Omejitve, nevarnosti in zapleti presaditve celic

Regenerativna plastična medicina temelji na klinični uporabi toti- in pluripotentnih lastnosti embrionalnih in progenitorskih matičnih celic, ki omogočajo in vitro in in vivo ustvarjanje specifičnih celičnih linij, ki ponovno naselijo poškodovana tkiva in organe bolne osebe.

Resnična možnost uporabe embrionalnih matičnih celic in matičnih celic dokončnih tkiv (tako imenovanih »odraslih« matičnih celic) ljudi v terapevtske namene ni več dvomljiva. Vendar pa strokovnjaki Nacionalne in medicinske akademije ZDA (Maticne celice in prihodnja regenerativna medicina National Academy Press) ter Nacionalnega inštituta za zdravje ZDA (Maticne celice in prihodnje raziskovalne smeri. Nat. Inst, of Health USA) priporočajo podrobnejšo preučitev lastnosti matičnih celic v poskusih na ustreznih bioloških modelih in objektivno oceno vseh posledic presaditve, šele nato pa uporabo matičnih celic v kliniki.

Ugotovljeno je bilo, da so matične celice del tkivnih derivatov vseh treh zarodnih plasti. Matične celice se nahajajo v mrežnici, roženici, kožni povrhnjici, kostnem mozgu in periferni krvi, v krvnih žilah, zobni pulpi, ledvicah, prebavnem epiteliju, trebušni slinavki in jetrih. Z uporabo sodobnih metod je bilo dokazano, da so nevronske matične celice lokalizirane v možganih in hrbtenjači odraslega. Ti senzacionalni podatki so pritegnili posebno pozornost znanstvenikov in medijev, saj so nevroni v možganih služili kot klasičen primer statične celične populacije, ki se ne obnavlja. Tako v zgodnjem kot poznem obdobju ontogeneze se v možganih živali in ljudi zaradi nevronskih matičnih celic tvorijo nevroni, astrociti in oligodendrociti (Matic cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Vendar pa se v normalnih pogojih plastičnost matičnih celic dokončnih tkiv ne manifestira. Da bi uresničili plastični potencial matičnih celic dokončnih tkiv, jih je treba izolirati in nato gojiti v gojišču s citokini (LIF, EGF, FGF). Poleg tega se derivati matičnih celic uspešno primejo le, če jih presadimo v telo živali z oslabljenim imunskim sistemom (γ-obsevanje, citostatiki, busulfan itd.). Do danes ni bilo pridobljenih prepričljivih dokazov o uresničitvi plastičnosti matičnih celic pri živalih, ki niso bile izpostavljene sevanju ali drugim učinkom, ki povzročajo globoko imunosupresijo.

V takšnih pogojih se nevarni potencial embrionalnih matičnih celic (EMS) kaže predvsem med njihovo presaditvijo v ektopična področja – med subkutano injekcijo ESC imunsko pomanjkljivim mišim se na mestu injiciranja oblikujejo teratokarcinomi. Poleg tega je med razvojem človeškega zarodka pogostost kromosomskih nepravilnosti višja kot pri embriogenezi pri živalih. V fazi blastociste le 20–25 % človeških zarodkov sestavljajo celice z normalnim kariotipom, velika večina zgodnjih človeških zarodkov, pridobljenih po oploditvi in vitro, pa kaže kaotičen kromosomski mozaicizem in zelo pogosto naletijo na numerične in strukturne aberacije.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Koristni učinki matičnih celic

Predhodni rezultati kliničnih preskušanj potrjujejo koristen učinek matičnih celic na bolnika, vendar še vedno ni podatkov o dolgoročnih učinkih presaditve celic. V literaturi so sprva prevladovala poročila o pozitivnih rezultatih presaditve fragmentov možganskih zarodkov pri Parkinsonovi bolezni, nato pa so se začeli pojavljati podatki, ki so zanikali učinkovit terapevtski učinek embrionalnega ali fetalnega živčnega tkiva, presajenega v možgane bolnikov.

Sredi 20. stoletja so prvič odkrili obnovitev hematopoeze pri smrtno obsevanih živalih po intravenski transfuziji celic kostnega mozga, leta 1969 pa je ameriški raziskovalec D. Thomas izvedel prvo presaditev kostnega mozga pri ljudeh. Pomanjkanje znanja o mehanizmih imunološke nezdružljivosti celic kostnega mozga darovalca in prejemnika je takrat privedlo do visoke umrljivosti zaradi pogostega neuspeha presaditve in razvoja reakcije presadka proti gostitelju. Odkritje glavnega kompleksa histokompatibilnosti, ki vključuje humane levkocitne antigene (HbA1c), in izboljšanje metod njihovega tipiziranja sta omogočila znatno povečanje preživetja po presaditvi kostnega mozga, kar je privedlo do široke uporabe te metode zdravljenja v onkohematologiji. Desetletje pozneje so bile izvedene prve presaditve hematopoetskih matičnih celic (HSC), pridobljenih iz periferne krvi z uporabo levkafereze. Leta 1988 so popkovnično kri v Franciji prvič uporabili kot vir HSC za zdravljenje otroka z Fanconijevo anemijo, od konca leta 2000 pa se v tisku pojavljajo poročila o sposobnosti HSC, da se diferencirajo v celice različnih vrst tkiv, kar potencialno širi obseg njihove klinične uporabe. Vendar se je izkazalo, da presaditveni material skupaj s HSC vsebuje znatno število nečistoč nehematopoetskih celic različne narave in lastnosti. V zvezi s tem se razvijajo metode za čiščenje presadka in merila za oceno njegove celične čistosti. Uporablja se zlasti pozitivna imunoselekcija celic CD34+, ki omogoča izolacijo HSC z uporabo monoklonskih protiteles.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Zapleti zdravljenja z matičnimi celicami

Zapleti pri presaditvi kostnega mozga so najpogosteje hematološki in povezani z dolgim obdobjem jatrogene pancitopenije. Najpogosteje se razvijejo infekcijski zapleti, anemija in krvavitve. V zvezi s tem je izjemno pomembno izbrati optimalen način odvzema, obdelave in shranjevanja kostnega mozga za maksimalno ohranitev matičnih celic, kar bo zagotovilo hitro in stabilno obnovo hematopoeze. Pri karakterizaciji presadka se trenutno običajno ocenjujejo naslednji parametri: število mononuklearnih in/ali jedrnih celic, enot, ki tvorijo kolonije, in vsebnost CD34-pozitivnih celic. Žal ti kazalniki zagotavljajo le posredno oceno dejanske hematopoetske sposobnosti populacije matičnih celic presadka. Danes ni absolutno natančnih parametrov za določanje zadostnosti presadka za dolgoročno obnovo hematopoeze pri bolnikih, tudi pri avtologni presaditvi kostnega mozga. Razvoj splošnih meril je izjemno težaven zaradi pomanjkanja strogih standardov za obdelavo, krioprezervacijo in testiranje presadka. Poleg tega je treba upoštevati celoten nabor dejavnikov, ki vplivajo na parametre uspešne obnove hematopoeze pri vsakem posameznem bolniku. Pri avtologni presaditvi kostnega mozga so najpomembnejši število predhodnih kemoterapijskih ciklov, značilnosti pripravljalnega režima, obdobje bolezni, v katerem je bil kostni mozeg odvzet, in sheme uporabe faktorjev, ki spodbujajo kolonije, v obdobju po presaditvi. Poleg tega ne smemo pozabiti, da lahko kemoterapija pred odvzemom presadka negativno vpliva na matične celice kostnega mozga.

Pojavnost hudih toksičnih zapletov se med alogensko presaditvijo kostnega mozga znatno poveča. V zvezi s tem so zanimivi statistični podatki o alogenski presaditvi kostnega mozga pri talasemiji. Poročila Evropske skupine za presaditev kostnega mozga so zabeležila približno 800 presaditev kostnega mozga pri bolnikih s talasemijo major. Alogenska presaditev pri talasemiji se v veliki večini primerov izvaja pri HLA-identičnih sorojencih, kar je povezano s hudimi zapleti in visoko umrljivostjo med presaditvijo materiala matičnih celic od delno združljivih sorodnih ali združljivih nesorodnih darovalcev. Da bi zmanjšali tveganje za smrtne infekcijske zaplete, bolnike namestimo v izolirane aseptične škatle z laminarnim pretokom zraka in prejemamo dieto z nizko vsebnostjo bakterij ali abakterijsko dieto. Za bakterijsko dekontaminacijo črevesja se peroralno predpisujejo neresorbirajoče oblike antibiotikov in protiglivičnih zdravil. Za profilakso se amfotericin B daje intravensko. Preprečevanje sistemskih okužb se okrepi z amikacinom in ceftazidimom, ki se predpišeta dan pred presaditvijo, zdravljenje pa se nadaljuje do odpusta bolnika. Vsi krvni pripravki so pred transfuzijo obsevani z odmerkom 30 Gy. Parenteralna prehrana med presaditvijo je nujen pogoj in se začne takoj po omejitvi vnosa hrane na naraven način.

Številni zapleti so povezani z visoko toksičnostjo imunosupresivnih zdravil, ki pogosto povzročajo slabost, bruhanje in mukozitis, okvaro ledvic in intersticijsko pljučnico. Eden najhujših zapletov kemoterapije je venookluzivna bolezen jeter, ki vodi v smrt v zgodnjem obdobju po presaditvi. Med dejavnike tveganja za trombozo ven portalnega sistema jeter spadajo starost bolnikov, prisotnost hepatitisa in jetrne fibroze ter imunosupresivno zdravljenje po presaditvi kostnega mozga. Venookluzivna bolezen je še posebej nevarna pri talasemiji, ki jo spremlja hemosideroza jeter, hepatitis in fibroza - pogosti spremljevalci transfuzijske terapije. Tromboza ven portalnega sistema jeter se razvije 1-2 tedna po presaditvi in je značilna po hitrem povečanju vsebnosti bilirubina in aktivnosti transaminaz v krvi, napredovanju hepatomegalije, ascitesa, encefalopatije in bolečinah v zgornjem delu trebuha. Histološko obdukcijski material razkriva poškodbe endotelija, subendotelijske krvavitve, poškodbe centrilobularnih hepatocitov, trombotično obstrukcijo venul in centralnih ven jeter. Pri bolnikih s talasemijo so opisani primeri smrtnega srčnega zastoja, povezanega s toksičnimi učinki citostatikov.

V obdobju pred presaditvijo ciklofosfamid in busulfan pogosto povzročata toksično-hemoragični cistitis s patološkimi spremembami uroepitelnih celic. Uporabo ciklosporina A pri presaditvi kostnega mozga pogosto spremljajo nefro- in nevrotoksičnost, hipertenzivni sindrom, zastajanje tekočine v telesu in citoliza hepatocitov. Spolna in reproduktivna disfunkcija se pogosteje pojavlja pri ženskah. Pri majhnih otrocih pubertetni razvoj po presaditvi običajno ni prizadet, pri starejših otrocih pa je lahko patologija razvoja spolne sfere zelo resna - vse do sterilnosti. Zapleti, ki so neposredno povezani s samo presaditvijo, vključujejo zavrnitev alogenskih celic kostnega mozga, nezdružljivost ABO ter akutne in kronične oblike bolezni presadka proti gostitelju.

Pri bolnikih s presaditvijo kostnega mozga, ki ni združljiva z ABO, se izoaglutinini gostitelja proti darovalcu ABO proizvajajo še 330–605 dni po presaditvi, kar lahko povzroči podaljšano hemolizo in dramatično poveča potrebo po transfuzijah krvi. Ta zaplet preprečimo s transfuzijo samo rdečih krvničk tipa 0. Po presaditvi se pri nekaterih bolnikih pojavi avtoimunska nevtropenija, trombocitopenija ali pancitopenija, kar zahteva splenektomijo.

Pri 35–40 % prejemnikov se akutna bolezen presadka proti gostitelju razvije v 100 dneh po alogenski presaditvi kostnega mozga z identičnim HLA. Stopnja prizadetosti kože, jeter in črevesja se razlikuje od izpuščaja, driske in zmerne hiperbilirubinemije do luščenja kože, črevesne zapore in akutne odpovedi jeter. Pri bolnikih s talasemijo je incidenca akutne bolezni presadka proti gostitelju stopnje I po presaditvi kostnega mozga 75 %, stopnje II in višje pa 11–53 %. Kronična bolezen presadka proti gostitelju kot sistemski multiorganski sindrom se običajno razvije v 100–500 dneh po alogenski presaditvi kostnega mozga pri 30–50 % bolnikov. Prizadeta je koža, ustna votlina, jetra, oči, požiralnik in zgornji dihalni poti. Razlikujemo med omejeno obliko kronične bolezni presadka proti gostitelju, ko sta prizadeti koža in/ali jetra, in razširjeno obliko, ko so generalizirane kožne lezije kombinirane s kroničnim agresivnim hepatitisom, lezijami oči, žlez slinavk ali katerega koli drugega organa. Smrt pogosto povzročijo infekcijski zapleti, ki so posledica hude imunske pomanjkljivosti. Pri talasemiji se blaga oblika kronične bolezni presadka proti gostitelju pojavi pri 12 %, zmerna oblika pri 3 % in huda oblika pri 0,9 % prejemnikov alogenskega kostnega mozga, združljivega s HLA. Hud zaplet presaditve kostnega mozga je zavrnitev presadka, ki se razvije 50–130 dni po operaciji. Pogostost zavrnitve je odvisna od režima pripravljalnega zdravljenja. Zlasti pri bolnikih s talasemijo, ki so v pripravljalnem obdobju prejemali samo metotreksat, so zavrnitev presadka kostnega mozga opazili v 26 % primerov, pri kombinaciji metotreksata s ciklosporinom A v 9 % primerov in pri dajanju samo ciklosporina A v 8 % primerov (Gaziev et al., 1995).

Infekcijske zaplete po presaditvi kostnega mozga povzročajo virusi, bakterije in glive. Njihov razvoj je povezan z globoko nevtropenijo, ki jo povzročajo kemoterapevtska zdravila v obdobju pripravljanja, poškodbo sluzničnih pregrad s citostatiki in reakcijo presadka proti gostitelju. Glede na čas razvoja ločimo tri faze infekcijskih zapletov. V prvi fazi (razvije se v prvem mesecu po presaditvi) prevladuje poškodba sluzničnih pregrad in nevtropenija, ki jo pogosto spremljajo virusne okužbe (herpes, virus Epstein-Barr, citomegalovirus, Varicella zoster), pa tudi okužbe, ki jih povzročajo grampozitivne in gramnegativne bakterije, glive Candida, aspergili. V zgodnjem obdobju po presaditvi (drugi in tretji mesec po presaditvi) je najhujša okužba citomegalovirus, ki pogosto povzroči smrt bolnikov v drugi fazi infekcijskih zapletov. Pri talasemiji se okužba s citomegalovirusom po presaditvi kostnega mozga razvije pri 1,7–4,4 % prejemnikov. Tretja faza se opazi v poznem obdobju po presaditvi (tri mesece po operaciji) in je značilna po hudi kombinirani imunski pomanjkljivosti. Okužbe, ki jih povzročajo Varicella zoster, streptokok, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae in hepatotropni virusi, so v tem obdobju pogoste. Pri talasemiji je umrljivost bolnikov po presaditvi kostnega mozga povezana z bakterijsko in glivično sepso, idiopatsko intersticijsko in citomegalovirusno pljučnico, akutnim sindromom dihalne stiske, akutnim srčnim popuščanjem, srčno tamponado, možgansko krvavitvijo, venookluzivno boleznijo jeter in akutno boleznijo presadka proti gostitelju.

Trenutno so bili doseženi določeni uspehi pri razvoju metod za izolacijo čistih populacij hematopoetskih matičnih celic iz kostnega mozga. Izboljšana je bila tehnika za pridobivanje fetalne krvi iz popkovine in ustvarjene so bile metode za izolacijo hematopoetskih celic iz popkovnične krvi. V znanstvenem tisku poročajo, da so hematopoetske matične celice sposobne razmnoževanja, če jih gojimo v gojiščih s citokini. Pri uporabi posebej zasnovanih bioreaktorjev za širjenje hematopoetskih matičnih celic se biomasa hematopoetskih matičnih celic, izoliranih iz kostnega mozga, periferne ali popkovnične krvi, znatno poveča. Možnost širjenja hematopoetskih matičnih celic je pomemben korak k kliničnemu razvoju presaditve celic.

Vendar pa je pred in vitro razmnoževanjem hematopoetskih matičnih celic treba izolirati homogeno populacijo hematopoetskih matičnih celic. To se običajno doseže z uporabo markerjev, ki omogočajo selektivno označevanje hematopoetskih matičnih celic z monoklonskimi protitelesi, kovalentno vezanimi na fluorescentno ali magnetno oznako, in njihovo izolacijo z uporabo ustreznega celičnega sorterja. Hkrati pa vprašanje fenotipskih značilnosti hematopoetskih matičnih celic še ni dokončno rešeno. A. Petrenko in V. Grishchenko (2003) kot kandidate za hematopoetske matične celice obravnavata celice z antigeni CD34, AC133 in Thyl na površini in brez markerjev CD38, HLA-DR ali drugih diferenciacijskih markerjev (celice s fenotipom CD34+Liir). Markerji linije (Lin) vključujejo glikoforin A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Celice s fenotipom CD34+CD45RalüW CD71low, kot tudi s fenotipom CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, veljajo za obetavne za presaditev.

Vprašanje števila hematopoetskih matičnih celic, ki je zadostno za učinkovito presaditev, ostaja problematično. Trenutno so viri hematopoetskih matičnih celic kostni mozeg, periferna in popkovnična kri ter embrionalna jetra. Širitev hematopoetskih matičnih celic se doseže z gojenjem v prisotnosti endotelijskih celic in hematopoetskih rastnih faktorjev. V različnih protokolih se za indukcijo proliferacije HSC uporabljajo mieloproteini, SCF, eritropoetin, inzulinu podobni rastni faktorji, kortikosteroidi in estrogeni. Pri uporabi kombinacij citokinov in vitro je mogoče doseči znatno povečanje količine HSC z vrhom njihove proizvodnje ob koncu drugega tedna gojenja.

Tradicionalno se presaditev hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi uporablja predvsem za hemoblastoze. Vendar pa je minimalni odmerek hematopoetskih celic, potreben za uspešno presaditev celic iz popkovnične krvi, 3,7 x 107 ^jedrnih celic na 1 kg telesne teže prejemnika. Uporaba manjšega števila hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi znatno poveča tveganje za odpoved presadka in ponovitev bolezni. Zato se presaditev hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi uporablja predvsem za zdravljenje hemoblastoz pri otrocih.

Žal še vedno ni standardov za pridobivanje ali standardiziranih protokolov za klinično uporabo hematopoetskih celic iz popkovnične krvi. Zato matične celice iz popkovnične krvi same po sebi niso pravno priznan vir hematopoetskih celic za presaditev. Poleg tega ni etičnih ali pravnih norm, ki bi urejale dejavnosti in organizacijo bank popkovnične krvi, kot obstajajo v tujini. Medtem je treba za varno presaditev vse vzorce popkovnične krvi skrbno spremljati. Pred odvzemom krvi nosečnice je treba pridobiti njeno soglasje. Vsako nosečnico je treba pregledati na nosilstvo HBsAg, prisotnost protiteles proti virusom hepatitisa C, HIV in sifilisa. Vsak vzorec popkovnične krvi je treba standardno testirati na število jedrnih celic, CD34+ in sposobnost tvorbe kolonij. Poleg tega se izvede tipizacija HbA, določitev krvne skupine po ABO in pripadnosti po Rh faktorju. Potrebni postopki testiranja so bakteriološka kultura za sterilnost, serološko testiranje na okužbe z virusom HIV-1 in HIV-2, HBsAg, virusni hepatitis C, okužbo s citomegalovirusom, HTLY-1 in HTLY-II, sifilis in toksoplazmozo. Poleg tega se za odkrivanje okužb s citomegalovirusom in virusom HIV izvaja verižna reakcija s polimerazo. Zdi se priporočljivo dopolniti protokole testiranja z analizo GSC popkovnične krvi za odkrivanje genetskih bolezni, kot so α-talasemija, srpastocelična anemija, pomanjkanje adenozin deaminaze, Brutonova agamaglobulinemija, Hurlerjeva in Ponterjeva bolezen.

Naslednja faza priprave na presaditev je vprašanje ohranjanja hematopoetskih matičnih celic. Najbolj nevarna postopka za sposobnost preživetja celic med njihovo pripravo sta zamrzovanje in odmrzovanje. Pri zamrzovanju hematopoetskih celic se lahko zaradi nastajanja kristalov uniči znaten del le-teh. Za zmanjšanje odstotka celične smrti se uporabljajo posebne snovi - krioprotektorji. Najpogosteje se kot krioprotektor uporablja DMSO v končni koncentraciji 10 %. Vendar pa je za DMSO v takšni koncentraciji značilen neposreden citotoksični učinek, ki se kaže že v pogojih minimalne izpostavljenosti. Zmanjšanje citotoksičnega učinka se doseže s strogim vzdrževanjem ničelne temperature načina izpostavljenosti, pa tudi z upoštevanjem predpisov za obdelavo materiala med in po odmrzovanju (hitrost vseh manipulacij, uporaba večkratnih postopkov pranja). Koncentracije DMSO, manjše od 5 %, se ne smejo uporabljati, saj to povzroči množično smrt hematopoetskih celic med obdobjem zamrzovanja.

Prisotnost nečistoč eritrocitov v suspenzijski mešanici hematopoetskih matičnih celic ustvarja tveganje za razvoj reakcije nezdružljivosti z eritrocitnimi antigeni. Hkrati se pri odstranitvi eritrocitov znatno poveča izguba hematopoetskih celic. V zvezi s tem je bila predlagana metoda nefrakcionirane izolacije hematopoetskih matičnih celic. V tem primeru se za zaščito jedrnih celic pred škodljivimi učinki nizkih temperatur uporabi 10 % raztopina DMSO in hlajenje s konstantno hitrostjo (GS/min) na -80 °C, nakar se celična suspenzija zamrzne v tekočem dušiku. Domneva se, da ta metoda kriokonzervacije povzroči delno lizo eritrocitov, zato vzorci krvi ne potrebujejo frakcioniranja. Pred presaditvijo se celična suspenzija odmrzne, spere iz prostega hemoglobina in DMSO v raztopini humanega albumina ali v krvnem serumu. Ohranjanje hematopoetskih predhodnikov s to metodo je res večje kot po frakcioniranju popkovnične krvi, vendar ostaja tveganje za transfuzijske zaplete zaradi transfuzije eritrocitov, nezdružljivih z ABO.

Vzpostavitev bančnega sistema za shranjevanje vzorcev HSC, testiranih in tipiziranih s HLA, bi lahko rešila zgoraj navedene težave. Vendar pa to zahteva razvoj etičnih in pravnih norm, o katerih se trenutno le razpravlja. Pred vzpostavitvijo bančnega omrežja je treba sprejeti številne predpise in dokumente o standardizaciji postopkov za zbiranje, frakcioniranje, testiranje in tipizacijo ter krioprezervacijo HSC. Obvezen pogoj za učinkovito delovanje bank HSC je organizacija računalniške baze za interakcijo z registri Svetovnega združenja darovalcev kostnega mozga (WMDA) in Nacionalnega programa darovalcev kostnega mozga Združenih držav Amerike (NMDP).

Poleg tega je treba optimizirati in standardizirati metode in vitro ekspanzije HSC, predvsem hematopoetskih celic iz popkovnične krvi. Ekspanzija HSC iz popkovnične krvi je potrebna za povečanje števila potencialnih prejemnikov, združljivih s sistemom HLA. Zaradi majhnih količin popkovnične krvi število HSC, ki jih vsebuje, običajno ne more zagotoviti repopulacije kostnega mozga pri odraslih bolnikih. Hkrati je za izvedbo nesorodnih presaditev potreben dostop do zadostnega števila tipiziranih vzorcev HSC (od 10.000 do 1.500.000 na prejemnika).

Presaditev hematopoetskih matičnih celic ne odpravi zapletov, ki spremljajo presaditev kostnega mozga. Analize kažejo, da se pri presaditvi matičnih celic iz popkovnične krvi hude oblike akutne bolezni presadka proti gostitelju razvijejo pri 23 % prejemnikov, kronične oblike pa pri 25 % prejemnikov. Pri onkohematoloških bolnikih se ponovitve akutne levkemije v prvem letu po presaditvi matičnih celic iz popkovnične krvi pojavijo v 26 % primerov.

V zadnjih letih se intenzivno razvijajo metode presaditve perifernih hematopoetskih matičnih celic. Vsebnost HSC v periferni krvi je tako majhna (1 HSC na 100.000 krvnih celic), da njihova izolacija brez posebne priprave nima smisla. Zato darovalec najprej prejme kuro zdravil, ki spodbujajo sproščanje hematopoetskih celic kostnega mozga v kri. V ta namen se uporabljajo tako daleč od neškodljivih zdravil, kot sta ciklofosfamid in faktor, ki stimulira kolonije granulocitov. Toda tudi po postopku mobilizacije HSC v periferno kri vsebnost celic CD34+ v njej ne presega 1,6 %.

Za mobilizacijo hematopoetskih matičnih celic v kliniki se najpogosteje uporablja S-SEC, za katero je značilna relativno dobra toleranca, z izjemo skoraj naravnega pojava bolečin v kosteh. Treba je opozoriti, da uporaba sodobnih krvnih separatorjev omogoča učinkovito izolacijo hematopoetskih matičnih celic. Vendar pa je treba v normalnih pogojih hematopoeze izvesti vsaj 6 postopkov, da se pridobi zadostno število hematopoetskih matičnih celic, ki so po repopulacijski sposobnosti primerljive s suspenzijo kostnega mozga. Vsak tak postopek zahteva 10-12 litrov krvi, ki se predela na separatorju, kar lahko povzroči trombocitopenijo in levkopenijo. Postopek ločevanja vključuje vnos antikoagulanta (natrijevega citrata) darovalcu, kar pa ne izključuje kontaktne aktivacije trombocitov med zunajtelesno centrifugiranjem. Ti dejavniki ustvarjajo pogoje za razvoj infekcijskih in hemoragičnih zapletov. Druga pomanjkljivost metode je znatna variabilnost mobilizacijskega odziva, kar zahteva spremljanje vsebnosti HSC v periferni krvi darovalcev, kar je potrebno za določitev njihove najvišje ravni.

Avtogena presaditev hematopoetskih matičnih celic, za razliko od alogenske presaditve, popolnoma odpravi razvoj zavrnitvene reakcije. Vendar pa je pomembna pomanjkljivost avtotransplantacije hematopoetskih matičnih celic, ki omejuje obseg indikacij za njeno izvedbo, velika verjetnost ponovne infuzije levkemičnih klonskih celic s presadkom. Poleg tega odsotnost imunsko posredovanega učinka "presadka proti tumorju" znatno poveča pogostost recidivov malignih krvnih bolezni. Zato ostaja edina radikalna metoda za odpravo neoplastične klonske hematopoeze in obnovitev normalne poliklonske hematopoeze pri mielodisplastičnih sindromih intenzivna polikemoterapija s presaditvijo alogenske hematopoeze.

Toda tudi v tem primeru je zdravljenje večine hemoblastoz usmerjeno le v povečanje časa preživetja bolnikov in izboljšanje njihove kakovosti življenja. Glede na več velikih študij je dolgoročno preživetje brez recidiva po alotransplantaciji HSC doseženo pri 40 % onkohematoloških bolnikov. Pri uporabi matičnih celic HLA-združljivega sorojenca so najboljši rezultati opaženi pri mladih bolnikih s kratko anamnezo bolezni, številom blastnih celic do 10 % in ugodno citogenetiko. Žal umrljivost, povezana s postopkom alotransplantacije HSC pri bolnikih z mielodisplastičnimi boleznimi, ostaja visoka (v večini poročil - približno 40 %). Rezultati 10-letnega dela Nacionalnega programa za darovanje kostnega mozga v ZDA (510 bolnikov, mediana starosti - 38 let) kažejo, da je preživetje brez recidiva dve leti 29 % z relativno nizko verjetnostjo recidiva (14 %). Vendar pa je umrljivost, povezana s postopkom alotransplantacije HSC od nesorodnega darovalca, izjemno visoka in v dveh letih doseže 54 %. Podobni rezultati so bili pridobljeni v evropski študiji (118 bolnikov, mediana starost - 24 let, dveletno preživetje brez ponovitve - 28 %, ponovitev - 35 %, umrljivost - 58 %).

Med intenzivnimi kemoterapevtskimi tečaji, ki jim sledi obnova hematopoeze z alogenskimi hematopoetskimi celicami, se pogosto pojavijo imunohematološki in transfuzijski zapleti. Ti so v veliki meri posledica dejstva, da se človeške krvne skupine dedujejo neodvisno od molekul MHC. Zato imajo lahko tudi darovalec in prejemnik združljive glavne antigene HLA, njuni eritrociti različne fenotipe. Razlikujemo med "veliko" nezdružljivostjo, ko ima prejemnik že obstoječa protitelesa proti eritrocitnim antigenom darovalca, in "manjšo" nezdružljivostjo, ko ima darovalec protitelesa proti eritrocitnim antigenom prejemnika. Možni so primeri kombinacije "velike" in "manjše" nezdružljivosti.

Rezultati primerjalne analize klinične učinkovitosti alotransplantacije hematopoetskih matičnih celic kostnega mozga in popkovnične krvi pri hemoblastozah kažejo, da se pri otrocih po alotransplantaciji hematopoetskih matičnih celic iz popkovnične krvi tveganje za razvoj reakcije presadka proti gostitelju znatno zmanjša, vendar opazimo daljše obdobje okrevanja števila nevtrofilcev in trombocitov z večjo incidenco 100-dnevne umrljivosti po presaditvi.

Študija vzrokov zgodnje umrljivosti je omogočila razjasnitev kontraindikacij za alogensko presaditev HSC, med katerimi so najpomembnejše:

• prisotnost pozitivnih testov za okužbo s citomegalovirusom pri prejemniku ali darovalcu (brez preventivnega zdravljenja);
• akutna sevalna bolezen;
• prisotnost ali celo sum na prisotnost mikotične okužbe pri bolniku (brez izvajanja sistemske zgodnje profilakse s fungicidnimi zdravili);
• hemoblastoze, pri katerih so bolniki prejemali dolgotrajno zdravljenje s citostatiki (zaradi velike verjetnosti nenadnega srčnega zastoja in odpovedi več organov);
• presaditev od HLA-neidentičnih darovalcev (brez profilakse akutne reakcije presadka proti gostitelju s ciklosporinom A);
• kronični virusni hepatitis C (zaradi visokega tveganja za razvoj venookluzivne bolezni jeter).

Presaditev HSC lahko tako povzroči resne zaplete, ki pogosto vodijo v smrt. V zgodnjem obdobju (do 100 dni po presaditvi) so to infekcijski zapleti, akutna bolezen presadka proti gostitelju, zavrnitev presadka (odpoved darovalskih HSC), venookluzivna bolezen jeter, pa tudi poškodbe tkiva zaradi toksičnosti pripravljalnega režima, za katerega je značilna visoka stopnja preoblikovanja (koža, žilni endotelij, črevesni epitelij). Zapleti v poznem obdobju po presaditvi vključujejo kronično bolezen presadka proti gostitelju, ponovitve osnovne bolezni, zaostanek v rasti pri otrocih, disfunkcijo reproduktivnega sistema in ščitnice ter poškodbe oči.

Pred kratkim se je v povezavi z objavami o plastičnosti celic kostnega mozga pojavila ideja o uporabi HSC za zdravljenje srčnih napadov in drugih bolezni. Čeprav nekateri poskusi na živalih podpirajo to možnost, je treba sklepe o plastičnosti celic kostnega mozga še potrditi. To okoliščino bi morali upoštevati tisti raziskovalci, ki verjamejo, da se presajene celice človeškega kostnega mozga zlahka transformirajo v celice skeletnih mišic, miokarda ali osrednjega živčevja. Hipoteza, da so HSC naravni celični vir regeneracije teh organov, zahteva resne dokaze.

Predvsem so bili objavljeni prvi rezultati odprte randomizirane študije V. Belenkova (2003). Njen namen je bil preučiti učinek C-SvK (tj. mobilizacije avtolognih HSC v kri) na klinični, hemodinamski in nevrohumoralni status bolnikov z zmernim do hudim kroničnim srčnim popuščanjem ter oceniti njegovo varnost v primerjavi s standardno terapijo (zaviralci angiotenzinske konvertaze, zaviralci beta, diuretiki, srčni glikozidi). V prvi objavi rezultatov študije avtorji programa ugotavljajo, da je edini argument v prid O-SvK rezultat zdravljenja enega bolnika, ki je pokazal nesporno izboljšanje vseh kliničnih in hemodinamskih parametrov v primerjavi s terapijo s tem zdravilom. Vendar teorija o mobilizaciji HSC v krvni obtok s poznejšo regeneracijo miokarda v postinfarktnem območju ni bila potrjena - niti pri bolniku s pozitivno klinično dinamiko stresna ehokardiografija z dobutaminom ni pokazala pojava con živega miokarda v brazgotinski coni.

Treba je opozoriti, da trenutno očitno ni dovolj podatkov, da bi priporočili nadomestno celično terapijo za široko uporabo v vsakdanji klinični praksi. Potrebne so dobro zasnovane in visokokakovostne klinične študije, ki bi določile učinkovitost različnih možnosti regenerativne celične terapije, razvile indikacije in kontraindikacije zanjo ter smernice za kombinirano uporabo regenerativno-plastične terapije in tradicionalnega kirurškega ali konzervativnega zdravljenja. Še vedno ni odgovora na vprašanje, katera posebna populacija celic kostnega mozga (matične hematopoetske ali stromalne) lahko povzroči nastanek nevronov in kardiomiocitov, prav tako pa ni jasno, kateri pogoji k temu prispevajo in vivo.

Delo na teh področjih poteka v številnih državah. V povzetku simpozija o akutni odpovedi jeter Nacionalnih inštitutov za zdravje ZDA je med obetavnimi metodami zdravljenja, poleg presaditve jeter, navedena tudi presaditev kseno- ali alogenskih hepatocitov in zunajtelesna povezava bioreaktorjev z jetrnimi celicami. Obstajajo neposredni dokazi, da lahko le tuji funkcionalno aktivni hepatociti zagotovijo učinkovito podporo jetrom prejemnika. Za klinično uporabo izoliranih hepatocitov je treba ustvariti celično banko, ki bo znatno skrajšala čas med izolacijo celic in njihovo uporabo. Najbolj sprejemljiva metoda za ustvarjanje banke izoliranih hepatocitov je kriokonzervacija jetrnih celic v tekočem dušiku. Pri uporabi takšnih celic v kliniki pri bolnikih z akutno in kronično odpovedjo jeter je bil ugotovljen dokaj visok terapevtski učinek.

Kljub optimističnim in spodbudnim rezultatom presaditve jetrnih celic v poskusih in klinični praksi še vedno obstaja veliko težav, ki še zdaleč niso rešene. Mednje spadajo omejeno število organov, primernih za pridobivanje izoliranih hepatocitov, premalo učinkovite metode za njihovo izolacijo, odsotnost standardiziranih metod za ohranjanje jetrnih celic, nejasne predstave o mehanizmih rasti in regulacije proliferacije presajenih celic, odsotnost ustreznih metod za oceno vcepljenosti ali zavrnitve alogenskih hepatocitov. To vključuje tudi prisotnost presaditvene imunosti pri uporabi alogenskih in ksenogenih celic, čeprav manj kot pri ortotopski presaditvi jeter, vendar zahteva uporabo imunosupresivov, enkapsulacijo izoliranih hepatocitov ali njihovo posebno obdelavo z encimi. Presaditev hepatocitov pogosto povzroči imunski konflikt med prejemnikom in darovalcem v obliki zavrnitvene reakcije, kar zahteva uporabo citostatikov. Ena od rešitev tega problema je lahko uporaba polimernih mikroporoznih nosilcev za izolacijo jetrnih celic, kar bo izboljšalo njihovo preživetje, saj membrana kapsule učinkovito ščiti hepatocite kljub imunizaciji gostitelja.

Vendar pa je pri akutni odpovedi jeter takšna presaditev hepatocitov neučinkovita zaradi relativno dolgega časa, ki ga jetrne celice potrebujejo za priživitev v novem okolju in doseganje optimalnega delovanja. Potencialna omejitev je izločanje žolča med ektopično presaditvijo izoliranih hepatocitov, pri uporabi bioreaktorjev pa je pomembna fiziološka ovira vrstno neskladje med človeškimi beljakovinami in beljakovinami, ki jih proizvajajo ksenogeni hepatociti.

V literaturi so poročila, da lokalna presaditev stromalnih matičnih celic kostnega mozga omogoča učinkovito korekcijo kostnih napak, obnova kostnega tkiva pa v tem primeru poteka intenzivneje kot pri spontani reparativni regeneraciji. Več predkliničnih študij na eksperimentalnih modelih prepričljivo dokazuje možnost uporabe presaditev stromalnih celic kostnega mozga v ortopediji, čeprav je potrebno nadaljnje delo za optimizacijo teh metod, tudi v najpreprostejših primerih. Zlasti optimalni pogoji za ekspanzijo osteogenih stromalnih celic ex vivo še niso bili najdeni, struktura in sestava njihovega idealnega nosilca (matriksa) pa ostajata nerazviti. Najmanjše število celic, potrebnih za volumetrično regeneracijo kosti, še ni bilo določeno.

Dokazano je, da mezenhimske matične celice kažejo transgermalno plastičnost, tj. sposobnost diferenciacije v celične tipe, ki fenotipsko niso povezani s celicami izvorne linije. V optimalnih pogojih gojenja lahko poliklonske linije stromalnih matičnih celic kostnega mozga prenesejo več kot 50 delitev in vitro, kar omogoča pridobitev milijard stromalnih celic iz 1 ml aspirata kostnega mozga. Vendar pa je populacija mezenhimskih matičnih celic heterogena, kar se kaže tako v variabilnosti velikosti kolonij, različnih stopnjah njihovega nastajanja kot tudi v morfološki raznolikosti celičnih tipov, od fibroblastom podobnih vretenastih do velikih ploščatih celic. Fenotipska heterogenost se opazi že po 3 tednih gojenja stromalnih matičnih celic: nekatere kolonije tvorijo vozličke kostnega tkiva, druge tvorijo skupke adipocitov, tretje, redkeje, pa tvorijo otoke hrustančnega tkiva.

Presaditev embrionalnega živčnega tkiva se je sprva uporabljala za zdravljenje degenerativnih bolezni osrednjega živčnega sistema. V zadnjih letih so namesto embrionalnega možganskega tkiva presajali celične elemente nevrosfer, pridobljene iz nevronskih matičnih celic (Poltavtseva, 2001). Nevrosfere vsebujejo predhodnike nevronov in nevroglije, kar daje upanje za obnovitev izgubljenih možganskih funkcij po njihovi presaditvi. Po presaditvi razpršenih celic nevrosfer v striatumsko regijo možganov podgan so opazili njihovo proliferacijo in diferenciacijo v dopaminergične nevrone, kar je odpravilo motorično asimetrijo pri podganah z eksperimentalnim hemiparkinsonizmom. Vendar pa so se v nekaterih primerih iz celic nevrosfer razvili tumorji, kar je povzročilo smrt živali (Bjorklund, 2002).

V kliniki so bile opravljene skrbne študije dveh skupin bolnikov, pri katerih niti bolniki niti zdravniki, ki so jih opazovali, niso vedeli (dvojno slepa študija), da je bila eni skupini bolnikov presajeno embrionalno tkivo z nevroni, ki proizvajajo dopamin, druga skupina bolnikov pa je bila podvržena lažni operaciji, kar je dalo nepričakovane rezultate. Bolniki, ki so jim presadili embrionalno živčno tkivo, se niso počutili nič bolje kot bolniki v kontrolni skupini. Poleg tega je 5 od 33 bolnikov 2 leti po presaditvi embrionalnega živčnega tkiva razvilo perzistentno diskinezijo, ki je pri bolnikih v kontrolni skupini ni bilo (Maticne celice: znanstveni napredek in prihodnje raziskovalne smeri. Nacionalni inštitut za zdravje. ZDA). Eden od nerešenih problemov kliničnih raziskav nevronskih matičnih celic možganov ostaja analiza resničnih možnosti in omejitev presaditve njihovih derivatov za odpravo motenj centralnega živčnega sistema. Možno je, da je nevronogeneza v hipokampusu, ki jo povzroča dolgotrajna epileptična aktivnost in vodi do njegove strukturne in funkcionalne reorganizacije, dejavnik pri progresivnem razvoju epilepsije. Ta sklep si zasluži posebno pozornost, saj kaže na možne negativne posledice nastajanja novih nevronov v zrelih možganih in nastajanja aberantnih sinaptičnih povezav z njimi.

Ne smemo pozabiti, da gojenje v gojiščih s citokini (mitogeni) približa značilnosti matičnih celic značilnostim tumorskih celic, saj se v njih pojavljajo podobne spremembe v regulaciji celičnih ciklov, ki določajo sposobnost neomejene delitve. Presaditev zgodnjih derivatov embrionalnih matičnih celic v človeka je nepremišljena, saj je v tem primeru nevarnost razvoja malignih neoplazem zelo visoka. Veliko varneje je uporabiti njihovo bolj predano potomstvo, torej predhodne celice diferenciranih linij. Vendar pa trenutno še ni razvita zanesljiva tehnika za pridobivanje stabilnih linij človeških celic, ki se diferencirajo v želeno smer.

Uporaba molekularno-bioloških tehnologij za korekcijo dedne patologije in človeških bolezni z modifikacijo matičnih celic je zelo zanimiva za praktično medicino. Značilnosti genoma matičnih celic omogočajo razvoj edinstvenih transplantacijskih shem za korekcijo genetskih bolezni. Vendar pa na tem področju obstaja več omejitev, ki jih je treba premagati pred praktično uporabo genskega inženiringa matičnih celic. Najprej je treba optimizirati proces modifikacije genoma matičnih celic ex vivo. Znano je, da dolgotrajna (3-4 tedne) proliferacija matičnih celic zmanjšuje njihovo transfekcijo, zato je za doseganje visoke stopnje njihove genske modifikacije potrebnih več ciklov transfekcije. Vendar pa je glavna težava povezana s trajanjem terapevtske ekspresije genov. Do sedaj v nobeni študiji obdobje učinkovite ekspresije po presaditvi modificiranih celic ni preseglo štirih mesecev. V 100 % primerov se sčasoma ekspresija transficiranih genov zmanjša zaradi inaktivacije promotorjev in/ali smrti celic s spremenjenim genomom.

Pomembno vprašanje so stroški uporabe celičnih tehnologij v medicini. Na primer, ocenjena letna potreba za financiranje samo zdravstvenih stroškov enote za presaditev kostnega mozga, zasnovane za izvajanje 50 presaditev na leto, znaša približno 900.000 ameriških dolarjev.

Razvoj celičnih tehnologij v klinični medicini je kompleksen in večstopenjski proces, ki vključuje konstruktivno sodelovanje med multidisciplinarnimi znanstvenimi in kliničnimi centri ter mednarodno skupnostjo. Hkrati pa je treba posebno pozornost nameniti vprašanjem znanstvene organizacije raziskav na področju celične terapije. Najpomembnejša med njimi so razvoj protokolov kliničnih raziskav, nadzor nad zanesljivostjo kliničnih podatkov, oblikovanje nacionalnega registra študij, vključevanje v mednarodne programe multicentričnih kliničnih študij in implementacija rezultatov v klinično prakso.

Za zaključek uvoda v problematiko celične transplantologije bi rad izrazil upanje, da bo združitev prizadevanj vodilnih ukrajinskih strokovnjakov z različnih področij znanosti zagotovila pomemben napredek v eksperimentalnih in kliničnih raziskavah ter v prihodnjih letih omogočila iskanje učinkovitih načinov za pomoč hudo bolnim ljudem, ki potrebujejo presaditev organov, tkiv in celic.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]