meseca vzpostavijo morfofunkcionalne povezave med presadkom in možgani gostitelja, prek katerih nevrotransplantat nadomesti funkcije odmrlih možganskih celic, kar je substrat za izboljšanje tako motoričnih kot duševnih funkcij bolnikov, čeprav po prvem ali drugem kirurškem posegu ni prišlo do resnejših zapletov. Po mnenju avtorjev je mehanizem terapevtskega učinka nevrotransplantacije povezan z nevrotrofičnim učinkom presajenega embrionalnega živčnega tkiva, ki vsebuje veliko število rastnih, hormonskih in drugih biološko aktivnih snovi, ki spodbujajo obnovo poškodovanih nevronov in plastično reorganizacijo možganskega tkiva prejemnika. Možen je tudi aktivacijski učinek na aktivnost živčnih celic, ki so bile prej morfološko ohranjene, a so zaradi bolezni izgubile svojo funkcionalno aktivnost. Prav hiter nevrotrofični učinek lahko pojasni izboljšanje bulbarnih funkcij pri nekaterih otrocih že konec prvega ali drugega tedna po operaciji. Domneva se, da se ob tem do tretjega ali četrtega meseca vzpostavijo morfofunkcionalne povezave med presadkom in možgani gostitelja, prek katerih nevrotransplantat nadomesti funkcije odmrlih možganskih celic, kar je substrat za izboljšanje tako motoričnih kot duševnih funkcij bolnikov, čeprav po prvem ali drugem kirurškem posegu ni prišlo do resnejših zapletov. Po mnenju avtorjev je mehanizem terapevtskega učinka nevrotransplantacije povezan z nevrotrofičnim učinkom presajenega embrionalnega živčnega tkiva, ki vsebuje veliko število rastnih, hormonskih in drugih biološko aktivnih snovi, ki spodbujajo reparacijo poškodovanih nevronov in plastično reorganizacijo možganskega tkiva prejemnika. Možen je tudi aktivacijski učinek na aktivnost živčnih celic, ki so bile prej morfološko ohranjene, a so zaradi bolezni izgubile svojo funkcionalno aktivnost.Prav hiter nevrotrofični učinek lahko pojasni izboljšanje bulbarnih funkcij pri nekaterih otrocih že konec prvega ali drugega tedna po operaciji. Domneva se, da se ob tem do tretjega ali četrtega meseca vzpostavijo morfofunkcionalne povezave med presadkom in možgani gostitelja, s pomočjo katerih nevrotransplantat nadomesti funkcije odmrlih možganskih celic, kar je substrat za izboljšanje tako motoričnih kot duševnih funkcij bolnikov.

Eksperimentalno so proučevali vpliv presaditve embrionalnega živčnega tkiva na reorganizacijo mednevronskih povezav. Avtorji so preučevali vzorce obnove medmodularnih aksonskih povezav na območju mehanske poškodbe možganske skorje pri belih podganah z in brez presaditve embrionalnega živčnega tkiva z uporabo fluorescentne lipofilne oznake DIL (1,1-dioktadecil-3,3,33'-tetrametilindokarbocianin perklorat) in konfokalnega laserskega skeniranja. Ugotovljeno je bilo, da vnos embrionalnega živčnega tkiva v območje poškodbe zagotavlja rast aksonov, ki se po prehodu skozi presadek povežejo s sosednjim možganskim tkivom, medtem ko je brez presaditve embrionalnega živčnega tkiva poškodovano območje nepremostljiva ovira za rast aksonov. V tem delu je bila izvedena presaditev embrionalnega (15.–17. dan brejosti) neokorteksa. Rezultati, ki so jih pridobili avtorji, so nadaljnji dokaz v prid aktivnemu vplivu presaditve embrionalnega živčnega tkiva na posttravmatsko reorganizacijo mednevronskih odnosov sosednjih strukturnih in funkcionalnih modulov možganske skorje. Presaditev embrionalnega živčnega tkiva omogoča delno obnovo povezav med poškodovanimi območji možganske skorje z ustvarjanjem ugodnih pogojev za rast aksonov v območju delovanja nevrotrofičnih faktorjev presadka. Obstoj takšnega učinka je bil eksperimentalno dokazan in se v literaturi obravnava kot dokaz visokih plastičnih sposobnosti poškodovanih možganov spolno zrelih živali. V zvezi s tem se presaditev celic trenutno šteje za optimalno terapevtsko strategijo za obnovitev delovanja poškodovanega človeškega osrednjega živčnega sistema.

Podatki, ki so jih avtorji pridobili o učinkovitosti uporabe embrionalnega živčnega tkiva možganov kot eksogenega presaditvenega medija za rast aksonov, potrjujejo možnosti ciljnega ustvarjanja komunikacijskih povezav med nepoškodovanimi sosednjimi področji možganov. Delo na preučevanju vpliva presaditve živčnega tkiva na dinamiko funkcionalnih parametrov centralnega živčnega sistema se zdi relevantno. Naloga dela je bila raziskati vpliv presaditve embrionalnega locus coeruleus (LC) na morfofunkcionalne indekse nevronov LC in lokomotorno aktivnost prejemnikov. Prejemniki so bili samice podgan Wistar, darovalci pa 18 dni stari zarodki podgan iste linije. Presaditev embrionalnega LC je bila izvedena v votlino tretjega možganskega prekata. Histološko je bila presaditev presadka ugotovljena pri 75 % prejemnikov. V primerih presaditve je bil presadek ob steni prekata, zapolnjeval je 1/5-2/5 njegovega lumna in je bil sposoben preživetja. 1 in 6 mesecev po operaciji je presajeno živčno tkivo glede na svoje morfološke značilnosti predstavljalo strukture, ki bi nastale med njihovim normalnim ontogenetskim razvojem, tj. strukture LC. Podatki, ki so jih pridobili avtorji, kažejo, da se pri živalih, ki so jim presadili embrionalni založnik LC, spremeni dinamična aktivnost in poveča matrična aktivnost kromatina jeder celic LC. Posledično se aktivnost nevronov lastnih LC okrepi, vendar je tudi presadjeni presadek funkcionalno aktiven. Znano je, da tako imenovana lokomotorna regija srednjih možganov praktično sovpada z lokalizacijo LC. Avtorji menijo, da je osnova za spremembo motorične aktivnosti prejemniških podgan aktivacija celic LC, tako lastnih kot presaditvenih, s sproščanjem velike količine noradrenalina, tudi v segmentih hrbtenjače. Zato se domneva, da je povečanje motorične aktivnosti v pogojih presaditve LC v nepoškodovane možgane živali posledica prisotnosti funkcionalno aktivnega presadka, ki je integriran z možgani prejemnika in prispeva k aktivaciji lokomotorne aktivnosti pri podganah.

Poleg tega je bilo dokazano, da presajene nevroepitelijske celice embrionalnih rudimentov neokorteksa in hrbtenjače preživijo in se diferencirajo v nevroblaste, mlade in zrele nevrone v 1-2 mesecih po presaditvi v poškodovani išiasni živec odraslih podgan. Pri preučevanju dinamike razvoja NADPH-pozitivnih nevronov embrionalnih rudimentov neokorteksa in hrbtenjače podgan v heterotopičnih alograftih (15-dnevni podganji zarodek) je bilo na vzdolžnih prerezih skozi išiasne živce prejemnih podgan ugotovljeno presaditev 70 do 80 % nevrograftov, kar je bilo odvisno od obdobja opazovanja. V presadkih so se en teden po operaciji začeli tvoriti uni- in bipolarni nevroblasti z zaobljenimi svetlimi jedri in enim ali dvema nukleoloma, kar je spremljalo nastanek grozdov. Avtorjem med nevroblasti ni uspelo zaznati celic, ki bi vsebovale NADPH diaforazo (NADPH-d). Po 7 dneh so bili NADPH-pozitivni le celični elementi krvnih žil - kapilarne endotelijske celice v debelini presadka, pa tudi endotelijske in gladkomišične celice žil ishiadičnega živca prejemnika. Ker v celicah gladkih mišic žil indukcija NO sintaze (NOS) poteka pod vplivom IL-1, avtorji povezujejo pojav NADPH-pozitivnih gladkomišičnih celic v krvnih žilah ishiadičnega živca s prisotnostjo IL-1, sintetiziranega v poškodovanih živčnih deblih. Znano je, da nevrogeneza v pogojih presaditve embrionalnih možganskih začetkov poteka sočasno z razvojem nevronov in situ. Rezultati morfoloških študij kažejo, da diferenciacija nekaterih nevronskih elementov presadkov sedem dni po presaditvi ustreza diferenciaciji celic v podobnih delih možganov novorojenih podgan. Tako v pogojih heterotopične presaditve v periferni živec presajene embrionalne živčne celice kažejo sposobnost sinteze NADPH-d. V tem primeru je v presadkih hrbtenjače več nevronov, ki vsebujejo NADPH-d, kot v presadkih neokorteksa, vendar se sinteza dušikovega oksida v presajenih nevronih začne pozneje kot med razvojem in situ. V centralnem živčnem sistemu vretenčarjev se NOS-pozitivne celice pojavijo že v prenatalnem obdobju. Domneva se, da NO spodbuja nastanek sinaptičnih povezav v razvijajočih se možganih, prisotnost NOS-pozitivnih živčnih aferentnih vlaken, ki zagotavljajo sintezo NO v cerebelarnih nevroblastih, pa spodbuja migracijo in diferenciacijo nevronov, zaradi česar se oblikuje normalna možganska citoarhitektura. V tektumu je bila ugotovljena pomembna vloga NO pri sinapsogenezi - NOS-pozitivni so bili le tisti nevroni, ki so imeli sinaptične povezave s celicami mrežnice.

Znano je, da je dušikov oksid eden od regulatorjev možganske aktivnosti, kjer se tvori iz arginina pod vplivom NO sintaze, ki ima diaforazno aktivnost. V centralnem živčnem sistemu se NO sintetizira v endotelijskih celicah krvnih žil, mikrogliji, astrocitih in nevronih različnih delov možganov. Po travmatski poškodbi možganov, pa tudi med hipoksijo in ishemijo, opazimo povečanje števila nevronov, ki vsebujejo NO, ki je eden od regulatorjev možganskega pretoka krvi. Glede na sposobnost NO, da inducira sinapsogenezo, je še posebej zanimiva preučevanje nastajanja celic, ki vsebujejo NO, v pogojih nevrotransplantacije na ozadju travmatske poškodbe živčnega tkiva prejemnika.

Nič manj pomembna ni študija vpliva nevrotransplantacije na pogojno refleksni stereotip vedenja. V poskusih o preučevanju vpliva intracerebralne in oddaljene (med CII in CIII) presaditve tkiva embrionalnega locus coeruleus (17-19 dni brejosti) na spominske procese in vsebnost kateholaminov pri podganah z uničenjem frontotemporalnega neokorteksa je bilo dokazano, da elektrolitska poškodba frontotemporalne možganske skorje moti stereotip pogojno refleksne čustvene reakcije izogibanja (spomin), oslabi fiziološko aktivnost, zmanjša vsebnost noradrenalina v coni koaguliranega neokorteksa, vendar poveča njegovo raven v hipotalamusu, kjer opazimo zmanjšanje koncentracije adrenalina, čeprav se njegova količina v krvi in nadledvičnih žlezah poveča.

Zaradi intracerebralne presaditve tkiva embrionalnega locus coeruleus se pri 81,4 % živali obnovi stereotip pogojnega refleksnega čustvenega izogibanja, ki ga moti elektrolitska poškodba frontotemporalnih predelov možganske skorje, normalizira se vsebnost adrenalina v retikularni formaciji srednjega mozga, hipotalamusa in neokorteksa, njegova raven v hipokampusu pa se celo poveča, kar je povezano z zmanjšanjem koncentracije adrenalina v krvi.

Oddaljena presaditev tkiva embrionalnega locus coeruleus ne le obnovi moten stereotip pogojenega refleksa čustvene izogibalne reakcije pri podganah z elektrolitično poškodbo frontotemporalne skorje, temveč tudi poveča vsebnost noradrenalina in adrenalina, predvsem v hipotalamusu, krvi, nadledvičnih žlezah in srcu. Domneva se, da je to posledica vaskularizacije presadka, prodiranja nevrotransmiterjev v krvni obtok, njihovega prehoda skozi krvno-možgansko pregrado in aktivacije mehanizmov ponovnega privzema adrenalina in noradrenalina po tipih privzema 1, 2, 3. Avtorji menijo, da lahko dolgoročno stabilizacijo ravni noradrenalina v pogojih prijema in delovanja presadka obravnavamo kot pojav njegovega postopnega sproščanja v minimalnih odmerkih s strani nevronov locus coeruleus.

Pozitivni klinični učinki presaditve embrionalnega živčnega tkiva so lahko posledica tudi sposobnosti slednjega, da vpliva na procese žilne neoplazme, pri regulaciji katerih neposredno sodelujejo rastni faktorji in citokini. Vaskulogenezo aktivirajo angiogeni rastni faktorji - vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF), FGF, PDGF in TGF, ki se sintetizirajo med ishemijo, kar deluje kot začetni moment angiogeneze. Dokazano je, da se izčrpavanje potenciala rasti žil pojavi med procesom staranja telesa, kar igra pomembno vlogo pri patogenezi bolezni, kot sta koronarna srčna bolezen in obliterirajoča ateroskleroza spodnjih okončin. Ishemija tkiva se razvije tudi pri mnogih drugih boleznih. Vnos angiogenih faktorjev v ishemična območja (terapevtska angiogeneza) spodbuja rast krvnih žil v ishemičnih tkivih in izboljša mikrocirkulacijo zaradi razvoja kolateralnega krvnega obtoka, kar posledično poveča funkcionalno aktivnost prizadetega organa.

VEGF in FGF veljata za najbolj obetavna za klinično uporabo. Rezultati prvih randomiziranih študij so bili spodbudni, še posebej, če so bili optimalni odmerki in načini dajanja angiogenih faktorjev pravilno izbrani. V zvezi s tem je bila izvedena eksperimentalna ocena angiogene aktivnosti ekstrakta, izoliranega iz človeškega embrionalnega možganskega tkiva. V delu je bil uporabljen splavljen material, pridobljen v dvajsetem tednu nosečnosti in obdelan po metodi I. Macioga in sodelavcev (1979), kot jo je spremenil IC ANRF. To zdravilo je analog "dodatka za rast endotelijskih celic" ("Sigma") in je naravna mešanica človeških angiogenih faktorjev, ki vključuje VEGF in FGF. Poskusi so bili izvedeni na podganah z modeli ishemije zadnjega uda in miokardnega tkiva. Na podlagi študije aktivnosti alkalne fosfataze pri poskusnih živalih, ki so jim dajali ekstrakt embrionalnega živčnega tkiva, so ugotovili povečanje števila kapilar na enoto površine miokarda - tako v vzdolžnih kot prečnih prerezih srca. Angiogena aktivnost pripravka se je pokazala tako pri neposrednem dajanju v ishemično območje kot tudi pri sistemskem (intramuskularnem) dajanju, kar je povzročilo zmanjšanje povprečne površine postinfarktne brazgotine.

Pri kateri koli različici presaditve embrionalnega živčnega tkiva je izjemno pomembno pravilno izbrati gestacijsko starost presajenega embrionalnega materiala. Primerjalna analiza učinkovitosti celičnih pripravkov iz embrionalnega ventralnega mezencefalona 8-, 14- in 16-17 dnevnih podganjih zarodkov tri mesece po intrastriatalni nevrotransplantaciji zrelim podganam s parkinsonizmom v avtomatiziranem testu motorične asimetrije, povzročene z apomorfinom, je pokazala bistveno večjo učinkovitost pripravkov celic CNS iz 8-dnevnih zarodkov in najnižjo učinkovitost iz 16-17 dnevnih embrionalnih živčnih tkiv. Pridobljeni podatki so se ujemali z rezultati histomorfološke analize, zlasti z velikostjo presadkov, resnostjo glialne reakcije in številom dopaminergičnih nevronov v njih.

Razlike v terapevtskem učinku celic embrionalnega živčnega tkiva so lahko povezane tako s stopnjo nezrelosti in zavezanosti samih celic kot tudi z njihovimi različnimi odzivi na rastne faktorje, ki se sproščajo na območju povzročene poškodbe dopaminergičnih nevronov. Zlasti učinek EGF in FGF2 na razvoj telencefalnih živčnih matičnih celic in vivo se pojavlja v različnih fazah embriogeneze. Nevroepitelijske celice 8,5 dni starih mišjih zarodkov, gojene in vitro v mediju brez seruma, proliferirajo v prisotnosti FGF2, ne pa tudi EGF, na katerega se odzivajo le populacije matičnih celic, izoliranih iz možganov zarodkov v poznejših fazah razvoja. Hkrati se živčne matične celice proliferirajo kot odziv na vsakega od teh mitogenov in aditivno povečajo rast v primeru dodajanja EGF in FGF2 kulturi z nizko gostoto zasejanja celic. EGF-reaktivne nevronske matične celice iz zarodnih con 14,5 dni starih mišjih zarodkov veljajo za linearne potomce FGF-reaktivnih nevronskih matičnih celic, ki se prvič pojavijo po 8,5 dneh brejosti. Potencialni fenotip nevronskih matičnih in progenitorskih celic je odvisen od kompleksnega učinka njihovega mikrookolja. Imunofenotipizacija nevronskih celic iz periventrikularne in hipokampalne cone 8-12 in 17-20 tednov starih človeških zarodkov s pretočno citofluorometrijo je pokazala pomembno variabilnost, povezano tako z gestacijsko starostjo kot z individualnimi konstitucijskimi značilnostmi donorske biomateriale. Ko te nevronske progenitorske celice gojimo v selektivnem mediju brez seruma z EGF, FGF2 in NGF, se nevrosfere tvorijo s hitrostjo, ki je bistveno odvisna od gestacijske starosti. Celice iz različnih delov možganov 5-13 tednov starih človeških zarodkov, ki so bile kratkotrajno gojene z FGF2 v enoslojni kulturi na lamininskem substratu v prisotnosti sledov rastnih faktorjev, so ohranile proliferacijo 6 tednov z visokim odstotkom nestin-pozitivnih celic na ozadju spontane tvorbe celic z markerji vseh treh linij nevronske diferenciacije. Celice, izolirane iz mezencefalona človeškega zarodka v obdobju gestacije, daljšem od 13 tednov, se pod vplivom EGF razmnožujejo in tvorijo tudi nevrosfere. Sinergistični učinek je bil dosežen z uporabo kombinacije EGF in FGF2. Najintenzivnejša proliferacija nevronskih matičnih celic z nastankom nevrosfer je bila opažena pri gojenju tkiva možganske skorje 6-8 tednov starih človeških zarodkov v prisotnosti EGF2, IGF1 in 5 % konjskega seruma na substratu z fibronektinom.

Treba je opozoriti, da ostajajo odprta vprašanja o gestacijski starosti in odseku embrionalnega CNS, katerega tkivo je zaželeno uporabiti za nevrotransplantacijo. Odgovore nanje je treba iskati v nevrogenezi razvijajočih se možganov, ki se nadaljuje skozi celotno prenatalno obdobje - v času, ko epitelij nevralne cevi tvori večplastno strukturo. Domneva se, da je vir matičnih celic in novih nevronov radialna glija, ki jo sestavljajo podolgovate celice z dolgimi izrastki, radialno usmerjenimi glede na steno možganskih veziklov in ki se dotikajo notranje površine prekatov in zunanje pialne površine možganske stene. Prej je bila radialna glija obdarjena le s funkcijo nevronskega trakta, po katerem nevroblasti migrirajo iz ventralne regije v površinske oddelke, dodeljena pa ji je bila tudi skeletna vloga v procesu oblikovanja pravilne laminarne organizacije skorje. Danes je ugotovljeno, da se radialna glija z nadaljnjim razvojem transdiferencira v astrocite. Pri sesalcih se pomemben del zmanjša takoj po rojstvu, vendar se pri tistih živalskih vrstah, pri katerih se radialna glija ohrani do odraslosti, nevrogeneza aktivno pojavlja v postnatalnem obdobju.

V kulturi so radialne glialne celice iz embrionalnega neokorteksa glodalcev tvorile nevrone in glialne celice, pri čemer so nevroni pretežno nastajali v 14- do 16-dnevni gestacijski starosti razvoja zarodka (obdobje največje intenzivnosti nevrogeneze v možganski skorji miši in podgan). 18. dan embriogeneze se je diferenciacija premaknila v smeri nastanka astrocitov z znatnim zmanjšanjem števila novo nastalih nevronov. Označevanje radialnih glialnih celic z GFP in situ je omogočilo odkrivanje asimetrične delitve označenih celic v votlini možganskih veziklov 15- do 16 dni starih zarodkov podgan s pojavom hčerinskih celic z imunološkimi in elektrofiziološkimi značilnostmi nevroblastov. Omeniti velja, da glede na rezultate dinamičnih opazovanj nastajajoči nevroblasti uporabljajo matično celico radialnih glialnih celic za migracijo na pialno površino.

Endogeni označevalec radialne glije je vmesni filamentni protein nestin. Z metodo fluorescentnega pretočnega sortiranja celic, označenih z retrovirusom, povezanim z GFP in izraženim pod nadzorom nestina, je bilo dokazano, da matične celice zobatega girusa in hilusa človeškega hipokampusa (material je bil pridobljen med operacijami epilepsije) izražajo nestin. Zato spadajo v radialno glijo, ki je pri ljudeh, tako kot pri drugih sesalcih, ohranjena le v zobatem girusu.

Hkrati učinkovitost presaditve celic ni odvisna le od visoke sposobnosti preživetja donorskih celic, njihovega potenciala diferenciacije in sposobnosti nadomestitve okvarjenih celic, temveč predvsem od njihove usmerjene migracije. Popolna funkcionalna integracija presajenih celic je odvisna od njihove sposobnosti migracije – brez motenj citoarhitekture možganov prejemnika. Ker se radialna glija v postnatalnem obdobju skoraj popolnoma zmanjša, je bilo treba ugotoviti, kako se lahko donorske celice premaknejo iz območja presaditve na mesto poškodbe možganov pri odraslih prejemnikih. Obstajata dve različici migracije celic v osrednje živčevje, ki nista odvisni od radialne glije: pojav tangencialne migracije ali gibanja nevroblastov med razvojem možganske skorje pravokotno na mrežo radialne glije, pa tudi migracija "v vrsti" ali "vzdolž verige". Zlasti migracija nevronskih progenitorskih celic iz rostralne subventrikularne cone v vohalni čebulic poteka kot zaporedje tesno sosednjih celic, obdanih z glialnimi celicami. Domneva se, da te celice uporabljajo partnerske celice kot migracijski substrat, glavni regulator takšnih medceličnih interakcij pa je PSA-NCAM (polisializirana adhezijska molekula nevronskih celic). Zato migracija nevronov ne zahteva nujno sodelovanja radialne glije ali že obstoječih aksonskih povezav. Ekstraradialna oblika gibanja celic v "nizu" vzdolž rostralnega migracijskega trakta se ohranja skozi vse življenje, kar kaže na resnično možnost ciljne dostave presajenih nevronskih progenitorskih celic v zrel živčni sistem.

Obstaja hipoteza o prisotnosti linije matičnih celic v ontogenezi možganov, po kateri je matična celica v zgodnjih fazah razvoja možganov nevroepitelijska celica, ki se z dozorevanjem transdiferencira v radialno glijo. V odrasli dobi vlogo matičnih celic opravljajo celice, ki imajo značilnosti astrocitov. Kljub številnim spornim točkam (protislovja glede matičnih celic hipokampusa, pa tudi globokih delov možganov, ki nimajo večplastne skorje in se razvijejo iz talamičnih tuberkul, kjer radialne glije ni), je jasen in preprost koncept dosledne spremembe fenotipa matičnih celic skozi celotno ontogenezo videti zelo privlačen.

Vpliv mikrookoljskih dejavnikov na določanje in posledično diferenciacijo nevronskih diferencialnih celic je bil jasno dokazan s presaditvijo zrelih matičnih celic hrbtenjače podgan v različne regije zrelega živčnega sistema. Ko so bile matične celice presadjene v zobati girus ali v območje migracije nevronov v vohalnih bulbah, so opazili aktivno migracijo presajenih celic z nastankom številnih nevronov. Presaditev matičnih celic v hrbtenjačo in območje Ammonovega roga je povzročila nastanek astrocitov in oligodendrocitov, medtem ko je presaditev v zobati girus povzročila nastanek ne le glialnih celic, temveč tudi nevronov.

Pri odrasli podgani lahko število delitvenih celic v zobatem girusu doseže več tisoč na dan - manj kot 1 % celotnega števila granularnih celic. Nevroni predstavljajo 50–90 % celic, astociti in drugi glialni elementi pa približno 15 %. Preostale celice nimajo antigenih značilnosti nevronov in glije, vsebujejo pa antigene endotelijskih celic, kar kaže na tesno povezavo med nevrogenezo in angiogenezo v zobatem girusu. Zagovorniki možnosti diferenciacije endotelijskih celic v nevronske prekurzorske celice se sklicujejo na sposobnost endotelijskih celic in vitro, da sintetizirajo BDNF.

Hitrost samosestavljanja nevronskih vezij je impresivna: med diferenciacijo se predhodne celice granularnih celic selijo v zobati girus in tvorijo odrastke, ki rastejo proti SAZ coni Amonovega roga in tvorijo sinapse s piramidalnimi glutamatergičnimi in interkalarnimi inhibitornimi nevroni. Novo nastale granularne celice se integrirajo v obstoječa nevronska vezja v 2 tednih, prve sinapse pa se pojavijo že 4-6 dni po nastanku novih celic. S pogostim dajanjem BrdU ali 3H-timidina (ena od metod za identifikacijo odraslih matičnih celic) odraslim živalim so v Amonovem rogu našli veliko število označenih nevronov in astrocitov, kar kaže na možnost nastanka novih nevronov ne le v zobatem girusu, temveč tudi v drugih delih hipokampusa. Zanimanje za procese delitve, diferenciacije in celične smrti v zobatem girusu hipokampusa zrelih možganov je posledica tudi dejstva, da so nevroni, ki nastanejo tukaj, lokalizirani v enem ključnih področij hipokampusa, odgovornem za procese učenja in spomina.

Tako je danes ugotovljeno, da nevronske progenitorske celice izvirajo iz celic subependimalne cone lateralnega ventrikla odraslih glodalcev. Migrirajo vzdolž rostralnega migracijskega trakta, ki ga tvorijo vzdolžno usmerjene astroglijske celice, do vohalnega bulbusa, kjer se vgradijo v plast granularnih celic in se diferencirajo v nevrone te strukture. Migracija progenitorskih nevronskih celic je bila zaznana v rostralnem migracijskem traktu odraslih opic, kar kaže na možnost nastanka novih nevronov v vohalnem bulbusu primatov. Nevronske matične celice so bile izolirane iz vohalnega bulbusa odraslega človeka in prenesene v linije, katerih klonirane celice se diferencirajo v nevrone, astrocite in oligodendrocite. Matične celice so bile najdene v hipokampusu zrelih možganov podgan, miši, opic in ljudi. Nevronske matične celice subgranularne cone zobate fascije so vir progenitorskih celic, ki migrirajo v medialni in lateralni krak hipokampusa, kjer se diferencirajo v zrele granularne celice in glialne elemente. Aksoni de novo nastalih nevronov zobate fascije so sledljivi do polja CA3, kar kaže na sodelovanje novo nastalih nevronov pri izvajanju funkcij hipokampusa. V asociacijskih območjih neokorteksa odraslih opic so bile najdene nevronske progenitorske celice, ki so migrirale iz subventrikularne cone. V plasti VI neokorteksa mišjih možganov so bile odkrite nove piramidalne nevrone 2–28 tednov po povzročeni poškodbi in smrti avtohtonih nevronov te plasti zaradi migracije prej mirujočih progenitorskih celic subventrikularne cone. Končno, resničnost postnatalne nevrogeneze v človeških možganih dokazuje dvakratno povečanje števila kortikalnih nevronov, ki se nadaljuje v prvih 6 letih po rojstvu.

Za praktično transplantologijo celic je pomembno vprašanje regulacije procesov razmnoževanja in diferenciacije živčnih matičnih in progenitorskih celic. Najpomembnejši dejavniki, ki zavirajo proliferacijo živčnih progenitorskih celic, so glukokortikoidi, ki močno zmanjšajo število delitev, medtem ko odstranitev nadledvičnih žlez, nasprotno, znatno poveča število mitoz (Gould, 1996). Omeniti velja, da je morfogeneza zobatega girusa pri glodavcih najintenzivnejša v prvih dveh tednih postnatalnega razvoja v obdobju odsotnosti reakcije na stres ob ozadju močnega zmanjšanja proizvodnje in izločanja steroidnih hormonov nadledvične skorje. Kortikosteroidi zavirajo migracijo granularnih celic - novi nevroni se ne vgradijo v granularno plast zobatega girusa, temveč ostanejo v hilusu. Domneva se, da so hkrati moteni procesi nastajanja sinaptičnih povezav. Zaščita celic pred takšno "steroidno agresijo" se izvaja z minimalnim izražanjem mineralokortikoidnih in glukokortikoidnih receptorjev na proliferirajočih granularnih celicah ne le med razvojem zobatega girusa, temveč tudi pri odraslih živalih. Vendar pa so od vseh možganskih nevronov prav nevroni hipokampusa tisti, ki imajo najvišjo vsebnost glukokortikoidnih receptorjev, kar povzroča stresni učinek na hipokampus. Psihoemocionalni stres in stresne situacije zavirajo nevrogenezo, kronični stres pa močno zmanjša sposobnost živali za pridobivanje novih veščin in učenje. Izrazitejši negativni učinek kroničnega stresa na nevrogenezo je povsem razumljiv, če upoštevamo pretežno mirujoče stanje nevronskih matičnih celic. Pri imobilizaciji brejih podgan (za glodavce - izjemno močan stresni dejavnik) so ugotovili, da prenatalni stres povzroči tudi zmanjšanje števila celic v zobatem girusu in znatno zavira nevrogenezo. Znano je, da glukokortikoidi sodelujejo pri patogenezi depresivnih stanj, katerih morfološki ekvivalent je zaviranje nevrogeneze, patološka reorganizacija nevronov in mednevronskih povezav ter smrt živčnih celic. Po drugi strani pa antidepresivi v kemoterapiji aktivirajo nastanek nevronov de novo, kar potrjuje povezavo med procesi nastajanja novih nevronov v hipokampusu in razvojem depresije. Estrogeni imajo pomemben vpliv na nevrogenezo, katere učinki so nasprotni delovanju glukokortikosteroidov in sestojijo iz podpiranja proliferacije in preživetja nevronskih progenitorskih celic. Treba je opozoriti, da estrogeni znatno povečajo sposobnost učenja pri živalih. Nekateri avtorji povezujejo ciklične spremembe v številu granularnih celic in njihovo presežno število pri samicah z vplivom estrogenov.

Znano je, da nevrogenezo nadzirajo EGF, FGF in BDNF, vendar mehanizmi vpliva zunanjih signalov mitogenov in rastnih faktorjev na matične celice niso dovolj raziskani. Ugotovljeno je bilo, da PDGF in vitro vzdržuje nevronsko smer diferenciacije progenitorskih celic, ciliarni nevrotrofični faktor (CNTF) pa, tako kot trijodotironin, spodbuja nastanek pretežno glialnih elementov - astrocitov in oligodendrocitov. Hipofizni adenilat ciklazo aktivirajoči protein (PACAP) in vazoaktivni črevesni peptid (VIP) aktivirata proliferacijo nevronskih progenitorskih celic, hkrati pa zavirata procese diferenciacije hčerinskih celic. Opioidi, zlasti v primeru njihove dolgotrajne izpostavljenosti, pomembno zavirajo nevrogenezo. Vendar pa opioidni receptorji v matičnih celicah in nevronskih progenitorskih celicah zobatega girusa niso bili identificirani (prisotni so v diferencirajočih se nevronih embrionalnega obdobja), kar nam ne omogoča ocene neposrednih učinkov opioidov.

Potrebe praktične regenerativno-plastične medicine so raziskovalce prisilile, da so posebno pozornost namenili preučevanju pluri- in multipotentnosti matičnih celic. Izvajanje teh lastnosti na ravni regionalnih matičnih celic odraslega organizma bi lahko v prihodnosti zagotovilo proizvodnjo potrebnega presaditvenega materiala. Zgoraj je bilo prikazano, da epigenetska stimulacija nevronskih matičnih celic omogoča pridobivanje proliferirajočih celic, ki so že predoblikovane v skladu z nevronskimi fenotipi, kar omejuje njihovo število. V primeru uporabe totipotentnih lastnosti embrionalne matične celice se proliferacija, dokler ni pridobljeno zadostno število celic, zgodi prej kot nevronska diferenciacija, pomnožene celice pa se zlahka pretvorijo v nevronski fenotip. Za pridobitev nevronskih matičnih celic se ESC izolirajo iz notranje celične mase blastociste in gojijo v obvezni prisotnosti LIF, ki ohranja njihovo totipotentnost in sposobnost neomejene delitve. Po tem se z retinojsko kislino inducira nevronska diferenciacija ESC. Presaditev nastalih nevronskih matičnih celic v striatum, poškodovan s kinolinom in 6-hidroksidopaminom, spremlja njihova diferenciacija v dopaminergične in serotonergične nevrone. Po injiciranju v ventrikle možganov podganjega zarodka se iz ESC pridobljene nevronske progenitorske celice selijo v različne regije prejemnikovih možganov, vključno s skorjo, striatumom, septumom, talamusom, hipotalamusom in malim mozgom. Celice, ki ostanejo v ventrikularni votlini, tvorijo epitelijske strukture, ki spominjajo na nevralno cev, pa tudi posamezne otoke ne-nevralnega tkiva. V možganskem parenhimu prejemnikovega zarodka presajene celice proizvajajo tri glavne tipe celic živčnega sistema. Nekatere od njih imajo podolgovate apikalne dendrite, piramidalna celična telesa in bazalne aksone, ki štrlijo v corpus callosum. Astrociti donorske izvora segajo do bližnjih kapilar, oligodendrociti pa tesno sodelujejo z mielinskimi mufami in sodelujejo pri tvorbi mielina. Tako so nevronske progenitorske celice, pridobljene iz ESC in vitro, sposobne usmerjene migracije in regionalne diferenciacije, ki ustreza signalom mikrookolja, in tako oskrbujejo številna področja razvijajočih se možganov z nevroni in glijo.

Nekateri avtorji razmišljajo o možnosti de- in transdiferenciacije regionalnih matičnih celic odraslega organizma. Posredno potrditev dediferenciacije celic v kulturi z razširitvijo njihovih potencialov zagotavljajo podatki o presaditvi mišjih nevronskih matičnih celic v rdeči kostni mozeg s poznejšim razvojem celičnih linij iz njih, ki dajejo funkcionalno aktivne celice periferne krvi. Poleg tega je presaditev gensko označenih (LacZ) celic nevrosfere, pridobljenih iz zrelih ali embrionalnih možganov, v možgane obsevanih miši z zavirano hematopoezo povzročila ne le nastanek nevronskih derivatov iz matičnih celic, temveč je povzročila tudi nastanek krvnih celic, kar kaže na pluripotentnost nevronskih matičnih celic, ki se izvaja zunaj možganov. Tako se je nevronska matična celica sposobna diferencirati v krvne celice pod vplivom signalov iz mikrookolja kostnega mozga s predhodno transformacijo v hematopoetsko matično celico. Po drugi strani pa je bila pri presaditvi hematopoetskih matičnih celic kostnega mozga v možgane ugotovljena njihova diferenciacija pod vplivom mikrookolja možganskega tkiva v glialne in nevronske celice. Posledično potencial diferenciacije živčnih in hematopoetskih matičnih celic ni omejen s tkivno specifičnostjo. Z drugimi besedami, dejavniki lokalnega mikrookolja, ki se razlikujejo od tistih, značilnih za možgansko tkivo in tkivo kostnega mozga, lahko spremenijo smer diferenciacije teh celic. Pokazalo se je, da živčne matične celice, vnesene v venski sistem obsevanih miši, ustvarijo populacije mieloidnih, limfoidnih in nezrelih hematopoetskih celic v vranici in kostnem mozgu. In vitro je bil ugotovljen vpliv morfogenetskih proteinov kostnega mozga (BMP) na preživetje in diferenciacijo živčnih matičnih celic, ki je, tako kot v zgodnjih fazah embriogeneze, določil njihov razvoj v živčni ali glialni smeri. V kulturah živčnih matičnih celic iz 16 dni starih zarodkov podgan BMP inducirajo nastanek nevronov in astroglije, medtem ko v kulturah matičnih celic, pridobljenih iz perinatalnih možganov, nastajajo le astrociti. Poleg tega BMP zavirajo nastajanje oligodendrocitov, ki se in vitro pojavijo le z dodatkom antagonista BMP noggina.

Procesi transdiferenciacije niso specifični za vrsto: človeške hematopoetske matične celice kostnega mozga, presajene v striatum odraslih podgan, migrirajo v belo snov zunanje kapsule, ipsi- in kontralateralnega neokorteksa, kjer tvorijo astrocitom podobne celične elemente (Azizi et al., 1998). Ko so matične celice kostnega mozga alotransplantirane v lateralni prekat novorojenih miši, lahko migracijo hematopoetskih matičnih celic zasledimo v strukturah prednjega dela možganov in malih možganov. V striatumu in molekularni plasti hipokampusa se migrirane celice transformirajo v astrocite, v vohalnem čebulici, notranji plasti granularnih celic malih možganov in retikularni formaciji možganskega debla pa tvorijo nevronom podobne celice s pozitivno reakcijo na nevrofilamente. Po intravenskem dajanju hematopoetskih celic odraslim mišim so bili v neokorteksu, talamusu, možganskem deblu in malih možganih odkriti mikro- in astrociti, označeni z GFP.

Poleg tega se lahko mezenhimske matične celice kostnega mozga, iz katerih nastanejo vse vrste celic vezivnega tkiva, pod določenimi pogoji tudi podvržejo nevronski transdiferenciaciji (spomnimo se, da so embrionalni vir mezenhima celice nevralnega grebena). Dokazano je, da človeške in mišje stromalne celice kostnega mozga, gojene in vitro v prisotnosti EGF ali BDNF, izražajo marker nevronskih progenitorskih celic nestin, dodatek različnih kombinacij rastnih faktorjev pa vodi do nastanka celic z markerji glije (GFAP) in nevronov (jedrski protein, NeuN). Označene singenetske mezenhimske matične celice, presajene v lateralni ventrikel možganov novorojenih miši, migrirajo in se lokalizirajo v sprednjem možganu in malem mozgu, ne da bi pri tem motile citoarhitekturo prejemnih možganov. Mezenhimske matične celice kostnega mozga se diferencirajo v zrele astrocite v striatumu in molekularni plasti hipokampusa ter naseljujejo vohalni čebulic, granularne plasti malih možganov in retikularno formacijo, kjer se transformirajo v nevrone. Mezenhimske matične celice človeškega kostnega mozga se lahko in vitro diferencirajo v makroglijo in se po presaditvi integrirajo v možganske strukture podgan. Neposredno presaditev mezenhimskih matičnih celic kostnega mozga v hipokampus odraslih podgan spremlja tudi njihova migracija v možganski parenhim in nevroglialna diferenciacija.

Domneva se, da bi presaditev matičnih celic kostnega mozga lahko razširila možnosti celične terapije bolezni osrednjega živčevja, za katere je značilna prekomerna patološka smrt nevronov. Vendar je treba opozoriti, da vsi raziskovalci ne priznavajo dejstva medsebojne transformacije živčnih in hematopoetskih matičnih celic, zlasti in vivo, kar je spet posledica pomanjkanja zanesljivega označevalca za oceno njihove transdiferenciacije in nadaljnjega razvoja.

Presaditev matičnih celic odpira nova obzorja za celično gensko terapijo dedne nevrološke patologije. Genetska modifikacija nevronskih matičnih celic vključuje vstavljanje genetskih regulatornih konstruktov, katerih produkti interagirajo s proteini celičnega cikla v načinu samodejne regulacije. Transdukcija takšnih genov v embrionalne progenitorske celice se uporablja za razmnoževanje nevronskih matičnih celic. Večina gensko spremenjenih celičnih klonov se obnaša kot stabilne celične linije, ki ne kažejo znakov transformacije in vivo ali in vitro, vendar imajo izrazito sposobnost kontaktne inhibicije proliferacije. Po presaditvi se razmnožene transficirane celice integrirajo v tkivo prejemnika, ne da bi pri tem motile citoarhitekturo in se ne bi tumorsko transformirale. Donorske nevronske matične celice ne deformirajo integracijskega območja in enakovredno tekmujejo za prostor z gostiteljskimi progenitorskimi celicami. Vendar pa se 2. do 3. dan intenzivnost delitve transfektiranih celic močno zmanjša, kar ustreza kontaktni inhibiciji njihove proliferacije in vitro. Zarodki prejemniki transfektantov nevronskih matičnih celic nimajo nepravilnosti v razvoju centralnega živčnega sistema, vsa področja možganov, ki so v stiku s presadkom, se razvijejo normalno. Po presaditvi kloni nevronskih matičnih celic hitro migrirajo iz območja injiciranja in pogosto presegajo ustrezna embrionalna območja vzdolž rostralnega trakta, pri čemer se ustrezno integrirajo z drugimi področji možganov. Integracija gensko spremenjenih klonov in transficiranih celičnih linij nevronskih matičnih celic v možgane gostiteljskega organizma ni značilna le za embrionalno obdobje: te celice se vsadijo v številna področja osrednjega živčnega sistema ploda, novorojenčka, odraslega in celo starajočega se prejemnega organizma ter kažejo sposobnost ustrezne integracije in diferenciacije. Zlasti po presaditvi v ventrikularno votlino možganov transficirane celice migrirajo, ne da bi poškodovale krvno-možgansko pregrado, in postanejo sestavni funkcionalni celični sestavni deli možganskega tkiva. Donorski nevroni tvorijo ustrezne sinapse in izražajo specifične ionske kanale. Ob ohranjeni integriteti krvno-možganske pregrade astroglija, derivat transfektiranih nevronskih matičnih celic, segajo odrastke do možganskih žil, donorski oligodendrociti pa izražajo mielinski bazični protein in mielinizirajo nevronske odrastke.

Poleg tega se nevronske matične celice transficirajo za uporabo kot celični vektorji. Takšni vektorsko-genetski konstrukti zagotavljajo in vivo stabilno izražanje tujih genov, ki sodelujejo pri razvoju živčnega sistema, ali pa se uporabljajo za odpravljanje obstoječih genetskih napak, saj so produkti teh genov sposobni kompenzirati različne biokemične nepravilnosti centralnega živčnega sistema. Visoka migracijska aktivnost transficiranih matičnih celic in ustrezna implantacija v zarodne cone različnih področij razvijajočih se možganov nam omogočata upanje na popolno obnovo dedne pomanjkljivosti celičnih encimov. Pri modeliranju sindroma ataksije-telangiektazije (mutantne mišje linije pg in pcd) Purkinjejeve celice izginejo iz malih možganov poskusnih živali v prvih tednih postnatalnega razvoja. Dokazano je, da vnos nevronskih matičnih celic v možgane takšnih živali spremlja njihova diferenciacija v Purkinjejeve celice in granularne nevrone. Pri mutantih pcd se delno popravijo motnje koordinacije gibanja in zmanjša intenzivnost tremorja. Podobni rezultati so bili pridobljeni s presaditvijo kloniranih človeških nevronskih matičnih celic v primate, pri katerih je bila degeneracija Purkinjejevih celic inducirana z uporabo onkonaze. Po presaditvi so bile donorske nevronske matične celice najdene v granularni, molekularni in Purkinjejevi celični plasti cerebelarnega parenhima. Zato lahko genetska modifikacija nevronskih progenitorskih celic zagotovi stabilno in zavezano modifikacijo fenotipa, ki je odporna na zunanje vplive. To je še posebej pomembno pri patoloških procesih, povezanih z razvojem dejavnikov pri prejemniku, ki preprečujejo preživetje in diferenciacijo donorskih celic (npr. med imunsko agresijo).

Mukopolisaharidozo tipa VII pri ljudeh zaznamuje nevrodegeneracija in progresivna intelektualna invalidnost, ki jo pri miših modelira delecijska mutacija v genu za beta-glukuronidazo. Po presaditvi transficiranih nevronskih matičnih celic, ki izločajo beta-glukuronidazo, v možganske ventrikle novorojenih miši z okvaro, se donorske celice najprej najdejo v terminalni coni in se nato razširijo po možganskem parenhimu, kar stabilno popravlja integriteto lizosomov v možganih mutiranih miši. V modelu Tay-Sachsove bolezni nevronske matične celice, transducirane z retrovirusi, ko so bile in utero dane mišjim zarodkom in presajene novorojenim mišim, zagotavljajo učinkovito izražanje beta-podenote beta-heksosaminidaze pri prejemnikih z mutacijo, kar vodi do patološkega kopičenja beta2-gangliozida.

Druga smer regenerativne medicine je spodbujanje proliferativnega in diferenciacijskega potenciala pacientovih lastnih nevronskih matičnih celic. Nevralne matične celice izločajo NT-3 med hemisekcijo hrbtenjače in asfiksijo možganov pri podganah, izražajo NGF in BDNF v septumu in bazalnih ganglijih, tirozin hidroksilaze v striatumu, pa tudi reelin v malem mozgu in mielinski bazični protein v možganih.

Vendar pa vprašanjem stimulacije nevrogeneze očitno ni posvečene dovolj pozornosti. Nekaj študij kaže, da se funkcionalna obremenitev živčnih centrov, odgovornih za razlikovanje vonjav, odraža v nastanku novih nevronov. Pri transgenih miših s primanjkljajem nevronskih adhezijskih molekul je bilo zmanjšanje intenzivnosti nevrogeneze in zmanjšanje števila nevronov, ki migrirajo v vohalne čebulice, kombinirano z okvaro sposobnosti razlikovanja vonjav, čeprav prag zaznavanja vonjav in kratkoročni vohalni spomin nista bila okrnjena. Funkcionalno stanje celic zobatega girusa igra pomembno vlogo pri regulaciji nevrogeneze: oslabitev učinka glutamata na granularne celice po uničenju entorhinalnega korteksa spodbuja proliferacijo in diferenciacijo nevronov, stimulacija vlaken perforantne poti (glavnega aferentnega vhoda v hipokampus) pa povzroči zaviranje nevrogeneze. Antagonisti receptorjev NMDA aktivirajo procese nastajanja novih nevronov, medtem ko agonisti, nasprotno, zmanjšajo intenzivnost nevrogeneze, kar po učinku spominja na delovanje glukokortikosteroidov. V literaturi najdemo protislovne rezultate raziskav: informacije o eksperimentalno dokazanem zaviralnem učinku ekscitatornega nevrotransmiterja glutamata na nevrogenezo so v nasprotju s podatki o stimulaciji proliferacije progenitorskih celic in pojavu novih nevronov s povečanjem epileptične aktivnosti v hipokampusu živali z eksperimentalnimi kainskimi in pilokarpinskimi modeli epilepsije. Hkrati se v tradicionalnem modelu epilepsije, ki jo povzroča večkratna podpragovna stimulacija določenega področja možganov (kindling) in za katero je značilna manj izrazita smrt nevronov, intenzivnost nevrogeneze poveča šele v pozni fazi kindlinga, ko v hipokampusu opazimo poškodbe in smrt nevronov. Dokazano je, da pri epilepsiji epileptična aktivnost spodbuja nevrogenezo z nenormalno lokalizacijo novih granularnih nevronov, od katerih se mnogi pojavljajo ne le v zobatem girusu, temveč tudi v hilusu. Takšni nevroni so zelo pomembni pri razvoju kaljenja mahovitih vlaken, saj njihovi aksoni tvorijo normalno odsotne povratne kolaterale, ki tvorijo številne sinapse s sosednjimi granularnimi celicami.

Uporaba regionalnih nevronskih matičnih celic odpira nove možnosti za uporabo celične presaditve pri zdravljenju presnovnih in genetskih nevrodegenerativnih bolezni, demielinizirajočih bolezni in posttravmatskih motenj centralnega živčnega sistema. Pred izvedbo nadomestne celične presaditve po eni od metod se izvede izbira in ekspanzija potrebne vrste nevronskih progenitorskih celic ex vivo z namenom njihovega poznejšega vnosa neposredno v poškodovano območje možganov. Terapevtski učinek je v tem primeru posledica nadomestitve poškodovanih celic ali lokalnega sproščanja rastnih faktorjev in citokinov. Ta metoda regenerativno-plastične terapije zahteva presaditev dovolj velikega števila celic z vnaprej določenimi funkcionalnimi značilnostmi.

Nadaljnje študije molekularnih značilnosti in regenerativno-plastičnega potenciala zrelih možganskih matičnih celic ter sposobnosti regionalnih matičnih celic različnega tkivnega izvora za transdiferenciacijo bi morale biti prav tako primerne. Danes je že bilo izvedeno presejanje antigenov hematopoetskih matičnih celic kostnega mozga z določitvijo kombinacije markerjev celic, ki se lahko transdiferencirajo v nevronske matične progenitorske celice (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Pridobljene so bile celice, ki in vitro tvorijo nevrosfere in pri presaditvi v možgane novorojenih imunsko pomanjkljivih miši tvorijo nevrone. Za celično ksenotransplantologijo so zanimivi rezultati študij o možnosti navzkrižne presaditve matičnih celic pri posameznikih evolucijsko oddaljenih taksonov. Rezultati implantacije nevronskih matičnih celic v območje možganskega tumorja ostajajo brez ustrezne interpretacije: presajene celice aktivno migrirajo po celotnem volumnu tumorja, ne da bi presegle njegove meje, in ko so celice vnesene v nepoškodovani del možganov, opazimo njihovo aktivno migracijo proti tumorju. Vprašanje biološkega pomena takšne migracije ostaja odprto.

Treba je opozoriti, da je uspešna presaditev živčnih matičnih celic, pa tudi drugih živčnih progenitorskih celic, pridobljenih iz embrionalnih matičnih celic (EMC), mogoča le pri uporabi visoko prečiščenih živčnih progenitorskih celic, saj se nediferencirane embrionalne matične celice pri presaditvi odraslemu imunokompetentnemu prejemniku neizogibno transformirajo v teratome in teratokarcinome. Že minimalna količina slabo diferenciranih celic v suspenziji donorskih celic močno poveča tumorigenost presadka in nesprejemljivo poveča tveganje za razvoj tumorja ali nastanek ne-živčnega tkiva. Pridobitev homogenih populacij živčnih progenitorskih celic je mogoča pri uporabi celic, ki nastanejo v določenih fazah normalne embriogeneze, kot alternativnega vira donorske tkiva. Drug pristop vključuje skrbno izločanje neželenih celičnih populacij z linijsko specifično selekcijo. Nevarna je tudi uporaba ESC za nevrotransplantacijo po njihovi nezadostni izpostavljenosti rastnim faktorjem in vitro. V tem primeru ni mogoče izključiti neuspeha programa nevronske diferenciacije z nastankom struktur, ki so lastne živčni cevi.

Danes je povsem očitno, da nevronske matične celice kažejo tropizem za patološko spremenjena področja osrednjega živčevja in imajo izrazit regenerativno-plastični učinek. Mikrookolje na mestu smrti celic živčnega tkiva modelira smer diferenciacije presajenih celic in s tem nadomešča pomanjkanje specifičnih nevronskih elementov znotraj območja poškodbe osrednjega živčevja. Pri nekaterih nevrodegenerativnih procesih se pojavijo nevrogeni signali za ponovitev nevrogeneze, nevronske matične celice zrelih možganov pa se lahko odzovejo na te poučne informacije. Številni eksperimentalni podatki jasno ponazarjajo terapevtski potencial nevronskih matičnih celic. Intracisternalno dajanje klona nevronskih matičnih celic živalim z ligacijo srednje možganske arterije (model ishemične kapi) pomaga zmanjšati površino in volumen destruktivno spremenjenega območja možganov, zlasti v primeru presaditve nevronskih matičnih celic skupaj z FGF2. Imunocitokemično opazimo migracijo donorskih celic v ishemično območje z njihovo poznejšo integracijo z intaktnimi možganskimi celicami prejemnika. Presaditev nezrelih celic mišje nevroepitelne linije MHP36 v možgane podgan z eksperimentalno možgansko kapjo izboljša senzorimotorično funkcijo, vnos teh celic v možganske ventrikle pa okrepi kognitivno funkcijo. Presaditev nevrološko predoblikovanih hematopoetskih celic človeškega kostnega mozga podganam odpravi disfunkcijo možganske skorje, ki jo povzroča ishemično poškodbo. V tem primeru ksenogene nevronske progenitorske celice migrirajo z mesta injiciranja v območje destruktivnih sprememb v možganskem tkivu. Intrakranialna presaditev homolognih celic kostnega mozga pri travmatski poškodbi možganske skorje pri podganah vodi do delne obnove motorične funkcije. Donorske celice se primejo, proliferirajo, se nevronsko diferencirajo v nevrone in astrocite ter migrirajo proti leziji. Ko jih injiciramo v striatum odraslih podgan z eksperimentalno možgansko kapjo, klonirane človeške nevronske matične celice nadomestijo poškodovane celice osrednjega živčnega sistema in delno obnovijo okvarjeno delovanje možganov.

Človeške živčne matične celice so večinoma izolirane iz embrionalnega telencefalona, ki se razvije veliko pozneje kot bolj kaudalno locirani deli živčnega debla. Pokazala se je možnost izolacije živčnih matičnih celic iz hrbtenjače 43–137 dni starega človeškega ploda, saj te celice v prisotnosti EGF in FGF2 tvorijo nevrosfere in kažejo multipotentnost v zgodnjih prehodih, pri čemer se diferencirajo v nevrone in astrocite. Vendar pa dolgotrajno gojenje živčnih progenitorskih celic (več kot 1 leto) odvzame multipotentnost – takšne celice se lahko diferencirajo le v astrocite, tj. postanejo unipotentne. Regionalne živčne matične celice je mogoče pridobiti z delno bulbektomijo in jih po razmnoževanju v kulturi v prisotnosti LIF presaditi istemu bolniku z nevrodegenerativnimi spremembami v drugih delih osrednjega živčnega sistema. V kliniki je bila prvič izvedena nadomestna celična terapija z uporabo živčnih matičnih celic za zdravljenje bolnikov z možgansko kapjo, ki jo spremlja poškodba bazalnih ganglijev možganov. Zaradi presaditve donorskih celic so opazili izboljšanje kliničnega stanja večine bolnikov.

Nekateri avtorji menijo, da sposobnost živčnih matičnih celic, da se vsadijo, migrirajo in integrirajo v različna področja živčnega tkiva v primeru poškodbe osrednjega živčevja, odpira neomejene možnosti za celično terapijo ne le lokalnih, temveč tudi obsežnih (možganska kap ali asfiksija), multifokalnih (multipla skleroza) in celo globalnih (večina dednih presnovnih motenj ali nevrodegenerativnih demenc) patoloških procesov. Dejansko se pri presajanju kloniranih mišjih in človeških živčnih celic v živali prejemnice (miši oziroma primate) z degeneracijo dopaminergičnih nevronov v mezostriatalnem sistemu, ki jo povzroči vnos metilfeniltetrapiridina (model Parkinsonove bolezni), 8 mesecev pred presaditvijo integrirajo darovalčeve živčne celice v osrednji živčevje. Mesec dni kasneje so presajene celice lokalizirane bilateralno vzdolž srednjih možganov. Nekateri nastali nevroni darovalčevega izvora izražajo tirozin hidrolazo, če ni znakov imunske reakcije na presaditev. Pri podganah, ki so jim dajali 6-hidroksidopamin (še en eksperimentalni model Parkinsonove bolezni), je bila prilagoditev presajenih celic na mikrookolje v možganih gostitelja določena s pogoji gojenja nevronskih matičnih celic pred njihovo presaditvijo. Nevronske matične celice, ki so se in vitro pod vplivom EGF hitro razmnoževale, so učinkoviteje nadomestile pomanjkanje dopaminergičnih nevronov v poškodovanem striatumu kot celice iz 28-dnevnih kultur. Avtorji menijo, da je to posledica izgube sposobnosti zaznavanja ustreznih diferenciacijskih signalov med procesom celične delitve nevronskih progenitorskih celic in vitro.

V nekaterih študijah so poskušali povečati učinkovitost vpliva na procese reinervacije poškodovanega striatuma s presaditvijo embrionalnih celic striatuma v to območje kot vira nevrotrofičnih dejavnikov ob hkratni presaditvi dopaminergičnih nevronov ventralnega mezencefalona. Izkazalo se je, da je učinkovitost nevrotransplantacije v veliki meri odvisna od načina vnosa embrionalnega živčnega tkiva. Kot rezultat študij o presaditvi pripravkov embrionalnega živčnega tkiva v ventrikularni sistem možganov (da bi se izognili poškodbi parenhima striatuma) so bili pridobljeni podatki o njihovem pozitivnem učinku na motorično okvaro pri parkinsonizmu.

Vendar pa so v drugih študijah eksperimentalna opazovanja pokazala, da presaditev pripravkov embrionalnega živčnega tkiva ventralnega mezencefalona, ki vsebujejo dopaminergične nevrone, v možganski ventrikel, kot tudi presaditev GABA-ergičnih embrionalnih živčnih elementov v striatum podgan s hemiparkinsonizmom, ne spodbuja obnovitve oslabljenih funkcij dopaminergičnega sistema. Nasprotno, imunocitokemična analiza je potrdila podatke o nizki stopnji preživetja dopaminergičnih nevronov ventralnega mezencefalona, presajenih v striatum podgan. Terapevtski učinek intraventrikularne presaditve embrionalnega živčnega tkiva ventralnega mezencefalona je bil dosežen le pod pogojem sočasne implantacije pripravka embrionalnih striatalnih celic v denervirani striatum. Avtorji menijo, da je mehanizem tega učinka povezan s pozitivnim trofičnim učinkom GABA-ergičnih elementov embrionalnega striatuma na specifično dopaminergično aktivnost intraventrikularnih presadkov ventralnega mezencefalona. Izrazito glialno reakcijo v presadkih je spremljala rahla regresija parametrov testa z apomorfinom. Slednje pa je bilo v korelaciji z vsebnostjo GFAP v krvnem serumu, kar je neposredno kazalo na kršitev prepustnosti krvno-možganske pregrade. Na podlagi teh podatkov so avtorji zaključili, da se raven GFAP v krvnem serumu lahko uporabi kot ustrezno merilo za oceno funkcionalnega stanja presadka, povečana prepustnost krvno-možganske pregrade za nevrospecifične antigene, kot je GFAP, pa je patogenetska povezava pri razvoju odpovedi presadka zaradi avtoimunske poškodbe živčnega tkiva prejemnika.

Z vidika drugih raziskovalcev sta presaditev in integracija živčnih matičnih celic po presaditvi stabilna in vseživljenjska, saj se darovalske celice v prejemnikih nahajajo vsaj dve leti po presaditvi in brez znatnega zmanjšanja njihovega števila. Poskusi, da bi to pojasnili z dejstvom, da v nediferenciranem stanju živčne matične celice ne izražajo molekul MHC razreda I in II na ravni, ki bi zadostovala za sprožitev imunske zavrnitvene reakcije, so lahko resnični le v povezavi z nizko diferenciranimi živčnimi predhodniki. Vendar pa se vse živčne matične celice v možganih prejemnika ne ohranijo v nezrelem mirujočem stanju. Večina jih je podvrženih diferenciaciji, med katero se molekule MHC izražajo v celoti.

Zlasti nezadostna učinkovitost uporabe intrastriatalne presaditve pripravkov embrionalnega ventralnega mezencefalona, ki vsebujejo dopaminergične nevrone, za zdravljenje eksperimentalnega parkinsonizma je povezana z nizko stopnjo preživetja presajenih dopaminergičnih nevronov (le 5–20 %), ki jo povzroča reaktivna glioza, ki spremlja lokalno travmo možganskega parenhima med presaditvijo. Znano je, da lokalna travma možganskega parenhima in sočasna glioza vodita do motenj integritete krvno-možganske pregrade s sproščanjem antigenov živčnega tkiva, zlasti OCAR in nevrospecifičnega antigena, v periferno kri. Prisotnost teh antigenov v krvi lahko povzroči nastanek specifičnih citotoksičnih protiteles proti njim in razvoj avtoimunske agresije.

V. Tsymbalyuk in soavtorji (2001) poročajo, da še vedno velja tradicionalno stališče, po katerem je centralni živčni sistem imunološko privilegirano območje, ki ga od imunskega sistema izolira krvno-možganska pregrada. V svojem pregledu literature avtorji navajajo številna dela, ki kažejo, da to stališče ne ustreza v celoti bistvu imunskih procesov v možganih sesalcev. Ugotovljeno je bilo, da lahko označene snovi, vnesene v možganski parenhim, dosežejo globoke vratne bezgavke, po intracerebralni injekciji antigenov pa se v telesu tvorijo specifična protitelesa. Celice vratnih bezgavk se na takšne antigene odzovejo s proliferacijo, ki se začne 5. dan po injekciji. Nastanek specifičnih protiteles je bil odkrit tudi med presaditvijo kože v možganski parenhim. Avtorji pregleda navajajo več hipotetičnih poti za transport antigenov iz možganov v limfni sistem. Ena od njih je prehod antigenov iz perivaskularnih prostorov v subarahnoidni prostor. Domneva se, da so perivaskularni prostori, lokalizirani vzdolž velikih možganskih žil, ekvivalent limfnega sistema v možganih. Druga pot leži vzdolž belih vlaken - skozi etmoidno kost v limfne žile nosne sluznice. Poleg tega je v dura mater obsežna mreža limfnih žil. Tudi neprepustnost krvno-možganske pregrade za limfocite je precej relativna. Dokazano je, da so aktivirani limfociti sposobni proizvajati encime, ki vplivajo na prepustnost struktur možganskega "imunskega filtra". Na ravni postkapilarnih venul aktivirani T-pomožni limfociti prodrejo skozi nepoškodovano krvno-možgansko pregrado. Teza o odsotnosti celic v možganih, ki predstavljajo antigene, ne vzdrži kritike. Trenutno je prepričljivo dokazana možnost predstavljanja antigenov v CNS z vsaj tremi vrstami celic. Prvič, to so dendritične celice, ki izvirajo iz kostnega mozga in so lokalizirane v možganih vzdolž velikih krvnih žil in v beli snovi. Drugič, antigeni so sposobni predstaviti endotelijske celice možganskih žil, kar v povezavi z antigeni MHC podpira klonsko rast celic T, specifičnih za te antigene. Tretjič, mikro- in astroglijske celice delujejo kot agensi, ki predstavljajo antigene. Astrociti sodelujejo pri nastanku imunskega odziva v centralnem živčnem sistemu in pridobijo lastnosti imunskih efektorskih celic ter izražajo številne antigene, citokine in imunomodulatorje. Ko so inkubirane z γ-interferonom (γ-INF), astroglijske celice in vitro izražajo antigene MHC razreda I in II, stimulirani astrociti pa so sposobni predstaviti antigene in vzdrževati klonsko proliferacijo limfocitov.

Travma možganskega tkiva, pooperativno vnetje, edem in fibrinski depoziti, ki spremljajo presaditev embrionalnega živčnega tkiva, ustvarjajo pogoje za povečano prepustnost krvno-možganske pregrade z oslabljeno avtotoleranco, senzibilizacijo in aktivacijo limfocitov CD3+CD4+. Predstavitev avto- in aloantigenov izvajajo astrociti in mikroglialne celice, ki se na y-INF odzivajo z izražanjem molekul MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulatornih molekul B7-1 (CD80) in B7-2 (CD86), pa tudi z izločanjem IL-la, IL-ip in y-INF.

Posledično dejstva daljšega preživetja embrionalnega živčnega tkiva po intracerebralni presaditvi kot po periferni aplikaciji težko povežemo z odsotnostjo začetka imunosti pri presaditvi. Poleg tega imajo monociti, aktivirani limfociti (citotoksične CD3+CD8+ in T-pomožne celice) in citokini, ki jih proizvajajo, ter protitelesa proti antigenom perifernega presadka embrionalnega živčnega tkiva pomembno vlogo v procesu njegove zavrnitve. Nizka raven izražanja molekul MHC v embrionalnem živčnem tkivu je pomembna pri ustvarjanju pogojev za daljšo odpornost nevrotransplantatov na imunske procese T-celic. Zato se v poskusu imunsko vnetje po presaditvi embrionalnega živčnega tkiva v možgane razvija počasneje kot po presaditvi kože. Kljub temu pa po 6 mesecih opazimo popolno uničenje posameznih presadkov živčnega tkiva. V tem primeru so T-limfociti, omejeni z antigeni MHC razreda II, pretežno lokalizirani v območju presaditve (Nicholas et al., 1988). Eksperimentalno je bilo ugotovljeno, da med ksenološko nevrotransplantacijo izčrpavanje T-pomožnih celic (L3T4+), ne pa tudi citotoksičnih T-limfocitov (Lyt-2), podaljša preživetje živčnega tkiva podgan v možganih prejemnih miši. Zavrnitev nevrotransplantata spremlja njegova infiltracija z gostiteljskimi makrofagi in T-limfociti. Posledično gostiteljski makrofagi in aktivirane mikroglialne celice delujejo in situ kot imunostimulirajoče celice, ki predstavljajo antigen, povečana ekspresija donorskih antigenov MHC razreda I pa poveča ubijalsko aktivnost prejemnih citotoksičnih T-limfocitov.

Ni smiselno analizirati številnih špekulativnih poskusov, da bi dejstvo zavrnitve nevrotransplantata pojasnili z reakcijo imunskega sistema prejemnika na endotelijske celice ali glialne elemente darovalca, saj so celo čiste linije nevronskih progenitorskih celic podvržene imunskemu napadu. Omeniti velja, da ima izražanje Fas ligandov s strani možganskih celic, ki se vežejo na apoptozne receptorje (molekule Fas) na limfocitih T, ki infiltrirajo možgane, in sprožijo njihovo apoptozo, pomembno vlogo v mehanizmih daljšega preživetja presadka znotraj osrednjega živčevja, kar je tipičen zaščitni mehanizem transbariernih avtoimunogenih tkiv.

Kot pravilno ugotavljajo V. Tsymbalyuk in soavtorji (2001), je za presaditev embrionalnega živčnega tkiva značilen razvoj vnetja s sodelovanjem celic, senzibiliziranih na možganske antigene in aktivirane celice, protitelesa, pa tudi kot posledica lokalne proizvodnje citokinov. Pomembno vlogo pri tem ima že obstoječa senzibilizacija telesa na možganske antigene, ki se pojavi med razvojem bolezni osrednjega živčevja in je lahko usmerjena na antigene presadka. Zato se resnično dolgoročno preživetje histioinkompatibilnih nevrotransplantatov doseže le z zaviranjem imunskega sistema s ciklosporinom A ali z vnosom monoklonskih protiteles v limfocite CD4+ prejemnika.

Tako ostaja veliko težav nevrotransplantacije nerešenih, vključno s tistimi, povezanimi z imunološko združljivostjo tkiv, ki jih je mogoče rešiti le po ciljno usmerjenih temeljnih in kliničnih raziskavah.