Krvotvorne matične celice iz popkovnične krvi

Popkovnična kri je dober vir hematopoetskih matičnih celic glede na proliferativni potencial in sposobnost repopulacije hematopoetskih celic. Večkrat je bilo dokazano, da popkovnična kri do rojstva vsebuje dovolj veliko število šibko vezanih hematopoetskih progenitorskih celic. Nekateri avtorji menijo, da je prednost presaditve hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi odsotnost potrebe po iskanju darovalca, ki je združljiv z antigeni HLA. Po njihovem mnenju nezrelost imunskega sistema novorojenčka povzroča zmanjšano funkcionalno aktivnost imunokompetentnih celic in posledično manjšo pojavnost hude bolezni presadka proti gostitelju kot pri presaditvi kostnega mozga. Hkrati stopnja preživetja presaditve celic popkovnične krvi ni nižja od stopnje preživetja celic kostnega mozga, tudi če se uporabi manjše število HSC, apliciranih na 1 kg telesne teže bolnika. Vendar pa po našem mnenju vprašanja optimalnega števila presajenih celic popkovnične krvi, potrebnih za učinkovito vcepitev v telo prejemnika, njihova imunološka združljivost in številni drugi vidiki problema presaditve hematopoetskih matičnih celic popkovnične krvi zahtevajo resnejšo analizo.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Pridobivanje hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi

Postopek pridobivanja hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi zahteva njen odvzem takoj po rojstvu otroka in njeno ločitev od posteljice, ko je posteljica v maternici ali zunaj maternice, pa tudi med carskim rezom, pa tudi zunaj maternice. Dokazano je, da če se čas od trenutka rojstva do ločitve novorojenčka od posteljice skrajša na 30 sekund, se volumen pridobljene popkovnične krvi poveča v povprečju za 25–40 ml. Če se ta postopek izvede kasneje, se izgubi enaka količina krvi. Ugotovljeno je bilo, da zgodnja ločitev otroka od posteljice ne povzroča nobenih negativnih posledic za novorojenčka.

Ruski raziskovalni inštitut za hematologijo in transfuziologijo je razvil učinkovite in cenovno ugodne tehnologije za pridobivanje popkovnične krvi tako med normalnim porodom ((70,2+25,8) ml) kot carskim rezom ((73,4+25,1) ml). Predlagana je bila metoda za ločevanje popkovnične krvi z dovolj visokim izkoristkom jedrnih in mononuklearnih celic - (83,1+9,6) oziroma (83,4+14,1) %. Izboljšana je bila metoda za kriokonzervacijo popkovnične krvi, ki zagotavlja visoko ohranitev mononuklearnih celic in CFU-GM - (96,8+5,7) oziroma (89,6+22,6) %. Določena je bila učinkovitost drenažne metode za odvzem popkovnične krvi z uporabo posode Kompoplast-300 (Rusija). Avtorji so popkovnično kri odvzeli takoj po rojstvu otroka in njegovi ločitvi od posteljice, v pogojih namestitve posteljice in utero ali ex utero. Pred punkcijo popkovnične vene je bila popkovina enkrat obdelana s 5 % jodovo tinkturo in nato dvakrat s 70 % etilnim alkoholom. Kri je spontano odtekla skozi povezovalne cevke v posodo. Postopek odvzema ni trajal več kot 10 minut. Povprečna prostornina 66 vzorcev popkovnične krvi, odvzetih z drenažo, je bila (72 + 28) ml, število levkocitov v povprečnem skupnem volumnu vzorca pa (1,1 + 0,6) x 107. Pri analizi popkovnične krvi na sterilnost (bakterijska kontaminacija, HIV-1, virusi hepatitisa B in C, sifilis in okužba s citomegalovirusom) so bila protitelesa IgG proti virusu hepatitisa C odkrita le v enem vzorcu. V drugi študiji je bila posteljica takoj po rojstvu s plodno površino navzdol nameščena na poseben okvir, popkovina pa je bila obdelana s 5 % raztopino joda in 75 % etilnim alkoholom. Popkovnična vena je bila izpraznjena z iglo iz transfuzijskega sistema (G16). Kri je spontano odtekla v posodo. Povprečna prostornina tako odvzete krvi je bila (55 + 25) ml. V delu G. Koglerja in sod. (1996) je bila popkovnična kri odvzeta z zaprto metodo in pridobljene so bile velike količine krvi - v povprečju (79+26) ml. Avtorji ugotavljajo, da je med 574 vzorci popkovnične krvi približno 7 % vsebovalo manj kot 40 ml krvi, kar jih ne omogoča uporabe za presaditev. K. Isoyama in sod. (1996) so z odvzemom popkovnične krvi z aktivnim iztiskanjem z brizgami dobili povprečno 69,1 ml krvi (volumen popkovnične krvi se je gibal od 15 do 135 ml). Nazadnje je A. Abdel-Mageed PI in sod. (1997) s kateterizacijo popkovnične vene uspelo pridobiti povprečno 94 ml popkovnične krvi (od 56 do 143 ml).

Za zmanjšanje tveganja jatrogene okužbe in kontaminacije z materinimi izločki je bil razvit zaprt sistem za odvzem krvi, ki temelji na široko uporabljenem transfuzijskem sistemu podjetja Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (ZDA), in vsebuje 62,5 ml CPDA (citrat-fosfat-dekstroza z adeninom) kot antikoagulanta. Tehnologija pridobivanja materiala je primarnega pomena za pripravo visokokakovostnega vzorca glede na prostornino, vsebino in čistost celične suspenzije. Od obstoječih metod za odvzem popkovnične krvi, ki jih običajno razvrščamo v zaprte, polodprte in odprte sisteme, je treba dati prednost prvi, saj zaprti sistem znatno zmanjša tveganje za mikrobno kontaminacijo materiala, pa tudi kontaminacijo celične suspenzije z materinimi celicami.

A. Nagler in sodelavci (1998) so izvedli primerjalno analizo učinkovitosti vseh treh sistemov za odvzem popkovnične krvi. V prvi varianti je bil postopek izveden v zaprtem sistemu z eksfoliacijo krvi neposredno v posodo. V drugi varianti je bila popkovnična kri pridobljena z aktivnim izločanjem krvi z brizgo MP1, ki mu je sledilo izpiranje placentalnih ven in sočasno drenaža krvi v posodo (odprta metoda). V tretji varianti je bila kri odvzeta v polodprtem sistemu z aktivnim izločanjem z brizgami in izpiranjem skozi popkovnično arterijo s sočasnim izločanjem v posodo. V prvi varianti so avtorji pridobili popkovnično kri v volumnu (76,4+32,1) ml z vsebnostjo levkocitov (10,5+3,6) x 106 ^v 1 ml krvi. V drugi varianti so bili ustrezni kazalniki (174,4+42,8) ml in (8,8+3,4) x 106 ^/ ml; v tretjem - (173,7+41,3) ml in (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Najpogostejša okužba vzorcev popkovnične krvi je bila opažena pri uporabi odprtega sistema. Ugotovljena je bila neposredna povezava med maso posteljice in količino odvzete krvi - z naraščanjem mase posteljice se povečuje količina odvzete krvi.

Po odvzemu popkovnične krvi sledi faza ločevanja - izolacija mononuklearnih celic in čiščenje celične suspenzije iz eritrocitov. V eksperimentalnih pogojih se jedrne celice izolirajo s sedimentacijo z metilcelulozo med lizo eritrocitov z amonijevim kloridom. Vendar se metilceluloza ne sme uporabljati v klinične namene, saj izgube hematopoetskih matičnih celic na njej dosežejo 50–90 %. Liza eritrocitov se v kliniki zaradi velikih količin delovne raztopine skoraj nikoli ne izvaja, čeprav je odstotek izolacije jedrnih celic s fenotipom CD34+, pa tudi progenitorskih celic s funkcijama CFU-GM in CFU-GEMM na ta način, bistveno višji. Poroča se o pojavu novega sredstva za izolacijo mononuklearnih celic v gradientu gostote, raztopine buyant density (BDS72). Ta snov ima naslednje fiziološke parametre: pH - 7,4, osmolalnost - 280 mOsm/kg, gostota - 1,0720 g/ml. Po mnenju avtorjev se lahko z njim izolira do 100 % celic, pozitivnih na CD34, in odstrani 98 % eritrocitov. Vendar se BDS72 v kliniki še ne uporablja.

Pri odobrenih metodah izolacije jedrnih celic iz popkovnične krvi se običajno uporablja 10-odstotna raztopina hidroksietil škroba ali 3-odstotna raztopina želatine. Učinkovitost sedimentacije eritrocitov in izolacije jedrnih celic je v obeh primerih približno enaka. Vendar pa je pri uporabi želatine kot sedimentacijskega sredstva mogoče dobiti nekoliko večjo količino CFU-GM kot pri uporabi hidroksietil škroba. Domneva se, da so razlike v učinkovitosti izolacije CFU-GM posledica različnih hitrosti sedimentacije posameznih frakcij jedrnih celic ali sposobnosti molekul hidroksietil škroba, da se absorbirajo na površino receptorjev hematopoetskih celic in s tem blokirajo njihovo občutljivost na faktorje, ki stimulirajo kolonije, ki se uporabljajo pri gojenju CFU-GM in vitro. Kljub temu sta oba sedimentatorja lahko primerna za izolacijo jedrnih celic pri ustvarjanju velikih bank popkovnične krvi.

Metode ločevanja in krioprezervacije popkovnične krvi se v osnovi ne razlikujejo od tistih, ki se uporabljajo pri delu s hematopoetskimi matičnimi celicami periferne krvi in kostnega mozga odraslih darovalcev. Pri pripravi velikega števila vzorcev popkovnične krvi za njene banke pa morajo biti metode ločevanja najprej cenovno ugodne. Zato se trenutno za klinične potrebe žal uporabljajo že preizkušene rutinske metode izolacije in krioprezervacije celic popkovnične krvi, pri čemer so učinkovitejše, a drage metode še vedno usoda eksperimentatorjev.

Na splošno so bila odobrena merila za oceno števila hematopoetskih celic in zahteve za pregled vzorcev popkovnične krvi za identifikacijo povzročiteljev okužb. Da bi zagotovili varnost presaditve hematopoetskih celic iz popkovnične krvi, je treba vse vzorce krvi pregledati predvsem na hematogeno prenesene okužbe in genetske bolezni. Številni avtorji priporočajo dodatne posebne metode za pregled popkovnične krvi za diagnosticiranje genetskih bolezni, kot so a-talasemija, srpastocelična anemija, pomanjkanje adenozin deaminaze, Brutonova agamaglobulinemija, Hurlerjeva in Ponterjeva bolezen.

Po priporočilih L. Tichelija in soavtorjev (1998) je treba vsak vzorec popkovnične krvi testirati na jedrne celice, CD34-pozitivne celice in CFU-GM, opraviti HLA tipizacijo in določiti krvno skupino po ABO in njenem Rh faktorju. Poleg tega je treba opraviti bakteriološko kulturo, serološko testiranje na okužbo z virusom HIV in citomegalovirusom, HBsAg, virusni hepatitis C, HTLY-I in HTLV-II (humano T-celično levkemijo), sifilis in toksoplazmozo. Obvezna je verižna reakcija s polimerazo za citomegalovirus in okužbo z virusom HIV.

Postopek pridobivanja popkovnične krvi je treba izvajati v strogem skladu z načeli medicinske bioetike. Pred odvzemom krvi je potrebno pridobiti soglasje nosečnice za izvedbo. Predhodni pogovor z nosečnico za pridobitev informiranega soglasja za vse manipulacije, od eksplozije krvi do izpolnjevanja dokumentacije, izvajajo samo zdravstveni delavci. V nobenem primeru ni dovoljeno, da kateri koli od teh postopkov izvaja osebje z biološko, kemijsko, farmacevtsko ali drugo nemedicinsko izobrazbo, zaradi kršitve ustaljenih norm bioetike in človekovih pravic. V primeru pozitivnih testov za nosilstvo HBsAg, prisotnosti protiteles proti povzročiteljem hepatitisa C, okužbe z virusom HIV in sifilisa se popkovnična kri ne odvzame, vzorci že odvzete krvi pa se zavrnejo in uničijo. Treba je opozoriti, da je nosilstvo latentnih okužb pri novorojenčkih veliko manj pogosto kot pri odraslih, zato je verjetnost hematogenega prenosa in razvoja infekcijskih zapletov med infuzijami hematopoetskih celic iz popkovnične krvi bistveno manjša kot v primeru uporabe kostnega mozga odraslega darovalca za presaditev.

Pomemben vidik klinične uporabe popkovnične krvi je vrednotenje presaditve, ki temelji na določanju količine hematopoetskih matičnih celic v vzorcu popkovnične krvi in odmerkov celic, potrebnih za presaditev. Trenutno standardi za optimalno količino celic popkovnične krvi, potrebnih za presaditev, še niso razviti. Ni splošno sprejetega stališča niti o rutinskih parametrih, kot sta število CD34-pozitivnih celic in CFU-GM. Nekateri avtorji ocenjujejo potencial hematopoetskih celic z analizo dolgotrajnih kultur z določanjem vsebnosti kolonijskih enot, skupnih granulocitom, eritrocitom, monocitom in megakariocitom - CFU-GEMM.

Vendar pa v kliničnem okolju standardna ocena presaditve popkovnične krvi običajno vključuje le določitev števila jedrnih ali mononuklearnih celic.

Shranjevanje hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi

Pri tehnologiji shranjevanja hematopoetskih celic popkovnične krvi obstajajo tudi nekatere težave. Pri krioprezervaciji hematopoetskih matičnih celic je za dosego optimalnega načina zamrzovanja potrebno čim bolj zmanjšati volumen popkovnične krvi in tudi vnaprej odstraniti eritrocite, da se izognemo hemolizi in tveganju za razvoj reakcije nekompatibilnosti za eritrocitne antigene (ABO, Rh). Za te namene so primerne različne metode izolacije jedrnih celic. V zgodnjih 90. letih prejšnjega stoletja je bila najpogosteje uporabljena metoda izolacija jedrnih celic v gradientu gostote na osnovi Ficolla z gostoto 1,077 g/ml ali Percolla z gostoto 1,080 g/ml. Ločevanje popkovnične krvi v gradientu gostote omogoča izolacijo pretežno mononuklearnih celic, vendar vodi do znatnih izgub hematopoetskih progenitorskih celic - do 30-50 %.

Učinkovitost sedimentacije hidroksietil škroba v procesu izolacije hematopoetskih celic iz popkovnične krvi se ocenjuje različno. Nekateri avtorji opozarjajo na nizko kakovost ločevanja s to metodo, medtem ko drugi raziskovalci, nasprotno, med vsemi možnimi metodami dajejo prednost izolaciji HSC iz popkovnične krvi z uporabo 6 % raztopine hidroksietil škroba. Hkrati se poudarja visoka učinkovitost sedimentacije hematopoetskih celic, ki po nekaterih podatkih dosega od 84 % do 90 %.

Zagovorniki drugačnega stališča menijo, da so praktično vse metode frakcioniranja povezane z velikimi izgubami jedrnih celic, in predlagajo ločevanje s centrifugiranjem, pri čemer se popkovnična kri razdeli na 3 frakcije: eritrocite, levkocitni obroč in plazmo. Z izolacijo celic na ta način so avtorji ugotovili, da je vsebnost mononuklearnih celic, zgodnjih hematopoetskih progenitorskih celic in celic z imunofenotipom CD34+ na koncu znašala 90, 88 oziroma 100 % začetne ravni. Podobne vrednosti za povečanje števila celic popkovnične krvi, prečiščenih s to metodo, so dobili tudi drugi raziskovalci: po sedimentaciji je bilo izoliranih 92 % jedrnih celic, 98 % mononuklearnih celic, 96 % CD34-pozitivnih celic in 106 % enot, ki tvorijo kolonije.

V poznih devetdesetih letih prejšnjega stoletja se je želatina pogosto uporabljala kot sedimentacijsko sredstvo. V klinični praksi se želatina za izolacijo hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi uporablja od leta 1994. Pri uporabi 3-odstotne raztopine želatine učinkovitost izolacije jedrnih celic doseže 88–94 %. Obsežna uporaba želatine pri ustvarjanju banke popkovnične krvi je potrdila njene prednosti pred drugimi sedimentacijskimi sredstvi. Primerjalna analiza učinkovitosti vseh zgoraj omenjenih metod za izolacijo jedrnih celic pod pogoji njihove zaporedne uporabe na vsakem od testiranih vzorcev popkovnične krvi je dokazala, da je 3-odstotna raztopina želatine optimalno sedimentacijsko sredstvo glede na izkoristek mononuklearnih celic s fenotipom CD34+/CD45+, pa tudi glede na število CFU-GM in CFU-GEMM. Metode z uporabo gradienta gostote Ficoll ter uporaba hidroksietil škroba in metilceluloze so bile bistveno manj učinkovite, saj so izgube hematopoetskih celic dosegle 60 %.

Širitev obsega presaditev matičnih celic popkovnične krvi ni povezana le z razvojem metod za njihovo pridobivanje, temveč tudi s shranjevanjem. Obstaja veliko težav, ki so neposredno povezane s pripravo popkovnične krvi za dolgotrajno shranjevanje in izbiro optimalne tehnologije za kriokonzervacijo njenih vzorcev. Med njimi so vprašanja izvedljivosti izvajanja ločevalnih postopkov, uporabe različnih medijev za kriokonzervacijo in uporabe metod za pripravo odmrznjenih celic za presaditev. Prevoz vzorcev nativne popkovnične krvi se pogosto izvaja iz regij, oddaljenih od hematoloških centrov. V zvezi s tem se pojavlja problem sprejemljivih obdobij shranjevanja popkovnične krvi od trenutka njenega pridobivanja do začetka kriokonzervacije, kar je še posebej pomembno pri ustvarjanju bank popkovnične krvi.

Študija funkcionalne aktivnosti hematopoetskih celic v popkovnični krvi po dolgotrajnem shranjevanju (do 12 let) v tekočem dušiku je pokazala, da približno 95 % hematopoetskih celic v tem obdobju ne izgubi svoje visoke proliferativne sposobnosti. V delu S. Yurasova in soavtorjev (1997) je bilo dokazano, da shranjevanje popkovnične krvi pri sobni temperaturi (22 °C) oziroma pri 4 °C 24 oziroma 48 ur bistveno ne zmanjša viabilnosti hematopoetskih celic, ki znaša 92 oziroma 88 % začetne ravni. Če pa se obdobje shranjevanja podaljša na tri dni, se število živih jedrnih celic v popkovnični krvi znatno zmanjša. Hkrati so druge študije pokazale, da pri shranjevanju 2–3 dni pri 22 ali 4 °C najprej trpi viabilnost zrelih granulocitov in ne hematopoetskih celic.

Na sposobnost preživetja hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi lahko negativno vplivajo komponente sistemov za odvzem popkovnične krvi. Analiza učinka različnih antikoagulantov, katerih mehanizem delovanja je posledica vezave kalcijevih ionov (ACD, EDTA, XAPD-1) na hematopoetske progenitorske celice v pogojih shranjevanja popkovnične krvi od 24 do 72 ur, je pokazala njihov negativen vpliv na sposobnost preživetja jedrnih celic. V zvezi s tem avtorji priporočajo uporabo PBS (raztopine fosfatnega pufra) z dodatkom nativnega heparina brez konzervansa v koncentraciji 20 U/ml, kar po njihovem mnenju omogoča podaljšanje obdobja shranjevanja nefrakcionirane popkovnične krvi na 72 ur in ohranja funkcionalno aktivnost enot, ki tvorijo kolonije. Vendar pa je študija varnosti CFU-GM in CFU-G pokazala, da čas shranjevanja popkovnične krvi pred krioprezervacijo ne sme presegati devetih ur. Očitno je, da bi v tem primeru moralo veljati načelo, da je treba v primeru nasprotujočih si podatkov uporabiti najkrajše priporočeno obdobje shranjevanja popkovnične krvi in čim prej začeti s programiranim zamrzovanjem izoliranih celic.

Pri zamrzovanju hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi se kot krioprotektant običajno uporablja 10-odstotna raztopina DMSO. Vendar pa ima dimetilsulfoksid v takšni koncentraciji poleg izrazitega krioprotektivnega učinka tudi neposreden citotoksični učinek, tudi pri minimalni izpostavljenosti hematopoetskim celicam iz popkovnične krvi. Za zmanjšanje citotoksičnega učinka DMSO se uporablja ničelna temperatura izpostavljenosti, poveča se hitrost vseh manipulacij in po odtajanju vzorcev popkovnične krvi se izvede večkratno izpiranje.

Inštitut za hematologijo in transfuziologijo Akademije medicinskih znanosti Ukrajine od leta 1995 razvija znanstveno smer, katere cilj je celovito preučevanje popkovnične krvi kot alternativnega vira hematopoetskih matičnih celic. Razvite so bile zlasti nove tehnologije za nizkotemperaturno krioprezervacijo hematopoetskih celic nefrakcionirane in frakcionirane popkovnične krvi. Kot krioprotektant se uporablja nizkomolekularni medicinski polivinilpirolidon. Metoda krioprezervacije nefrakcionirane popkovnične krvi temelji na originalni tehnologiji za predhodno pripravo celic za zamrzovanje in metodi za posebno obdelavo celične suspenzije tik pred presaditvijo.

Eden najpomembnejših dejavnikov, ki vplivajo na raven funkcionalne aktivnosti krioprezerviranih hematopoetskih matičnih celic, je hitrost ohlajanja celične suspenzije, zlasti med fazo kristalizacije. Programski pristop k reševanju problema hitrosti in časa zamrzovanja ponuja velike možnosti za ustvarjanje preprostih in zelo učinkovitih metod krioprezervacije, brez izpiranja celične suspenzije iz krioprotektorjev pred presaditvijo.

Najbolj nevarni fazi za sposobnost preživetja celic med njihovo pripravo sta fazi neposrednega zamrzovanja in odmrzovanja. Pri zamrzovanju hematopoetskih celic se lahko znaten del le-teh uniči v trenutku prehoda medceličnega medija iz tekoče v trdno fazo – kristalizacije. Za zmanjšanje odstotka celične smrti se uporabljajo krioprotektorji, katerih mehanizmi delovanja in krioprotektivna učinkovitost so v znanstveni literaturi dovolj obravnavani.

Obetavna smer za optimizacijo metod krioprezervacije celic kostnega mozga in popkovnične krvi je kombinacija nizkih koncentracij več krioprotektorjev z različnimi mehanizmi delovanja v eni raztopini, na primer DMSO, ki deluje na znotrajcelični ravni, in hidroksietil škroba ali albumina, ki imata zunajcelični zaščitni učinek.

Za kriokonzervacijo celic popkovnične krvi se tradicionalno uporablja 20-odstotna raztopina DMSO, ki jo počasi vlijemo v celično suspenzijo ob stalnem mehanskem mešanju v ledeni kopeli, dokler ne dosežemo enakega razmerja (1:1) med volumnom krioprotektanta in celične suspenzije. Končna koncentracija dimetil sulfoksida je 10 %. Celično suspenzijo nato ohladimo v programirani kriogeni enoti s hitrostjo GS/min na -40 °C, nakar se hitrost ohlajanja poveča na 10 °C/min. Po dosegu -100 °C posodo s celično suspenzijo postavimo v tekoči dušik (-196 °C). S to tehniko kriokonzervacije ohranitev funkcionalno aktivnih mononuklearnih celic po odtajanju doseže 85 % prvotne ravni.

Spremembe metod krioprezervacije so namenjene zmanjšanju koncentracije DMSO z dodajanjem hidroksietil škroba (končni koncentraciji dimetil sulfoksida in hidroksietil škroba sta 5 oziroma 6 %). Visoka učinkovitost takšne kombinacije krioprotektorjev je opažena pri zamrzovanju suspenzije mieloidnih celic in pri nič manjši citoprotekciji kot pri uporabi le 10 % raztopine dimetil sulfoksida. Število živih jedrnih celic je doseglo 96,7 % začetne ravni, njihova funkcionalna aktivnost, ocenjena s številom CFU-GM, pa je bila 81,8 %.

Pri uporabi raztopine dimetilsulfoksida v koncentracijah od 5 do 10 % v kombinaciji s 4 % hidroksietil škrobom (končna koncentracija) je bilo ugotovljeno, da varnost CD34-pozitivnih celic v takšnih območjih dimetilsulfoksida ostane praktično nespremenjena. Hkrati pa pri zmanjšanju koncentracije dimetilsulfoksida s 5 na 2,5 % opazimo množično smrt celic popkovnične krvi – število živih celičnih enot se zmanjša z 85,4 na 12,2 %. Tudi drugi avtorji so prišli do zaključka, da prav 5 in 10 % raztopine dimetilsulfoksida (v avtorjevi različici – v kombinaciji z avtolognim serumom) zagotavljajo citoprotekcijo z največjo učinkovitostjo med krioprezervacijo HSC popkovnične krvi. Poleg tega je visoka ohranitev zaporedno zamrznjenih in odtajanih celic opažena v primeru kombinacije 5 ali 10 % dimetilsulfoksida s 4 % raztopino hidroksietil škroba, zlasti pri nadzorovani hitrosti ohlajanja GS/min. V drugi študiji je bila uporabljena krioprotektivna raztopina, sestavljena iz treh sestavin - DMSO, prečiščenega humanega albumina in medija RPMI v razmerju 1:4:5, ki je bila dodana celični suspenziji v enakem volumskem razmerju (končna koncentracija dimetil sulfoksida je bila 5 %). Po odtajanju v vodni kopeli pri temperaturi +4 GS je ohranjenost CFU-GM presegla 94 %.

Nekateri avtorji predlagajo uporabo nefrakcionirane popkovnične krvi za kriokonzervacijo, saj se med postopkom odstranjevanja rdečih krvničk izgubijo znatne količine hematopoetskih celic. Pri tej različici se za zaščito mononuklearnih celic pred škodljivimi učinki kriokristalizacije uporabi 10-odstotna raztopina dimetil sulfoksida. Zamrzovanje se izvaja s konstantno hitrostjo ohlajanja GS/min na -80 °C, nakar se suspenzija celic popkovnične krvi spusti v tekoči dušik. Ta metoda zamrzovanja povzroči delno lizo rdečih krvničk, zato vzorci krvi ne potrebujejo frakcioniranja. Po odtajanju se celična suspenzija spere iz prostega hemoglobina in dimetil sulfoksida v raztopini humanega albumina ali v bolnikovem avtolognem krvnem serumu ter se uporabi za presaditev.

Ohranjanje hematopoetskih progenitorskih celic po odtajanju nefrakcionirane popkovnične krvi je res boljše kot pri frakcionirani popkovnični krvi, vendar se zaradi kriostatnosti nekaterih eritrocitov lahko pojavijo resne težave po transfuziji zaradi transfuzije eritrocitov, ki niso združljivi z ABO. Poleg tega se volumen shranjene nefrakcionirane krvi znatno poveča. S kliničnega vidika je kriokonzervacija predhodno izoliranih in prečiščenih iz drugih celičnih frakcij hematopoetskih celic iz popkovnične krvi še vedno bolj zaželena.

Predvsem je bila razvita metoda za krioprezervacijo frakcioniranih celic popkovnične krvi, ki omogoča odstranitev eritrocitov v fazi priprave na zamrzovanje, pri kateri se kot del raztopine za nadomeščanje plazme "Stabiloz" uporablja 6-odstotna raztopina hidroksietil škroba. Po odtajanju je tako pridobljena celična suspenzija pripravljena za klinično uporabo brez dodatnih manipulacij.

Trenutno obstaja veliko precej učinkovitih metod kriokonzervacije popkovnične krvi. Njihova temeljna razlika je v tem, da se vzorci krvi zamrznejo nefrakcionirani ali pa se v fazi priprave ločijo na celične frakcije, pripravijo pa se celice z jedrom brez primesi eritrocitov.

Presaditev hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi

Konec osemdesetih in zgodnjih devetdesetih let prejšnjega stoletja je bilo ugotovljeno, da ima popkovnična kri, ki plodu zagotavlja življenjsko podporo med nosečnostjo, visoko vsebnost hematopoetskih matičnih celic. Relativna enostavnost pridobivanja celic popkovnične krvi in odsotnost očitnih etičnih težav sta prispevala k uporabi matičnih celic popkovnične krvi v praktični medicini. Prva uspešna presaditev popkovnične krvi otroku z anemijo Fanconi je služila kot izhodišče za povečanje obsega presaditev matičnih celic popkovnične krvi in vzpostavitev sistema za njeno shranjevanje. V svetovnem sistemu bank popkovnične krvi je največji New York Placental Blood Center, ki je v bilanci stanja ameriškega Nacionalnega inštituta za zdravje. Število shranjenih vzorcev popkovnične krvi v tej banki se približuje 20.000. Narašča tudi število prejemnikov (večinoma otrok), ki so uspešno opravili presaditev. Po podatkih ameriškega ministrstva za zdravje obdobje brez ponovitve bolezni pri prejemnikih presajene popkovnične krvi po presaditvi že presega 10 let.

To ni presenetljivo, saj so številne študije hematopoetskega potenciala popkovnične krvi pokazale, da po količini in kakovosti najzgodnejših matičnih celic ne le ni slabša od kostnega mozga odrasle osebe, temveč ga v nekaterih pogledih celo presega. Višji proliferativni potencial matičnih celic popkovnične krvi je posledica ontogenetskih značilnosti celične signalizacije, prisotnosti receptorjev za specifične rastne faktorje na HSC, sposobnosti celic popkovnične krvi za avtokrino proizvodnjo rastnih faktorjev ter velike velikosti in dolžine telomerov.

Tako genomske in fenotipske značilnosti hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi vnaprej določajo visokokakovostno presaditev presadka z visokim potencialom za obnovitev hematopoeze darovalca v telesu prejemnika.

Prednosti hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi

Med resničnimi prednostmi uporabe hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi za presaditev v primerjavi z drugimi viri hematopoetskih celic velja omeniti praktično ničelno tveganje za zdravje darovalca (če ne upoštevamo posteljice kot take) in odsotnost potrebe po splošni anesteziji. Uporaba popkovnične krvi širi možnosti presaditve celic zaradi delno HLA-združljivih presadkov (nezdružljivost od enega do treh antigenov). Razvita je bila metoda za dolgotrajno shranjevanje hematopoetskih celic iz popkovnične krvi v zamrznjenem stanju, ki povečuje verjetnost pridobitve redkih HLA tipov in skrajša čas iskanja HLA-združljivega presadka za alogensko presaditev. Hkrati se znatno zmanjša tveganje za razvoj nekaterih latentnih okužb, ki se prenašajo na transmisivne načine. Poleg tega se zaradi možnosti uporabe celic iz popkovnične krvi za avtologno presaditev pojavi poceni oblika biološkega življenjskega zavarovanja.

Vendar pa zaradi majhnih količin krvi, ki jih je mogoče odvzeti iz posteljice (v povprečju ne več kot 100 ml), pride v ospredje problem pridobivanja največje možne količine krvi iz popkovnične vene ob strogem upoštevanju pogoja minimalnega tveganja bakterijske kontaminacije pridobljenih vzorcev popkovnične krvi.

Primitivne hematopoetske celice iz popkovnične krvi običajno identificiramo po prisotnosti glikofosfoproteina CD34 na njihovi površini, pa tudi na podlagi njihovih funkcionalnih lastnosti s preučevanjem klonogenosti ali nastajanja kolonij in vitro. Primerjalna analiza je pokazala, da je v popkovnični krvi in kostnem mozgu največja vsebnost CD34-pozitivnih celic v mononuklearni frakciji 1,6 oziroma 5,0 %, največja raven enot, ki tvorijo kolonije, v subpopulaciji celic CD34+ je 80 oziroma 25 %, skupna učinkovitost kloniranja celic CD34+ je 88 oziroma 58 %, največja vsebnost celic, ki tvorijo kolonije, z visokim proliferacijskim potencialom (HPP-CFC v populaciji CD34+), pa je 50 oziroma 6,5 %. Dodati je treba, da sta učinkovitost kloniranja celic CD34+CD38 in sposobnost odzivanja na stimulacijo citokinov prav tako višji pri hematopoetskih matičnih celicah iz popkovnične krvi.

Kombinacija fenotipskih antigenov Thy-1, CD34 in CD45RA potrjuje visok proliferativni potencial hematopoetskih celic iz popkovnične krvi, izražanje teh treh antigenov na površini celic iz popkovnične krvi pa kaže na njihovo pripadnost matičnim celicam. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da popkovnična kri vsebuje celice s fenotipom CD34+, ki nimajo markerjev linearne diferenciacije. Raven celičnih subpopulacij s fenotipskim profilom CD34+/Lin v popkovnični krvi znaša približno 1 % celotnega števila CD34-pozitivnih celic. Hematopoetske progenitorske celice iz popkovnične krvi dajejo izvor tako limfoidni celični liniji kot pluripotentni mieloidni seriji linearne celične diferenciacije, kar prav tako kaže na njihovo pripadnost matičnim celicam.

Kot smo že omenili, so pomembne razlike med kostnim mozgom in popkovnično krvjo v količini hematopoetskih celic, uporabljenih za presaditev, pridobljenih med enim postopkom odvzema. Če je med presaditvijo kostnega mozga izguba celične mase med ločevanjem, krioprezervacijo, odtajanjem in testiranjem sprejemljiva v okviru 40-50 %, so pri popkovnični krvi takšne izgube celic zelo pomembne, saj se lahko presaditev, če se uporabi nezadostna količina HSC, izkaže za neučinkovito. Po podatkih G. Koglerja in sodelavcev (1998) so lahko pri presaditvi celic s telesno težo prejemnika 10 kg vsi vzorci popkovnične krvi potencialni presadki (skupno število zbranih vzorcev popkovnične krvi je 2098), s telesno težo 35 kg - 67 %, le 25 % vzorcev pa lahko zagotovi učinkovito presaditev pri bolnikih s telesno težo 50-70 kg. Ta klinična situacija kaže na potrebo po optimizaciji in izboljšanju učinkovitosti obstoječih metod zbiranja, reprodukcije in shranjevanja celic popkovnične krvi. Zato se v literaturi trenutno veliko razpravlja o vprašanjih standardizacije metod zbiranja, testiranja, ločevanja in krioprezervacije popkovnične krvi za ustvarjanje krvnih bank, njeni uporabi v kliniki ter določanju pogojev in rokov shranjevanja hematopoetskih matičnih celic popkovnične krvi.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Uporaba hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi v medicini

^{Običajno je iz popkovnične krvi mogoče izolirati do 10⁶} hematopoetskih matičnih celic, redko več. V zvezi s tem ostaja odprto vprašanje, ali je takšna količina hematopoetskih celic iz popkovnične krvi zadostna za obnovitev hematopoeze pri odraslem prejemniku. Mnenja o tej zadevi so deljena. Nekateri raziskovalci menijo, da je takšna količina povsem zadostna za presaditev otrokom, vendar premajhna za presaditev odrasli osebi, za katero je optimalna količina vnos (7–10) x 10⁶ ^CD34 -pozitivnih celic na 1 kg telesne teže – povprečno 7 x 10⁶ ^na presaditev. Iz teh izračunov sledi, da en vzorec popkovnične krvi vsebuje 700-krat manj hematopoetskih matičnih celic, kot jih je potrebnih za eno presaditev odraslemu bolniku. Vendar pa je takšna kvantitativna ocena opravljena po analogiji s številom transfuziranih celic kostnega mozga in sploh ne upošteva ontogenetskih značilnosti hematopoeze.

Zlasti se prezre dejstvo večjega proliferativnega potenciala hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi v primerjavi s hematopoetskimi progenitornimi celicami iz kostnega mozga. Rezultati študij potenciala tvorbe kolonij in vitro kažejo, da je en odmerek popkovnične krvi sposoben zagotoviti rekonstitucijo hematopoeze odraslega prejemnika. Po drugi strani pa ne gre pozabiti, da se število matičnih celic iz popkovnične krvi zmanjšuje že med embrionalnim razvojem: vsebnost CD34-pozitivnih celic v popkovnični krvi se linearno zmanjša za 5-krat v obdobju od 20. tedna (kri za študijo je bila odvzeta med prezgodnjo prekinitvijo nosečnosti) do 40. tedna nosečnosti (obdobje fiziološkega poroda), kar spremlja vzporedno, trajno naraščajoče izražanje linearnih markerjev citodiferenciacije.

Zaradi pomanjkanja standardiziranega pristopa h kvantitativnemu določanju progenitorskih celic v vzorcih popkovnične krvi se razprave o optimalnem odmerku hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi nadaljujejo. Nekateri raziskovalci menijo, da se lahko kot merilo za izbiro vzorcev popkovnične krvi uporabi število jedrnih celic in mononuklearnih celic, preračunano na telesno težo prejemnika, torej njihov odmerek. Nekateri avtorji menijo, da je minimalni kvantitativni prag celic CD34+ tudi za avtotransplantacijo HSC 2 x 106 ^/ kg. Hkrati povečanje odmerka hematopoetskih celic na 5 x 106 ^celic /kg (le 2,5-krat) že zagotavlja ugodnejši potek zgodnjega obdobja po presaditvi, zmanjšuje pojavnost infekcijskih zapletov in skrajša trajanje preventivne antibiotične terapije.

Po E. Gluckmanu in sodelavcih (1998) je v onkohematologiji pogoj za uspešno presaditev celic popkovnične krvi vnos vsaj 3,7 x 10 ⁷ jedrnih celic na 1 kg telesne teže prejemnika. Ko se odmerek hematopoetskih matičnih celic zmanjša na 1 x 10 ⁷ ali manj jedrnih celic na 1 kg telesne teže bolnika, se tveganje za neuspeh presaditve in ponovitev krvnega raka močno poveča. Treba je vedeti, da minimalno število progenitorskih celic, potrebno za hitro obnovo hematopoeze po alotransplantaciji HSC, še ni znano. Teoretično je to mogoče doseči z eno celico, vendar je v klinični praksi presaditve kostnega mozga hitro in stabilno prijetje zagotovljeno s transfuzijo vsaj (1-3) x 10 ⁸ jedrnih celic na 1 kg telesne teže bolnika.

Nedavna podrobna študija za določitev optimalnega števila HSC v onkohematologiji je vključevala opazovanje bolnikov v tri skupine, razdeljene glede na vsebnost CD34-pozitivnih celic v presajenem materialu. Bolniki prve skupine so prejeli (3-5) x 10⁶ ^celic /kg. Odmerek HSC pri bolnikih druge skupine je bil (5-10) x 10⁶ ^celic /kg, bolniki tretje skupine pa so prejeli več kot 10 x 10⁶ ^CD34 + celic/kg. Najboljše rezultate so opazili v skupini prejemnikov, ki so prejeli presadek s številom CD34-pozitivnih celic, enakim (3-5) x 10⁶ ^/ kg. Z zvišanjem odmerka presajenih celic nad 5 x 10⁶ ^/ kg niso ugotovili statistično pomembnih prednosti. V tem primeru je zelo visoka vsebnost HSC v presadku (> 10 x 10⁶ ^/ kg) povezana z reinfuzijo znatnega števila preostalih tumorskih celic, kar vodi v ponovitev bolezni. Neposredna povezava med številom presajenih alogenskih progenitorskih celic in razvojem reakcije presadka proti gostitelju ni bila ugotovljena.

Nakopičene svetovne izkušnje s presaditvijo popkovnične krvi potrjujejo njen visok potencial za repopulacijo. Stopnja prijemanja presadka popkovnične krvi je povezana s številom vnesenih jedrnih celic. Najboljše rezultate opazimo pri presaditvi 3 x 10 ⁷ /kg, medtem ko je za kostni mozeg ta odmerek 2 x 10 ⁸ /kg. Po podatkih koordinacijskih centrov je bilo konec leta 2000 po vsem svetu opravljenih 1200 presaditev celic popkovnične krvi, predvsem od sorodnih darovalcev (83 %). Očitno je, da je treba popkovnično kri obravnavati kot alternativo kostnemu mozgu pri presaditvi bolnikom s hemoblastozami.

Hkrati neonatalna narava popkovničnega vira hematopoetskega tkiva vzbuja optimizem zaradi prisotnosti funkcionalnih značilnosti njegove HSC. Hkrati lahko le klinične izkušnje odgovorijo na vprašanje o zadostnosti enega vzorca popkovnične krvi za obnovitev hematopoeze pri odraslem prejemniku s hematopoetsko aplazijo. Presaditev celic popkovnične krvi se uporablja v programih zdravljenja številnih tumorskih in netumorskih bolezni: levkemije in mielodisplastičnih sindromov, ne-Hodgkinovega limfoma in nevroblastoma, aplastične anemije, prirojenih Fanconijevih in Diamond-Blackfanovih anemij, pomanjkanja adhezije levkocitov, Barrovega sindroma, Guntherjeve bolezni, Hurlerjevega sindroma, talasemije.

Imunološki vidiki presaditve hematopoetskih celic iz popkovnične krvi si zaslužijo posebno pozornost in ločeno študijo. Dokazano je, da so v primeru presaditve matičnih celic iz popkovnične krvi od darovalcev z nepopolno HLA združljivostjo rezultati presaditve dokaj zadovoljivi, kar po mnenju avtorjev kaže na nižjo imunoreaktivnost celic iz popkovnične krvi kot kostnega mozga.

Podrobna študija celične sestave popkovnične krvi je razkrila značilnosti tako fenotipskega spektra efektorskih celic imunskega sistema kot tudi njihove funkcionalne aktivnosti, kar je omogočilo, da popkovnično kri obravnavamo kot vir HSC z relativno nizkim tveganjem za razvoj reakcije "presadek proti gostitelju". Med znaki funkcionalne nezrelosti imunokompetentnih celic popkovnične krvi je treba omeniti neravnovesje v proizvodnji citokinov in zmanjšanje občutljivosti na citokinsko regulacijo imunskega odziva. Nastala inhibicija aktivnosti citotoksičnih limfocitov velja za dejavnik, ki prispeva k nastanku imunološke tolerance na presajeno hematopoetsko tkivo. V populaciji limfocitov popkovnične krvi, v nasprotju s periferno krvjo in kostnim mozgom odraslih darovalcev, prevladujejo neaktivni, nezreli limfociti in supresorske celice. To kaže na zmanjšano pripravljenost T-limfocitov popkovnične krvi za imunski odziv. Pomembna značilnost monocitne populacije celic popkovnične krvi je nizka vsebnost funkcionalno polnopravnih in aktivnih antigen predstavitvenih celic.

Po eni strani nizka zrelost efektorskih celic imunskega sistema v popkovnični krvi širi indikacije za njeno uporabo v kliniki, saj te lastnosti zagotavljajo zmanjšanje intenzivnosti imunskega konflikta med celicami darovalca in prejemnika. Po drugi strani pa je znano o obstoju korelacije med stopnjo razvoja reakcije "presadek proti gostitelju" in protitumorskim učinkom presaditve, torej razvojem učinka "presadek proti levkemiji". V zvezi s tem je bila izvedena študija o protitumorski citotoksičnosti celic popkovnične krvi. Pridobljeni rezultati kažejo, da so kljub resnično oslabljenemu odzivu imunokompetentnih celic popkovnične krvi na stimulacijo z antigenom limfociti, ki so primarno aktivirani, naravne ubijalke in celice, podobne ubijalkam, ki aktivno sodelujejo v mehanizmih izvajanja protitumorske citotoksičnosti. Poleg tega so v popkovnični krvi našli subpopulacije limfocitov s fenotipoma CD16+CD56+ in CD16"TCRa/p+. Domneva se, da te celice v aktivirani obliki izvajajo reakcijo "presadek proti levkemiji".

Na Onkološkem inštitutu Akademije medicinskih znanosti Ukrajine so bolnikom z rakom in persistentno hematopoetsko hipoplazijo zaradi kemoterapije in radioterapije dajali krioprezervirane hematopoetske celice iz popkovnične krvi. Pri takih bolnikih je presaditev hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi precej učinkovito obnovila depresivno hematopoezo, kar dokazuje vztrajno povečanje vsebnosti zrelih oblikovanih elementov v periferni krvi, pa tudi povečanje kazalnikov, ki označujejo stanje celične in humoralne imunosti. Stabilnost učinka repopulacije po presaditvi hematopoetskih celic iz popkovnične krvi omogoča nadaljevanje obsevanja in kemoterapije brez prekinitve poteka zdravljenja. Obstajajo podatki o večji učinkovitosti alotransplantacije matičnih celic iz popkovnične krvi onkohematološkim bolnikom: letno tveganje za ponovitev tumorske bolezni pri njihovi uporabi je bilo 25 % v primerjavi s 40 % pri bolnikih s presajenim alogenskim kostnim mozgom.

Mehanizem delovanja krioprezerviranih matičnih celic popkovnične krvi je treba obravnavati kot posledico humoralne stimulacije hematopoeze prejemnika, ki jo povzroča edinstvena sposobnost neonatalnih celic za avtokrino proizvodnjo hematopoetskih rastnih faktorjev, pa tudi kot posledico začasne prijetnosti donorskih celic (kar dokazuje zanesljivo povečanje vsebnosti fetalnega hemoglobina v periferni krvi prejemnikov 7. do 15. dan po transfuziji v primerjavi z začetnimi podatki). Odsotnost posttransfuzijskih reakcij pri prejemnikih popkovnične krvi je posledica relativne tolerance njenih imunokompetentnih celic in kot merilo zaupanja v biološko ustreznost krioprezerviranega materiala.

Progenske celice ubijalke T-limfocitov iz popkovnične krvi se lahko aktivirajo pod vplivom eksogene stimulacije citokinov, kar se uporablja za razvoj novih ex vivo in in vivo metod za indukcijo protitumorske citotoksičnosti presaditvenih limfoidnih elementov za nadaljnjo imunoterapijo. Poleg tega "nezrelost" genoma imunokompetentnih celic iz popkovnične krvi omogoča njihovo uporabo za povečanje protitumorske aktivnosti z uporabo metod molekularnega modeliranja.

Danes je popkovnična kri našla široko uporabo predvsem v pediatrični hematologiji. Pri otrocih z akutno levkemijo alotransplantacija hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi v primerjavi z alotransplantacijo kostnega mozga znatno zmanjša pojavnost bolezni presadka proti gostitelju. Vendar pa to spremlja daljše obdobje nevtro- in trombocitopenije ter žal višja 100-dnevna stopnja umrljivosti po presaditvi. Daljše obdobje okrevanja ravni granulocitov in trombocitov v periferni krvi je lahko posledica nezadostne diferenciacije posameznih subpopulacij CD34-pozitivnih celic popkovnične krvi, kar dokazuje nizka raven absorpcije radioaktivnega rodamina in nizka ekspresija antigenov CD38 na njihovi površini.

Hkrati je presaditev hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi odraslim bolnikom, opravljena zaradi odsotnosti tako združljivega nesorodnega darovalca kostnega mozga kot tudi možnosti mobilizacije avtolognih HSC, pokazala visoko enoletno preživetje brez ponovitve bolezni v skupini bolnikov, mlajših od 30 let (73 %). Razširitev starostnega razpona prejemnikov (18–46 let) je povzročila zmanjšanje preživetja na 53 %.

Kvantitativna analiza celic s fenotipom CD34+ v kostnem mozgu in popkovnični krvi je pokazala njihovo višjo (3,5-kratno) vsebnost v kostnem mozgu, vendar je bila v popkovnični krvi opažena pomembna prevlada celic s fenotipskim profilom CD34+HLA-DR. Znano je, da se krvne celice z imunološkimi markerji CD34+HLA-DR proliferirajo aktivneje kot celice z imunofenotipom CD34+HLA-DR+, kar je bilo potrjeno v eksperimentalnih študijah rasti dolgotrajne kulture hematopoetskih celic in vitro. Primitivne celične prekurzorje s fenotipom CD34+CD38 so prisotne tako v popkovnični krvi kot v kostnem mozgu, vendar imajo celice popkovnične krvi z naborom markerjev CD34+CD38 večjo klonogeno aktivnost kot hematopoetske celice istega fenotipa, izolirane iz kostnega mozga odraslih darovalcev. Poleg tega se celice popkovnične krvi z imunofenotipom CD34+CD38 hitreje razmnožujejo kot odziv na stimulacijo citokinov (IL-3, IL-6, G-CSF) in v dolgotrajnih kulturah proizvedejo 7-krat več kolonij kot celice kostnega mozga.

Banke matičnih celic iz popkovnične krvi

Za pravilen razvoj novega področja praktične medicine - presaditve matičnih celic popkovnične krvi, kot tudi za izvajanje presaditev hematopoetskih matičnih celic kostnega mozga, je potrebna obsežna mreža bank krvi, ki so že bile vzpostavljene v ZDA in Evropi. Domače mreže bank popkovnične krvi združuje Združenje bank Netcord. Smiselnost ustanovitve mednarodnega združenja bank popkovnične krvi je posledica dejstva, da je za izvedbo nesorodnih presaditev potrebno veliko število vzorčnih vzorcev popkovnične krvi, kar omogoča izbiro HLA-identičnega darovalca. Le vzpostavitev sistema bank s shranjevanjem vzorcev krvi različnih tipov HLA lahko resnično reši problem iskanja potrebnega darovalca. Organizacija takšnega sistema bank popkovnične krvi zahteva predhodni razvoj etičnih in pravnih norm, o katerih trenutno potekajo razprave na mednarodni ravni.

Za ustanovitev bank popkovnične krvi v Ukrajini je treba pripraviti celo vrsto predpisov in dokumentov.

Najprej gre za vprašanja standardizacije metod odvzema, frakcioniranja in zamrzovanja popkovnične krvi. Treba je urediti pravila odvzema popkovnične krvi v porodnišnicah v skladu z zahtevami medicinske etike, določiti minimalno količino popkovnične krvi, ki zagotavlja uspešno presaditev. Primerjati in standardizirati je treba različna merila za ocenjevanje kakovosti in količine hematopoetskih progenitorskih celic, pa tudi metode tipizacije HLA in diagnostične metode za genetske in nalezljive bolezni, ki se lahko prenašajo med infuzijo celic popkovnične krvi, da se določijo skupna merila za izbor zdravih darovalcev. Prav tako je vredno razpravljati o vprašanjih ustvarjanja ločenih skladišč za serum, celice in DNK, pridobljene iz popkovnične krvi.

Nujno je organizirati računalniško mrežo podatkov o popkovnični krvi, ki bi se povezala z registri darovalcev kostnega mozga. Za nadaljnji razvoj transplantologije celic je treba razviti posebne protokole za primerjavo rezultatov presaditve popkovnične krvi in kostnega mozga od HLA-identičnih sorodnikov in nesorodnih darovalcev. Standardizacija dokumentacije, vključno z informiranim soglasjem staršev, ter obveščanje matere ali sorodnikov o genetskih in/ali nalezljivih boleznih, odkritih pri otroku, lahko pomaga rešiti etične in pravne probleme klinične uporabe celic popkovnične krvi.

Odločilni pogoj za razvoj celične transplantologije v Ukrajini bo sprejetje Nacionalnega programa za darovanje matičnih celic in razvoj mednarodnega sodelovanja z drugimi državami prek Svetovnega združenja darovalcev kostnega mozga (WMDA), Nacionalnega programa za darovanje kostnega mozga ZDA (NMDP) in drugih registrov.

Če povzamemo še vedno kratko zgodovino razvoja presaditve hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi, ugotavljamo, da so bile prve domneve o možnosti uporabe popkovnične krvi v kliniki, izražene že v zgodnjih 70. letih, potrjene v 80. letih z rezultati eksperimentalnih študij na živalih, leta 1988 pa je bila izvedena prva presaditev hematopoetskih celic iz popkovnične krvi človeku na svetu, nakar se je začela graditi globalna mreža bank popkovnične krvi. V 10 letih se je število bolnikov s presajenimi hematopoetskimi celicami iz popkovnične krvi približalo 800. Med njimi so bili bolniki z različnimi boleznimi tumorske (levkemija, limfom, solidni tumorji) in netumorske (prirojene imunske pomanjkljivosti, anemija, bolezni, povezane s presnovnimi motnjami) narave.

Vsebnost zgodnjih in zavezanih celičnih prekurzorjev v popkovnični krvi je višja kot v periferni krvi odraslega. Glede na število enot, ki tvorijo kolonije granulocitov-makrofagov, in njihov proliferativni potencial popkovnična kri bistveno presega periferno kri odraslih tudi po vnosu rastnih faktorjev. V dolgotrajnih celičnih kulturah in vitro so opazili večjo proliferativno aktivnost in sposobnost preživetja celic popkovnične krvi kot celic kostnega mozga. Kritični trenutki pri presaditvi matičnih celic iz popkovnične krvi so število in hematopoetski potencial jedrnih celic, prisotnost okužbe s citomegalovirusom, HLA združljivost darovalca in prejemnika, telesna teža in starost bolnika.

Vendar pa je treba presaditev matičnih celic iz popkovnične krvi obravnavati kot alternativo presaditvi kostnega mozga za zdravljenje hudih krvnih bolezni, predvsem pri otrocih. Klinični problemi presaditve matičnih celic iz popkovnične krvi se postopoma rešujejo – že obstajajo precej učinkovite metode za zbiranje, ločevanje in krioprezervacijo celic iz popkovnične krvi, zagotavljajo se pogoji za oblikovanje bank popkovnične krvi in izboljšujejo se metode za testiranje celic z jedrom. 3-odstotno raztopino želatine in 6-odstotno raztopino hidroksietil škroba je treba šteti za optimalno za ločevanje med obsežnim pridobivanjem hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi pri ustvarjanju bank.

P. Perekhrestenko in soavtorji (2001) upravičeno ugotavljajo, da bi morala presaditev matičnih celic popkovnične krvi zavzeti svoje mesto v kompleksu terapevtskih ukrepov za premagovanje hematopoetskih depresij različnega izvora, saj imajo matične celice popkovnične krvi številne pomembne prednosti, med katerimi so najpomembnejše relativna enostavnost njihovega pridobivanja, odsotnost tveganja za darovalca, nizka kontaminacija neonatalnih celic z virusi in sorazmerno nizki stroški presaditve. Nekateri avtorji poudarjajo, da presaditev celic popkovnične krvi manj pogosto spremljajo zapleti, povezani z reakcijo presadka proti gostitelju, kot presaditev celic kostnega mozga, kar je po njihovem mnenju posledica šibke ekspresije antigenov HLA-DR na celicah popkovnične krvi in njihove nezrelosti. Vendar pa je glavna populacija jedrnih celic v popkovnični krvi limfociti T (CD3-pozitivne celice), katerih vsebnost je približno 50 %, kar je 20 % manj kot v periferni krvi odraslega, vendar so fenotipske razlike v subpopulacijah celic T iz teh virov nepomembne.

Med dejavniki, ki neposredno vplivajo na stopnjo preživetja pri presaditvi matičnih celic iz popkovnične krvi, velja omeniti starost bolnikov (najboljše rezultate opazimo pri prejemnikih, starih od enega do pet let), zgodnjo diagnozo bolezni in obliko levkemije (učinkovitost je bistveno višja pri akutni levkemiji). Zelo pomemben je odmerek jedrnih celic iz popkovnične krvi ter njihova HLA združljivost s prejemnikom. Ni naključje, da analiza klinične učinkovitosti presaditve HSC iz popkovnične krvi v onkohematologiji kaže najboljše rezultate zdravljenja pri uporabi sorodnih presaditev: enoletno preživetje brez ponovitve v tem primeru doseže 63 %, pri nesorodni presaditvi pa le 29 %.

Tako prisotnost velikega števila matičnih celic v popkovnični krvi in visoka sposobnost repopulacije neonatalnih hematopoetskih matičnih celic omogočata njihovo uporabo za alogensko presaditev pri onkohematoloških bolnikih. Vendar je treba opozoriti, da je obnova hematopoeze po presaditvi hematopoetskih celic iz popkovnične krvi »raztegnjena v času«: obnovitev vsebnosti nevtrofilcev v periferni krvi se običajno opazi do konca 6. tedna, trombocitopenija pa običajno izgine po 6 mesecih. Poleg tega nezrelost hematopoetskih celic iz popkovnične krvi ne izključuje imunoloških konfliktov: huda akutna in kronična bolezen presadka proti gostitelju se opazi pri 23 oziroma 25 % prejemnikov. Recidivi akutne levkemije do konca prvega leta po presaditvi celic iz popkovnične krvi so opaženi v 26 % primerov.

[ 10 ], [ 11 ]