Matične celice in regenerativna plastična medicina

Danes je le malo zdravnikov, ki ne bi vedeli za razvoj nove smeri zdravljenja najhujših bolezni, ki jih prej tradicionalna in alternativna medicina nista mogli ozdraviti. Govorimo o regenerativno-plastični medicini, ki temelji na uporabi regenerativnega potenciala matičnih celic. Okoli razvijajoče se smeri se je pojavila brezprimerna znanstvena razprava in psevdoznanstveni hype, ki je v veliki meri nastal zaradi informacijskih hiperbol svetovnega spleta. V zelo kratkem času so laboratorijske študije terapevtskih zmogljivosti matičnih celic presegle eksperiment in se začele aktivno uvajati v praktično medicino, kar je povzročilo vrsto problemov znanstvene, etične, verske, pravne in zakonodajne narave. Državne in javne ustanove so se očitno izkazale za nepripravljene na hitrost prehoda matičnih celic iz petrijevk v sisteme za intravensko dajanje, kar ni koristno niti za družbo kot celoto niti za posamezno trpečo osebo. Ni lahko razumeti nepredstavljive količine informacij o zmožnostih matičnih celic, tako količinsko kot kakovostno, niti za specialiste (katerih ni, saj vsi poskušajo sami obvladati nov znanstveni trend), da ne omenjamo zdravnikov, ki se neposredno ne ukvarjajo z regenerativno plastično medicino.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Zakaj so takšni poskusi potrebni in ali so sploh potrebni?

Na prvi pogled je ustvarjanje celičnih medvrstnih himer plod nebrzdane fantazije fanatičnega znanstvenika, ki je pozabil na bioetiko. Vendar pa je prav ta pristop bistveno razširil naše temeljno znanje o embriogenezi, saj je omogočil izračun števila celic, potrebnih za organogenezo (nastanek jeter, možganov, kože in organov imunskega sistema). Poleg tega (morda je to glavna stvar v biologiji ESC) so genetiki dobili na voljo edinstveno orodje, s katerim je mogoče med himerizacijo zarodkov ugotoviti funkcionalni namen genov. Najprej se s posebno tehniko dvojnega knockouta "izklopi" preučevani par genov v ESC. Nato se takšne ESC vnesejo v blastocisto in spremljajo se spremembe, ki se pojavijo v telesu razvijajočega se himernega zarodka. Na ta način so bile ugotovljene funkcije genov sf-1 (razvoj nadledvične žleze in spolnih organov), urt-l (začetek ledvic), muoD (razvoj skeletnih mišic) in gata-l-4 (začetek eritropoeze in limfopoeze). Poleg tega je mogoče v ESC laboratorijskih živali vnesti (transficirati) človeške gene, ki še niso bili raziskani, da se z uporabo himernega zarodka določi njihova funkcija.

Toda praviloma upravičevanje eksperimenta s pridobivanjem novega temeljnega znanja ne najde podpore širše publike. Navedimo primer uporabnega pomena kimerizacije z uporabo ESC. Najprej gre za ksenotransplantacijo, torej presaditev živalskih organov človeku. Teoretično nam ustvarjanje himer človeško-prašičjih celic omogoča, da dobimo žival, ki je po antigenih lastnostih veliko bližje darovalcu ESC, kar lahko v različnih kliničnih situacijah (sladkorna bolezen, ciroza jeter) reši življenje bolne osebe. Res je, da se moramo za to najprej naučiti, kako vrniti lastnost totipotentnosti genomu zrele somatske celice, nato pa jo lahko vnesemo v razvijajoči se prašičji zarodek.

Danes se sposobnost ESC, da se v posebnih pogojih gojenja skoraj neskončno delijo, uporablja za proizvodnjo totipotentne celične mase z njeno poznejšo diferenciacijo v specializirane celice, kot so dopaminergični nevroni, ki se nato presadijo bolniku s Parkinsonovo boleznijo. V tem primeru presaditvi nujno predhodi ciljna diferenciacija pridobljene celične mase v specializirane celice, potrebne za zdravljenje in čiščenje slednjih od nediferenciranih celičnih elementov.

Kot se je kasneje izkazalo, grožnja karcinogeneze še zdaleč ni bila edina ovira za presaditev celic. Spontano se ESC v embrioidnih telesih diferencirajo heterogeno, torej tvorijo derivate najrazličnejših celičnih linij (nevroni, keratinociti, fibroblasti, endoteliociti). V vidnem polju mikroskopa v tem primeru med celicami različnih fenotipov izstopajo kardiomiociti, od katerih se vsak krči v svojem ritmu. Vendar pa je za zdravljenje bolnika potrebno imeti čiste celične populacije: nevrone - v primeru kapi, kardiomiocite - v primeru miokardnega infarkta, β-celice trebušne slinavke - v primeru sladkorne bolezni, keratinocite - v primeru opeklin itd.

Naslednja faza v razvoju celične transplantologije je bila povezana z razvojem tehnologij za pridobivanje zadostnega števila (milijonov celic) takšnih populacij čistih celic. Iskanje dejavnikov, ki povzročajo usmerjeno diferenciacijo ESC, je bilo empirične narave, saj zaporedje njihove sinteze med embriogenezo ni bilo znano. Sprva je bilo ugotovljeno, da se nastanek rumenjakove vrečke inducira z dodajanjem cAMP in retinojske kisline v kulturo ESC. Hematopoetske celične linije so nastale v prisotnosti 1L-3, SCF, fibroblastnega rastnega faktorja (FGH), insulinu podobnega rastnega faktorja (IGF-1), 1L-6 in granulocitne kolonije stimulirajočega faktorja (G-СSF) v gojišču. Celice živčnega sistema so nastale iz ESC po odstranitvi LIF in fibroblastne plasti, ki je služila kot hranilnik. Po obdelavi z retinojsko kislino v prisotnosti fetalnega seruma so se ESC začele diferencirati v nevrone, kardiomiociti pa so bili pridobljeni z dodajanjem dimetil sulfoksida (DMSO), ki zagotavlja ciljno dostavo hidrofobnih signalnih molekul v celično jedro. V tem primeru je kopičenje aktivnih kisikovih spojin v gojišču, pa tudi električna stimulacija, prispevalo k nastanku zrelih kontraktilnih kardiomiocitov.

Ogromna prizadevanja in viri so bili porabljeni za iskanje pogojev za diferenciacijo ESC v celice trebušne slinavke, ki proizvajajo inzulin. Vendar pa je kmalu postalo jasno, da številne specializirane celične linije (β-celice trebušne slinavke, imunske in endokrine celice, adipociti) ne nastanejo iz ESC, če so stimulirane po načelu "en stimulirajoči faktor - ena celična linija". Izkazalo se je, da to načelo velja le za omejeno število celičnih linij. Zlasti lahko nastanek nevronov inducira retinojska kislina, mišična celična linija - transformirajoči rastni faktor-β (TCP-β), eritroidne linije - 1L-6, monocitno-mieloidna linija - 1L-3. Poleg tega so se učinki teh dejavnikov na diferenciacijo ESC izkazali za strogo odvisne od odmerka.

Začela se je faza iskanja kombinacij rastnih faktorjev, ki bi pospešile razvoj embriogeneze (ESC) v poznejše faze embriogeneze z nastankom mezoderma (vir kardiomiocitov, skeletnih mišic, epitelija ledvičnih tubulov, mieloeritropoeze in gladkomišičnih celic), ektoderma (epidermis, nevroni, mrežnica) in endoderma (epitelij tankega črevesa in sekretornih žlez, pnevmociti). Zdelo se je, da narava sili raziskovalce, da gredo naprej po poti embriogeneze, ponavljajoč njene faze v petrijevki, ne da bi jim dala možnost, da bi takoj in enostavno dosegli želeni rezultat. In takšne kombinacije rastnih faktorjev so bile najdene. Aktivin A v kombinaciji s TGF-β se je izkazal za močan stimulator nastajanja mezodermalnih celic iz ESC, hkrati pa blokira razvoj endoderma in ektoderma. Retinojska kislina in kombinacija signalov morfogenetskega proteina kostnega mozga (BMP-4) in epidermalnega rastnega faktorja (EGF) aktivirajo nastajanje ekto- in mezodermnih celic ter ustavijo razvoj endoderma. Opažamo intenzivno rast celic vseh treh zarodnih plasti ob sočasnem vplivu dveh dejavnikov na ESC - rastnega faktorja hepatocitov (HGF) in rastnega faktorja živčnih celic.

Za pridobitev potrebnih celičnih linij je torej treba najprej prenesti embrionalne matične celice v fazo tvorbe celic neke zarodne plasti in nato izbrati novo kombinacijo rastnih faktorjev, ki lahko sprožijo usmerjeno diferenciacijo ekto-, mezo- in endoderma v specializirane celice, potrebne za presaditev pacientu. Število kombinacij rastnih faktorjev danes šteje tisoče, večina jih je patentiranih, nekaterih pa biotehnološka podjetja sploh ne razkrijejo.

Čas je bil, da pridobljene celice očistimo nediferenciranih celičnih nečistoč. Celice, diferencirane v kulturi, smo označili z markerji zrelih celičnih linij in jih prepustili visokohitrostnemu laserskemu imunofenotipskemu sorterju. Laserski žarek jih je našel v splošnem celičnem toku in jih usmeril po ločeni poti. Laboratorijske živali so bile prve, ki so prejele pridobljeni prečiščeni celični material. Čas je bil, da ocenimo učinkovitost uporabe derivatov ESC na modelih bolezni in patoloških procesov. Eden takšnih modelov je bila eksperimentalna Parkinsonova bolezen, ki se pri živalih dobro reproducira z uporabo kemičnih spojin, ki uničujejo dopaminergične nevrone. Ker bolezen pri ljudeh temelji na pridobljeni pomanjkljivosti dopaminergičnih nevronov, je bila uporaba nadomestne celične terapije v tem primeru patogenetično upravičena. Pri živalih z eksperimentalnim hemiparkinsonizmom se je ukoreninila približno polovica dopaminergičnih nevronov, pridobljenih iz ESC in vnesenih v možganske strukture. To je bilo dovolj za znatno zmanjšanje kliničnih manifestacij bolezni. Poskusi obnovitve delovanja poškodovanih struktur osrednjega živčevja pri eksperimentalnih kapi, poškodbah in celo rupturah hrbtenjače so se izkazali za precej uspešne.

Vendar je treba opozoriti, da so bili skoraj vsi primeri uspešne uporabe diferenciranih derivatov ESC za korekcijo eksperimentalne patologije izvedeni v akutnem obdobju simulirane patološke situacije. Rezultati zdravljenja na daljavo niso bili tako tolažilni: po 8–16 mesecih je pozitiven učinek presaditve celic izginil ali se močno zmanjšal. Razlogi za to so precej jasni. Diferenciacija presajenih celic in vitro ali in loco morbi neizogibno vodi do izražanja celičnih markerjev genetske tujosti, kar izzove imunski napad telesa prejemnika. Za rešitev problema imunološke nezdružljivosti je bila uporabljena tradicionalna imunosupresija, vzporedno s katero so klinična preskušanja začela uresničevati potencial transdiferenciacije in genetske korekcije avtolognih hematopoetskih in mezenhimskih matičnih celic, ki ne povzročajo imunskega konflikta.

Kaj je regenerativna plastična medicina?

Evolucija je določila dve glavni možnosti za konec življenjske dobe celice - nekrozo in apoptozo, ki na tkivni ravni ustrezata procesom proliferacije in regeneracije. Proliferacijo lahko obravnavamo kot nekakšno žrtvovanje, ko pride do zapolnitve okvare poškodovanega tkiva zaradi njegove nadomestitve z elementi vezivnega tkiva: ob ohranjanju strukturne integritete telo delno izgubi funkcijo prizadetega organa, kar določa poznejši razvoj kompenzacijskih reakcij s hipertrofijo ali hiperplazijo strukturnih in funkcionalnih elementov, ki ostanejo nedotaknjeni. Trajanje kompenzacijskega obdobja je odvisno od obsega strukturnih lezij, ki jih povzročajo dejavniki primarne in sekundarne spremembe, po kateri v veliki večini primerov pride do dekompenzacije, močnega poslabšanja kakovosti in skrajšanja trajanja človeškega življenja. Fiziološka regeneracija zagotavlja procese preoblikovanja, torej zamenjavo starajočih se in umirajočih celic z mehanizmi naravne celične smrti (apoptoze) z novimi, ki izvirajo iz rezerv matičnih celic človeškega telesa. V procese reparativne regeneracije so vključeni tudi celični viri matičnih prostorov, ki pa se mobilizirajo v patoloških pogojih, povezanih z boleznijo ali poškodbo tkiva, in sprožijo celično smrt z mehanizmi nekroze.

Pozornost znanstvenikov, zdravnikov, tiska, televizije in javnosti do problema preučevanja biologije embrionalnih matičnih celic (EMC) je predvsem posledica visokega potenciala celične ali, kot ji pravimo, regenerativno-plastične terapije. Razvoj metod za zdravljenje najhujših človeških bolezni (degenerativna patologija centralnega živčnega sistema, poškodbe hrbtenjače in možganov, Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen, multipla skleroza, miokardni infarkt, arterijska hipertenzija, sladkorna bolezen, avtoimunske bolezni in levkemija, opekline in neoplastični procesi so še zdaleč nepopoln seznam) temelji na edinstvenih lastnostih matičnih celic, ki omogočajo ustvarjanje novih tkiv, ki nadomestijo, kot se je prej verjelo, nepovratno poškodovana tkiva obolelega organizma.

Napredek teoretičnih raziskav biologije matičnih celic v zadnjih 10 letih se je uresničil s spontano nastajajočimi področji nastajajoče regenerativno-plastične medicine, katere metodologija ni le precej dovzetna za sistematizacijo, ampak jo tudi zahteva. Prvo in najhitreje razvijajoče se področje praktične uporabe regenerativnega potenciala matičnih celic je postala nadomestna regenerativno-plastična terapija. Njeno pot je v znanstveni literaturi dokaj enostavno zaslediti - od poskusov na živalih z miokardno nekrozo do del zadnjih let, namenjenih obnavljanju postinfarktne pomanjkljivosti kardiomiocitov ali obnavljanju izgube β-celic trebušne slinavke in dopaminergičnih nevronov centralnega živčnega sistema.

Presaditev celic

Osnova nadomestne regenerativno-plastične medicine je presaditev celic. Slednjo je treba opredeliti kot kompleks medicinskih ukrepov, med katerimi ima bolnikovo telo neposreden stik z živimi celicami avto-, alo-, izo- ali ksenogenega izvora za krajši ali daljši čas. Sredstvo za presaditev celic je suspenzija matičnih celic ali njihovih derivatov, standardizirana s številom transplantacijskih enot. Transplantacijska enota je razmerje med številom kolonijskih enot v kulturi in skupnim številom presajenih celic. Metode presaditve celic: intravensko, intraperitonealno, subkutano dajanje suspenzije matičnih celic ali njihovih derivatov; dajanje suspenzije matičnih celic ali njihovih derivatov v možganske prekate, limfne žile ali cerebrospinalno tekočino.

Alo- in avtologna presaditev celic uporabljata dva bistveno različna metodološka pristopa k uresničevanju pluri-, multi- ali polipotentnega potenciala matičnih celic - in vivo ali in vitro. V prvem primeru se vnos matičnih celic v bolnikovo telo izvede brez njihove predhodne diferenciacije, v drugem pa po razmnoževanju v kulturi, ciljni diferenciaciji in čiščenju nediferenciranih elementov. Med številnimi metodološkimi tehnikami nadomestne celične terapije se precej jasno ločijo tri skupine metod: zamenjava kostnega mozga in krvnih celic, zamenjava celic organov in mehkih tkiv, zamenjava togih in trdnih elementov telesa (hrustanec, kost, kite, srčne zaklopke in kapacitivne žile). Slednjo smer bi morali opredeliti kot rekonstruktivno in regenerativno medicino, saj se diferenciacijski potencial matičnih celic uresničuje na matriksu - biološko inertni ali absorbantni strukturi, ki je oblikovana kot nadomeščeno območje telesa.

Drug način za povečanje intenzivnosti regenerativno-plastičnih procesov v poškodovanih tkivih je mobilizacija pacientovih lastnih matičnih virov z uporabo eksogenih rastnih faktorjev, kot so granulocitni in granulocitno-makrofagni kolonijsko stimulirajoči faktorji. V tem primeru prekinitev stromalnih povezav povzroči povečanje sproščanja hematopoetskih matičnih celic v splošni krvni obtok, ki na območju poškodbe tkiva zaradi svoje inherentne plastičnosti zagotavljajo regeneracijske procese.

Metode regenerativne medicine so torej usmerjene v spodbujanje procesov obnove izgubljene funkcije - bodisi z mobilizacijo pacientovih lastnih matičnih rezerv bodisi z vnosom alogenskega celičnega materiala.

Pomemben praktični rezultat odkritja embrionalnih matičnih celic je terapevtsko kloniranje, ki temelji na razumevanju sprožilcev embriogeneze. Če je začetni signal za začetek embriogeneze kompleks pre-mRNA, ki se nahaja v citoplazmi oocitov, potem bi moral vnos jedra katere koli somatske celice v enukleirano jajčece sprožiti program razvoja zarodka. Danes že vemo, da pri izvajanju programa embriogeneze sodeluje približno 15.000 genov. Kaj se z njimi zgodi kasneje, po rojstvu, v obdobjih rasti, zrelosti in staranja? Odgovor na to vprašanje je dala ovčka Dolly: ohranijo se. Z uporabo najsodobnejših raziskovalnih metod je bilo dokazano, da jedra odraslih celic ohranijo vse kode, potrebne za nastanek embrionalnih matičnih celic, zarodnih plasti, organogenezo in restrikcijsko zorenje (izhod v diferenciacijo in specializacijo) celičnih linij mezenhimskega, ekto-, endo- in mezodermalnega izvora. Terapevtsko kloniranje kot smer se je oblikovalo že v najzgodnejših fazah razvoja celične transplantologije in predvideva vračanje totipotentnosti pacientovim lastnim somatskim celicam za pridobitev genetsko identičnega transplantacijskega materiala.

Odkrivanje matičnih celic se je začelo »od konca«, saj se je izraz, ki ga je v biologijo in medicino uvedel A. Maksimov, nanašal na matične celice kostnega mozga, iz katerih nastajajo vsi zreli celični elementi periferne krvi. Vendar pa imajo tudi hematopoetske matične celice, tako kot celice vseh tkiv odraslega organizma, svojega, manj diferenciranega predhodnika. Skupni vir za absolutno vse somatske celice je embrionalna matična celica. Treba je opozoriti, da pojma »embrionalne matične celice« in »embrionalne matične celice« nikakor nista enaka. Embrionalne matične celice je J. Thomson izoliral iz notranje celične mase blastociste in jih prenesel v dolgožive celične linije. Le te celice imajo faksimile »embrionalnih matičnih celic«. Leroy Stevens, ki je odkril embrionalne matične celice v poskusih na miših, jih je poimenoval »embrionalne pluripotentne matične celice«, kar se je nanašalo na sposobnost embrionalnih matičnih celic, da se diferencirajo v derivate vseh treh zarodnih plasti (ekto-, mezo- in endoderm). Vendar pa so vse celice zarodka v kasnejših fazah razvoja tudi matične celice, saj iz njih nastane ogromno število celic, ki tvorijo telo odrasle osebe. Za njihovo opredelitev predlagamo izraz »embrionalne pluripotentne progenitorske celice«.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Vrste matičnih celic

Sodobna klasifikacija matičnih celic temelji na načelu njihove delitve glede na njihovo sposobnost (potencijo), da povzročijo nastanek celičnih linij, ki je opredeljena kot toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- in unipotentnost. Totipotentnost, torej sposobnost poustvarjanja gensko programiranega organizma kot celote, imajo zigotne celice, blastomeri in embrionalne matične celice (celice notranje mase blastociste). Drugo skupino totipotentnih celic, ki nastanejo v poznejših fazah embrionalnega razvoja, predstavljajo primarne zarodne celice embrionalnega genitalnega območja (genitalni tuberkuli). Pluripotentnost, ki je sposobnost diferenciacije v celice katerega koli organa ali tkiva, je lastna embrionalnim celicam treh zarodnih plasti - ekto-, mezo- in endoderma. Domneva se, da je multipotentnost, tj. sposobnost tvorbe poljubnih celic znotraj ene specializirane linije, značilna le za dve vrsti celic: tako imenovane mezenhimske matične celice, ki nastanejo v nevralnem grebenu in so predhodnice vseh celic vezivnega tkiva telesa, vključno z nevroglijskimi celicami, ter hematopoetske hematopoetske matične celice, ki dajejo izvor vsem linijam krvnih celic. Poleg tega ločimo bi- in unipotentne matične celice, zlasti predhodnice mieloidnih, limfoidnih, monocitnih in megakariocitnih hematopoetskih kalčkov. Obstoj unipotentnih matičnih celic je bil jasno dokazan na primeru jetrnih celic - izgubo pomembnega dela jetrnega tkiva kompenzira intenzivna delitev diferenciranih poliploidnih hepatocitov.

Med razvojem se vsi organi in tkiva oblikujejo kot posledica proliferacije in diferenciacije notranje celične mase blastociste, katere celice so v ožjem pomenu totipotentne embrionalne matične celice. Prvo delo na izolaciji embrionalnih matičnih celic je opravil Evans, ki je pokazal, da blastociste, vsajene v možgane miši, povzročajo teratokarcinome, katerih celice, ko so klonirane, tvorijo linije pluripotentnih embrionalnih matičnih celic (prvotno ime teh celic - embrionalne karcinomske celice ali v okrajšavi ECС - se trenutno ne uporablja). Te podatke so potrdile številne druge študije, v katerih so bile embrionalne matične celice pridobljene z gojenjem blastocistnih celic miši in drugih živalskih vrst, pa tudi ljudi.

V zadnjih letih se v literaturi vse pogosteje poroča o plastičnosti matičnih celic, ki se ne obravnava le kot sposobnost slednjih, da se diferencirajo v različne tipe celic v različnih fazah razvoja, temveč tudi kot sposobnost dediferenciacije (transdiferenciacije, retrodiferenciacije). To pomeni, da se priznava temeljna možnost vrnitve somatske diferencirane celice v stopnjo embrionalnega razvoja z rekapitulacijo (vrnitvijo) pluripotence in njeno udejanjanje v ponovni diferenciaciji z nastankom celic drugačnega tipa. Zlasti se poroča, da so hematopoetske matične celice sposobne transdiferenciacije z nastankom hepatocitov, kardiomioblastov in endoteliocitov.

Znanstvene razprave o delitvi matičnih celic glede na njihovo plastičnost se nadaljujejo, torej sta terminologija in glosar presaditve celic v procesu oblikovanja, kar ima neposreden praktični pomen, saj večina metod regenerativne plastične medicine temelji na uporabi plastičnih lastnosti in sposobnosti matičnih celic, da se diferencirajo v različne celične linije.

Število publikacij na področju temeljnih in uporabnih problemov regenerativno-plastične medicine hitro narašča. Orisana je že vrsta različnih metodoloških pristopov, katerih cilj je najoptimalnejša uporaba regenerativno-plastičnega potenciala matičnih celic. Kardiologi in endokrinologi, nevrologi in nevrokirurgi, transplantologi in hematologi so opredelili področja, ki jih to pereč zanima. Oftalmologi, ftiziologi, pulmologi, nefrologi, onkologi, genetiki, pediatri, gastroenterologi, terapevti in pediatri, kirurgi in porodničarji-ginekologi iščejo rešitev za pereče probleme v plastičnih zmožnostih matičnih celic - vsi predstavniki sodobne medicine upajo, da bodo dobili priložnost za zdravljenje bolezni, ki so prej veljale za usodne.

Je presaditev celic naslednje "vse zdravilo"?

To vprašanje se upravičeno poraja vsem premišljenim zdravnikom in znanstvenikom, ki analizirajo trenutno stanje medicinske znanosti. Položaj zapleta dejstvo, da so na eni strani polja znanstvene konfrontacije »zdravi konzervativci«, na drugi pa »bolni fanatiki« celične transplantologije. Očitno je resnica, kot vedno, med njimi – na »nikogaršnji zemlji«. Ne da bi se dotaknili vprašanj prava, etike, religije in morale, si poglejmo prednosti in slabosti določenih področij regenerativno-plastične medicine. »Lahka sapica« prvih znanstvenih poročil o terapevtskih možnostih embrionalnih matičnih celic se je leto po njihovem odkritju spremenila v »suhoparen veter«, ki se je leta 2003 zavrtel v »informacijski tornado«. Prva serija publikacij se je ukvarjala z vprašanji gojenja embrionalnih matičnih celic, njihove reprodukcije in usmerjene diferenciacije in vitro.

Izkazalo se je, da je za neomejeno razmnoževanje embrionalnih matičnih celic v kulturi potrebno strogo upoštevati številne pogoje. V pogojenem mediju morajo biti prisotni trije dejavniki: interlevkin-6 (IL-6), faktor matičnih celic (SCF) in faktor zaviranja levkaze (LIF). Poleg tega morajo biti embrionalne matične celice gojene na substratu (hranilni plasti celic) embrionalnih fibroblastov in v prisotnosti fetalnega telečjega seruma. Če so ti pogoji izpolnjeni, ESC v kulturi rastejo kot kloni in tvorijo embrioidna telesa - agregate suspenzijskih klonov sferičnih celic. Najpomembnejša značilnost klona ESC je, da v kulturi embrioidno telo preneha rasti, ko se v agregatu nabere 50-60, največ 100 celic. V tem obdobju nastopi ravnotežno stanje - hitrost delitve celic znotraj klona je enaka hitrosti apoptoze (programirane celične smrti) na njegovi periferiji. Po doseganju takšnega dinamičnega ravnovesja se periferne celice embrioidnega telesa spontano diferencirajo (običajno z nastankom endodermalnih fragmentov rumenjakove vrečke, angioblastov in endoteliocitov) z izgubo totipotentnosti. Zato je treba za pridobitev zadostne količine totipotentne celične mase embrioidno telo tedensko razdeliti s presaditvijo posameznih embrionalnih matičnih celic v nov hranilni medij - kar je precej delovno intenziven postopek.

Odkritje embrionalnih matičnih celic ni odgovorilo na vprašanje, kaj točno in kako sproži programe embriogeneze, šifrirane v DNK zigote. Ostaja nejasno, kako se program genoma odvija med človeškim življenjem. Hkrati je preučevanje embrionalnih matičnih celic omogočilo razvoj koncepta mehanizmov za ohranjanje toti-, pluri- in multipotentnosti matičnih celic med njihovo delitvijo. Glavna značilnost matične celice je njena sposobnost samoreprodukcije. To pomeni, da se matična celica, za razliko od diferencirane celice, deli asimetrično: ena od hčerinskih celic povzroči specializirano celično linijo, druga pa ohrani toti-, pluri- ali multipotentnost genoma. Ostaja nejasno, zakaj in kako se ta proces dogaja v najzgodnejših fazah embriogeneze, ko je delitvena notranja celična masa blastociste v celoti totipotentna, genom ESC pa je v mirujočem (spečem, inhibiranem) stanju. Če med delitvijo navadne celice procesu podvajanja nujno predhodi aktivacija in izražanje celotnega kompleksa genov, se to med delitvijo ESC ne zgodi. Odgovor na vprašanje »zakaj« je bil pridobljen po odkritju že obstoječe mRNA (pre-mRNA) v ESC, od katerih nekatere nastanejo v folikularnih celicah in so shranjene v citoplazmi jajčeca in zigote. Drugo odkritje je odgovorilo na vprašanje »kako«: v ESC so našli posebne encime, imenovane »editaze«. Editaze opravljajo tri pomembne funkcije. Prvič, zagotavljajo alternativno epigenetsko (brez sodelovanja genoma) branje in podvajanje pre-mRNA. Drugič, izvajajo proces aktivacije pre-mRNA (spajanje - izrezovanje intronov, torej neaktivnih delov RNK, ki zavirajo proces sinteze beljakovin na mRNA), po katerem se v celici začne sestavljanje beljakovinskih molekul. Tretjič, editaze spodbujajo nastanek sekundarnih mRNA, ki so represorji mehanizmov izražanja genov, kar ohranja gosto pakiranje kromatina in neaktivno stanje genov. Beljakovinski produkti, sintetizirani na takšnih sekundarnih mRNA in imenovani proteini dušilci ali varuhi genoma, so prisotni v človeških jajčnih celicah.

Tako je danes predstavljen mehanizem nastanka nesmrtnih celičnih linij embrionalnih matičnih celic. Preprosto povedano, signal za zagon programa embriogeneze, katerega začetne faze so sestavljene iz nastanka totipotentne celične mase, prihaja iz citoplazme jajčeca. Če je v tej fazi notranja celična masa blastociste, torej ESC, izolirana od nadaljnjih regulatornih signalov, se proces samorazmnoževanja celic odvija v zaprtem ciklu brez sodelovanja genov celičnega jedra (epigenetsko). Če je takšna celica oskrbljena s hranilnim materialom in izolirana od zunanjih signalov, ki spodbujajo diferenciacijo celične mase, se bo v nedogled delila in razmnoževala sebi podobno.

Prvi rezultati eksperimentalnih poskusov uporabe totipotentnih celic za presaditev so bili precej impresivni: vnos embrionalnih matičnih celic v tkiva miši z imunskim sistemom, oslabljenim zaradi imunosupresivov, je v 100 % primerov privedel do razvoja tumorjev. Med celicami neoplazme, katerih vir so bile embrionalne matične celice (EMC), so bili diferencirani derivati totipotentnega eksogenega celičnega materiala, zlasti nevroni, vendar je rast teratokarcinomov vrednost dobljenih rezultatov zmanjšala na nič. Hkrati so v delih L. Stevensa ESC, vnesene v trebušno votlino, tvorile velike agregate, v katerih so se fragmentarno oblikovale embrionalne mišice, srce, lasje, koža, kosti, mišice in živčno tkivo. (Kirurgi, ki so odpirali dermoidne ciste, bi morali biti seznanjeni s to sliko). Zanimivo je, da se suspendirane mišje embrioblastne celice obnašajo popolnoma enako: njihov vnos v tkiva odraslih živali z oslabljenim imunskim sistemom vedno povzroči nastanek teratokarcinomov. Če pa iz takega tumorja izoliramo čisto linijo ESC in jo vnesemo v trebušno votlino, potem spet nastanejo specializirani somatski derivati vseh treh zarodnih plasti brez znakov karcinogeneze.

Naslednji problem, ki ga je bilo treba rešiti, je bil torej čiščenje celičnega materiala od nečistoč nediferenciranih celic. Vendar pa tudi pri zelo visoki učinkovitosti ciljne celične diferenciacije do 20 % celic v kulturi ohrani svoj totipotentni potencial, ki se in vivo žal uresničuje pri rasti tumorja. Še ena "frača" narave - na lestvici medicinskega tveganja se zagotovilo za ozdravitev bolnika uravnoteži z zagotovilom za njegovo smrt.

Razmerje med tumorskimi celicami in embrionalnimi pluripotentnimi progenitornimi celicami (EPPC), ki so v razvoju naprednejše od ESC, je precej dvoumno. Rezultati naših študij so pokazali, da lahko vnos EPPC v različne presadljive tumorje pri podganah povzroči razpad tumorskega tkiva (G), hitro povečanje tumorske mase (D), njeno zmanjšanje (E-3) ali pa ne vpliva na velikost spontane centralne fokalne nekroze neoplastičnega tkiva (I, K). Očitno je, da je rezultat interakcije EPPC in tumorskih celic določen s celotnim naborom citokinov in rastnih faktorjev, ki jih te proizvajajo in vivo.

Omeniti velja, da se embrionalne matične celice, ki se na stik z odraslimi tkivi odzivajo s karcinogenezo, popolnoma asimilirajo s celično maso zarodka in se integrirajo v vse organe zarodka. Takšne himere, ki jih sestavljajo lastne celice zarodka in donorske ESC, imenujemo alofenske živali, čeprav v resnici niso fenotipske himere. Hematopoetski sistem, koža, živčno tkivo, jetra in tanko črevo doživijo največjo celično himerizacijo, ko so ESC vnesene v zgodnji zarodek. Opisani so bili primeri himerizacije genitalij. Edino območje, ki je nedotakljivo za ESC, so primarne zarodne celice.

To pomeni, da zarodek ohrani genetske informacije svojih staršev, kar ščiti čistost in nadaljevanje tako rodu kot vrste.

V pogojih blokade delitve celic zgodnjega zarodka z uporabo citoklazina vnos embrionalnih matičnih celic v blastocisto vodi do razvoja zarodka, katerega primarne zarodne celice so bile, tako kot vse druge, oblikovane iz donorskih embrionalnih matičnih celic. Toda v tem primeru je sam zarodek popolnoma donorski, genetsko tuj telesu nadomestne matere. Mehanizmi takšne naravne blokade potenciala za mešanje lastnih in tujih dednih informacij še niso pojasnjeni. Lahko domnevamo, da se v tem primeru uresničuje program apoptoze, katerega determinante nam še niso znane.

Treba je opozoriti, da embriogeneza živali različnih vrst ni nikoli usklajena: pri izvajanju donorske programa organogeneze v telesu prejemnega zarodka ksenogenih embrionalnih matičnih celic zarodek umre v maternici in se resorbira. Zato je treba obstoj himer "podgana-miš", "prašič-krava", "človek-podgana" razumeti kot celični, ne pa morfološki mozaicizem. Z drugimi besedami, ko se ESC ene vrste sesalcev vnesejo v blastocisto druge vrste, se vedno razvijejo potomci materine vrste, v katerih se med lastnimi celicami skoraj vseh organov nahajajo vključki, včasih pa tudi skupki strukturnih in funkcionalnih enot, sestavljenih iz gensko tujega materiala derivatov ESC. Izraza "humaniziran prašič" ni mogoče razumeti kot oznako nekakšne pošasti, obdarjene z inteligenco ali zunanjimi značilnostmi človeka. To je le žival, katere del telesnih celic izvira iz človeških ESC, vnesenih v blastocisto prašiča.

Možnosti uporabe matičnih celic

Že dolgo je znano, da se bolezni, povezane z genopatologijo hematopoetskih in limfoidnih linijskih celic, po alogenski presaditvi kostnega mozga pogosto odpravijo. Zamenjava lastnega hematopoetskega tkiva z genetsko normalnimi celicami sorodnega darovalca vodi do delnega in včasih popolnega okrevanja bolnika. Med genetskimi boleznimi, ki se zdravijo z alogensko presaditvijo kostnega mozga, velja omeniti sindrom kombinirane imunske pomanjkljivosti, X-vezano agamaglobulinemijo, kronično granulomatozo, Wiskott-Aldrichov sindrom, Gaucherjevo in Hurlerjevo bolezen, adrenolevkodistrofijo, metakromatsko levkodistrofijo, srpastocelično anemijo, talasemijo, Fanconijevo anemijo in AIDS. Glavna težava pri uporabi alogenske presaditve kostnega mozga pri zdravljenju teh bolezni je povezana z izbiro HbA-združljivega sorodnega darovalca, za uspešno iskanje katerega je potrebnih povprečno 100.000 vzorcev tipiziranega darovalčevega hematopoetskega tkiva.

Genska terapija omogoča odpravo genetske napake neposredno v bolnikovih hematopoetskih matičnih celicah. Teoretično genska terapija zagotavlja enake prednosti pri zdravljenju genetskih bolezni hematopoetskega sistema kot alogenska presaditev kostnega mozga, vendar brez vseh možnih imunoloških zapletov. Vendar pa to zahteva tehniko, ki omogoča učinkovit prenos polnopravnega gena v hematopoetske matične celice in ohranjanje zahtevane ravni njegove ekspresije, ki pri nekaterih vrstah dedne patologije morda ni zelo visoka. V tem primeru že rahlo obnavljanje beljakovinskega produkta pomanjkljivega gena daje pozitiven klinični učinek. Zlasti pri hemofiliji B je 10–20 % normalne ravni faktorja IX povsem dovolj za obnovitev notranjega mehanizma strjevanja krvi. Genetska modifikacija avtolognega celičnega materiala se je izkazala za uspešno pri eksperimentalnem hemiparkinsonizmu (enostransko uničenje dopaminergičnih nevronov). Transfekcija fibroblastov podganjih zarodkov z retrovirusnim vektorjem, ki vsebuje gen za tirozin hidroksilazo, je zagotovila sintezo dopamina v centralnem živčnem sistemu: intracerebralno dajanje transficiranih fibroblastov je močno zmanjšalo intenzivnost kliničnih manifestacij eksperimentalnega modela Parkinsonove bolezni pri poskusnih živalih.

Možnost uporabe matičnih celic za gensko zdravljenje človeških bolezni je za zdravnike in eksperimentatorje postavila številne nove izzive. Problematični vidiki genske terapije so povezani z razvojem varnega in učinkovitega sistema za prenos genov v ciljno celico. Trenutno je učinkovitost prenosa genov v velike sesalske celice zelo nizka (1 %). Metodično se ta problem rešuje na različne načine. Prenos genov in vitro vključuje transfekcijo genskega materiala v bolnikove celice v kulturi, ki jo nato vrnejo v bolnikovo telo. Ta pristop je treba prepoznati kot optimalen pri uporabi genov, vnesenih v matične celice kostnega mozga, saj so metode za prenos hematopoetskih celic iz telesa v kulturo in nazaj dobro uveljavljene. Retrovirusi se najpogosteje uporabljajo za prenos genov v hematopoetske celice in vitro. Vendar pa je večina hematopoetskih matičnih celic v stanju mirovanja, kar otežuje prenos genetskih informacij z uporabo retrovirusov in zahteva iskanje novih načinov učinkovitega prenosa genov v mirujoče matične celice. Trenutno se uporabljajo metode prenosa genov, kot so transfekcija, neposredna mikroinjekcija DNK v celice, lipofekcija, elektroporacija, »genska pištola«, mehansko spajanje z uporabo steklenih kroglic, transfekcija hepatocitov z receptorsko odvisno vezavo DNK na asialoglikoprotein in aerosolni vnos transgena v celice alveolarnega epitelija pljuč. Učinkovitost prenosa DNK s temi metodami je 10,0–0,01 %. Z drugimi besedami, odvisno od načina vnosa genetskih informacij lahko pričakujemo uspeh pri 10 bolnikih od 100 ali pri 1 bolniku od 10.000 bolnikov. Očitno je, da učinkovita in hkrati varna metoda prenosa terapevtskih genov še ni bila razvita.

Bistveno drugačna rešitev problema zavrnitve alogenskega celičnega materiala v celični transplantologiji je uporaba visokih odmerkov embrionalnih pluripotentnih progenitorskih celic za doseganje učinka ponovne namestitve sistema za nadzor antigenske homeostaze odraslega organizma (učinek Kukharchuk-Radchenko-Sirman), katerega bistvo je v indukciji imunološke tolerance z ustvarjanjem nove baze imunokompetentnih celic s hkratnim reprogramiranjem sistema za nadzor antigenske homeostaze. Po uvedbi visokih odmerkov EPPC se slednje fiksirajo v tkivih timusa in kostnega mozga. V timusu se EPPC pod vplivom specifičnega mikrookolja diferencirajo v dendritične, interdigitne celice in epitelijsko-stromalne elemente. Med diferenciacijo EPPC v prejemnikovem timusu se poleg prejemnikovih lastnih molekul glavnega kompleksa histokompatibilnosti (MHC) izražajo tudi molekule MHC, ki so genetsko določene v donorskih celicah, torej se vzpostavi dvojni standard molekul MHC, po katerem se uresničuje pozitivna in negativna selekcija T-limfocitov.

Tako se obnova efektorske povezave imunskega sistema prejemnika zgodi preko znanih mehanizmov pozitivne in negativne selekcije T-limfocitov, vendar preko dvojnega standarda molekul MHC - prejemnikovih in darovalčevih EPPC.

Reprogramiranje imunskega sistema z uporabo EPPC ne omogoča le presaditve celic brez poznejše dolgotrajne uporabe imunosupresivov, temveč odpira tudi povsem nove možnosti pri zdravljenju avtoimunskih bolezni in zagotavlja oporo za razvoj novih idej o procesu staranja človeka. Da bi razumeli mehanizme staranja, smo predlagali teorijo izčrpavanja telesnih matičnih prostorov. V skladu z glavno določbo te teorije je staranje trajno zmanjšanje velikosti telesnih matičnih prostorov, ki se razume kot bazen regionalnih ("odraslih") matičnih celic (mezenhimskih, nevronskih, hematopoetskih matičnih celic, progenitorskih celic kože, prebavnega trakta, endokrinega epitelija, pigmentnih celic ciliarnih gub itd.), ki nadomeščajo celične izgube ustreznega tkiva v procesu preoblikovanja telesa. Preoblikovanje telesa je obnova celične sestave vseh tkiv in organov zaradi celic matičnih prostorov, ki se nadaljuje skozi vse življenje večceličnega organizma. Število celic v matičnih prostorih je genetsko določeno, kar določa omejeno velikost (proliferativni potencial) vsakega matičnega prostora. Velikost matičnih prostorov pa določa hitrost staranja posameznih organov, tkiv in telesnih sistemov. Po izčrpanju celičnih rezerv matičnih prostorov intenzivnost in hitrost staranja večceličnega organizma določajo mehanizmi staranja somatsko diferenciranih celic znotraj Hayflickove meje.

Zato lahko v fazi postnatalne ontogeneze širitev matičnih prostorov ne le znatno podaljša življenjsko dobo, temveč tudi izboljša kakovost življenja z obnovitvijo potenciala preoblikovanja telesa. Širitev matičnih prostorov je mogoče doseči z vnosom velikih odmerkov alogenskih embrionalnih pluripotentnih progenitorskih celic, pod pogojem, da se hkrati reprogramira imunski sistem prejemnika, kar znatno podaljša življenjsko dobo starih miši v poskusu.

Teorija izčrpavanja matičnih prostorov lahko spremeni obstoječe predstave ne le o mehanizmih staranja, temveč tudi o sami bolezni in posledicah njenega zdravljenja z zdravili. Bolezen se lahko razvije kot posledica patologije matičnih prostorov (onkopatologija). Izčrpavanje rezerve mezenhimskih matičnih celic moti procese preoblikovanja vezivnega tkiva, kar vodi do pojava zunanjih znakov staranja (gube, mlahavost kože, celulit). Izčrpavanje rezerve matičnih endotelijskih celic povzroča razvoj arterijske hipertenzije in ateroskleroze. Začetno majhna velikost timusnega matičnega prostora določa njegovo zgodnjo trajno starostno involucijo. Prezgodnje staranje je posledica začetnega patološkega zmanjšanja velikosti vseh matičnih prostorov v telesu. Stimulacija rezerv matičnih celic z zdravili in brez zdravil izboljša kakovost življenja z zmanjšanjem njegovega trajanja, saj zmanjša velikost matičnih prostorov. Nizka učinkovitost sodobnih geroprotektorjev je posledica njihovega zaščitnega učinka na starajoče se diferencirane somatske celice in ne na matične prostore v telesu.

Za zaključek bi še enkrat poudarili, da je regenerativno-plastična medicina nova smer v zdravljenju človeških bolezni, ki temelji na uporabi regenerativno-plastičnega potenciala matičnih celic. V tem primeru plastičnost razumemo kot sposobnost eksogenih ali endogenih matičnih celic, da se vsadijo in povzročijo nastanek novih specializiranih celičnih kalčkov v poškodovanih tkivnih območjih obolelega organizma. Predmet regenerativno-plastične medicine so smrtonosne človeške bolezni, ki so trenutno neozdravljive, dedna patologija, bolezni, pri katerih metode tradicionalne medicine dosegajo le simptomatski učinek, pa tudi anatomske okvare telesa, katerih obnova je cilj rekonstruktivno-plastično regenerativne kirurgije. Po našem mnenju je še prezgodaj, da bi prve poskuse poustvarjanja celih in funkcionalno popolnih organov iz matičnih celic obravnavali kot ločeno področje praktične medicine. Predmet regenerativno-plastične medicine so matične celice, ki imajo glede na vir njihovega prejema različen regenerativno-plastični potencial. Metodologija regenerativne plastične medicine temelji na presaditvi matičnih celic ali njihovih derivatov.