Umetne srčne zaklopke

Sodobne biološke umetne srčne zaklopke, ki so na voljo za klinično uporabo, z izjemo pljučnega avtografta, so neživne strukture, ki nimajo potenciala za rast in obnovo tkiva. To nalaga znatne omejitve pri njihovi uporabi, zlasti pri otrocih, za korekcijo patologije zaklopk. Tkivno inženirstvo se je razvilo v zadnjih 15 letih. Cilj te znanstvene smeri je ustvariti v umetnih pogojih strukture, kot so umetne srčne zaklopke, s tromborezistentno površino in živim intersticijem.

[ 1 ], [ 2 ]

Kako se razvijajo umetne srčne zaklopke?

Znanstveni koncept tkivnega inženirstva temelji na ideji naseljevanja in gojenja živih celic (fibroblastov, matičnih celic itd.) v sintetičnem ali naravnem absorbirajočem ogrodju (matrici), ki je tridimenzionalna ventilska struktura, ter na uporabi signalov, ki uravnavajo izražanje genov, organizacijo in produktivnost presajenih celic v obdobju nastajanja zunajceličnega matriksa.

Takšne umetne srčne zaklopke se integrirajo s pacientovim tkivom za končno obnovo in nadaljnje vzdrževanje njihove strukture in funkcije. V tem primeru se na originalni matrici kot posledica delovanja celic (fibroblastov, miofibroblastov itd.) oblikuje nov kolageno-elastinski okvir oziroma zunajcelični matriks. Posledično bi morale biti optimalne umetne srčne zaklopke, ustvarjene s tkivnim inženiringom, po anatomski strukturi in funkciji blizu nativnim, poleg tega pa bi morale imeti tudi biomehansko prilagodljivost, sposobnost reparacije in rasti.

Tkivno inženirstvo razvija umetne srčne zaklopke z uporabo različnih virov zbiranja celic. Tako se lahko uporabijo ksenogene ali alogene celice, čeprav so prve povezane s tveganjem prenosa zoonoz na ljudi. Z gensko modifikacijo alogenskih celic je mogoče zmanjšati antigenost in preprečiti zavrnitvene reakcije telesa. Tkivno inženirstvo zahteva zanesljiv vir celic. Tak vir so avtogene celice, odvzete neposredno od pacienta, in med ponovno implantacijo ne povzročajo imunskih reakcij. Učinkovite umetne srčne zaklopke se proizvajajo na osnovi avtolognih celic, pridobljenih iz krvnih žil (arterij in ven). Za pridobivanje čistih celičnih kultur je bila razvita metoda, ki temelji na uporabi fluorescenčno aktiviranega sortiranja celic - FACS. Mešana celična populacija, pridobljena iz krvne žile, je označena z acetiliranim markerjem lipoproteinov nizke gostote, ki se selektivno absorbira na površini endoteliocitov. Endotelijske celice je nato mogoče enostavno ločiti od večine celic, pridobljenih iz žil, ki bodo mešanica gladkomišičnih celic, miofibroblastov in fibroblastov. Vir celic, bodisi arterija ali vena, bo vplival na lastnosti končnega konstrukta. Tako so umetne srčne zaklopke z matrico, posejano z venskimi celicami, boljše pri tvorbi kolagena in mehanski stabilnosti kot konstrukti, posejani z arterijskimi celicami. Zdi se, da je izbira perifernih ven bolj primeren vir zbiranja celic.

Miofibroblaste je mogoče odvzeti tudi iz karotidnih arterij. Vendar pa imajo celice, pridobljene iz žil, bistveno drugačne lastnosti od naravnih intersticijskih celic. Kot alternativni vir celic se lahko uporabijo avtologne celice popkovine.

Umetne srčne zaklopke na osnovi matičnih celic

V zadnjih letih je napredek v tkivnem inženirstvu olajšala raziskava matičnih celic. Uporaba matičnih celic rdečega kostnega mozga ima svoje prednosti. Zlasti enostavnost zbiranja biomateriala in gojenja in vitro s poznejšo diferenciacijo v različne vrste mezenhimskih celic omogoča, da se izognemo uporabi intaktnih žil. Matične celice so pluripotentni viri celičnih linij in imajo edinstvene imunološke značilnosti, ki prispevajo k njihovi stabilnosti v alogenskih pogojih.

Človeške matične celice rdečega kostnega mozga pridobimo s sternalno punkcijo ali punkcijo iliakalnega grebena. Izoliramo jih iz 10–15 ml sternumskega aspirata, ločimo od drugih celic in gojimo. Ko dosežemo potrebno število celic (običajno v 21–28 dneh), jih zasejemo (koloniziramo) na matrice in gojimo v hranilnem mediju v statičnem položaju (7 dni v vlažnem inkubatorju pri 37 °C v prisotnosti 5 % CO2). Nato se rast celic stimulira s kupturalnim medijem (biološki dražljaji) ali z ustvarjanjem fizioloških pogojev za rast tkiva med njegovo izometrično deformacijo v reprodukcijskem aparatu s pulzirajočim tokom – bioreaktorju (mehanski dražljaji). Fibroblasti so občutljivi na mehanske dražljaje, ki spodbujajo njihovo rast in funkcionalno aktivnost. Pulzirajoči tok povzroči povečanje tako radialnih kot obodnih deformacij, kar vodi do orientacije (raztezka) naseljenih celic v smeri takšnih napetosti. To pa posledično vodi do nastanka usmerjenih vlaknastih struktur zaklopk. Konstanten tok povzroča le tangencialne napetosti na stenah. Pulzirajoči tok ugodno vpliva na celično morfologijo, proliferacijo in sestavo zunajceličnega matriksa. Narava toka hranilnega medija ter fizikalno-kemijski pogoji (pH, pO2 in pCO2) v bioreaktorju prav tako pomembno vplivajo na proizvodnjo kolagena. Tako laminarni tok in ciklični vrtinčni tokovi povečajo proizvodnjo kolagena, kar vodi do izboljšanih mehanskih lastnosti.

Drug pristop k gojenju tkivnih struktur je ustvarjanje embrionalnih pogojev v bioreaktorju namesto simuliranja fizioloških pogojev človeškega telesa. Tkivni bioventili, vzgojeni na osnovi matičnih celic, imajo mobilne in fleksibilne lopute, ki so funkcionalno sposobne pod vplivom visokega tlaka in pretoka, ki presega fiziološko raven. Histološke in histokemijske študije loput teh struktur so pokazale prisotnost aktivnih procesov biodestrukcije matriksa in njegove zamenjave z živim tkivom. Tkivo je organizirano po plastovitem tipu z značilnostmi zunajceličnih matriksnih proteinov, podobnimi tistim v nativnem tkivu, prisotnostjo kolagena tipov I in III ter glikozaminoglikanov. Vendar pa tipična triplastna struktura loput - ventrikularna, gobasta in vlaknasta plast - ni bila dosežena. ASMA-pozitivne celice, ki izražajo vimentin, najdene v vseh fragmentih, so imele značilnosti, podobne tistim v miofibroblastih. Elektronska mikroskopija je razkrila celične elemente z značilnostmi, značilnimi za žive, sekretorno aktivne miofibroblaste (aktinske/miozinski filamenti, kolagenske niti, elastin) in endotelijske celice na površini tkiva.

Na lističih so bili zaznani kolageni tipov I, III, ASMA in vimentin. Mehanske lastnosti lističev tkivnih in naravnih struktur so bile primerljive. Umetne srčne zaklopke iz tkiva so v 20 tednih pokazale odlično delovanje in so bile po svoji mikrostrukturi, biokemičnem profilu in tvorbi beljakovinskega matriksa podobne naravnim anatomskim strukturam.

Vse umetne srčne zaklopke, pridobljene s tkivnim inženiringom, so bile živalim vstavljene v pljučni položaj, saj njihove mehanske lastnosti ne ustrezajo obremenitvam v aortnem položaju. Tkivne zaklopke, odvzete živalim, so po strukturi podobne nativnim, kar kaže na njihov nadaljnji razvoj in prestrukturiranje in vivo. Ali se bo proces prestrukturiranja in zorenja tkiva nadaljeval v fizioloških pogojih po vstavitvi umetnih srčnih zaklopk, kot je bilo opaženo v poskusih na živalih, bodo pokazale nadaljnje študije.

Idealne umetne srčne zaklopke bi morale imeti poroznost vsaj 90 %, saj je to bistveno za rast celic, dostavo hranil in odstranjevanje celičnih presnovnih produktov. Poleg biokompatibilnosti in biorazgradljivosti bi morale imeti umetne srčne zaklopke kemično ugodno površino za sejanje celic in se ujemati z mehanskima lastnostmi naravnega tkiva. Stopnja biorazgradnje matriksa mora biti nadzorovana in sorazmerna s stopnjo nastajanja novega tkiva, da se zagotovi mehanska stabilnost skozi čas.

Trenutno se razvijajo sintetične in biološke matrice. Najpogostejši biološki materiali za ustvarjanje matric so donorske anatomske strukture, kolagen in fibrin. Polimerne umetne srčne zaklopke so zasnovane tako, da se po implantaciji biološko razgradijo, ko vsajene celice začnejo proizvajati in organizirati lastno zunajcelično matriksno mrežo. Nastanek novega matriksnega tkiva lahko regulirajo ali spodbujajo rastni faktorji, citokini ali hormoni.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Umetne srčne zaklopke darovalcev

Kot matrice se lahko uporabijo umetne srčne zaklopke darovalcev, pridobljene od ljudi ali živali in osiromašene s celičnimi antigeni z decelularizacijo za zmanjšanje njihove imunogenosti. Ohranjene beljakovine zunajceličnega matriksa so osnova za kasnejšo adhezijo zasejanih celic. Obstajajo naslednje metode odstranjevanja celičnih elementov (acelularizacija): zamrzovanje, obdelava s tripsinom/EDTA, detergenti - natrijev dodecil sulfat, natrijev deoksikolat, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, pa tudi večstopenjske encimske metode obdelave. V tem primeru se odstranijo celične membrane, nukleinske kisline, lipidi, citoplazmatske strukture in topne molekule matriksa, hkrati pa se ohranita kolagen in elastin. Vendar idealne metode še niso našli. Le natrijev dodecil sulfat (0,03-1 %) ali natrijev deoksikolat (0,5-2 %) je po 24 urah obdelave povzročil popolno odstranitev celic.

Histološka preiskava odstranjenih decelulariziranih biovalv (alografta in ksenografta) v poskusu na živalih (pes in prašič) je pokazala delno endotelizacijo in vraščanja prejemniških miofibroblastov v bazo, brez znakov kalcifikacije. Opazili so zmerno vnetno infiltracijo. Vendar pa se je med kliničnimi preskušanji decelulariziranega ventila SynerGraft™ razvila zgodnja odpoved. V matriksu bioproteze so zaznali izrazito vnetno reakcijo, ki je bila sprva nespecifična in jo je spremljala limfocitna reakcija. V enem letu se je razvila disfunkcija in degeneracija bioproteze. Celična kolonizacija matriksa ni bila opažena, zaznali pa so kalcifikacijo ventilov in ostanke predimplantacijskih celic.

Brezcelične matrice, zasejane z endotelijskimi celicami in gojene in vitro ter in vivo, so na površini zaklopk tvorile koherentno plast, zasejane intersticijske celice z nativno strukturo pa so pokazale svojo sposobnost diferenciacije. Vendar pa v dinamičnih pogojih bioreaktorja ni bilo mogoče doseči zahtevane fiziološke ravni kolonizacije celic na matriksu, vsajene umetne srčne zaklopke pa je spremljalo dokaj hitro (trimesečno) zgostitev zaradi pospešene proliferacije celic in tvorbe zunajceličnega matriksa. Zato ima na tej stopnji uporaba brezceličnih matric donorjev za njihovo kolonizacijo s celicami številne nerešene težave, vključno z imunološkimi in infekcijskimi; delo na decelulariziranih bioprotezah se nadaljuje.

Treba je opozoriti, da je kolagen tudi eden od potencialnih bioloških materialov za izdelavo matric, ki so sposobne biorazgradnje. Uporablja se lahko v obliki pene, gela ali plošč, gobic in kot surovec na osnovi vlaken. Vendar pa je uporaba kolagena povezana s številnimi tehnološkimi težavami. Zlasti ga je težko dobiti od pacienta. Zato je trenutno večina kolagenskih matric živalskega izvora. Počasna biorazgradnja živalskega kolagena lahko prinaša povečano tveganje za okužbo z zoonozami ter povzroči imunološke in vnetne reakcije.

Fibrin je še en biološki material z nadzorovanimi biorazgradljivimi lastnostmi. Ker je mogoče iz pacientove krvi izdelati fibrinske gele za nadaljnjo izdelavo avtologne matrice, implantacija takšne strukture ne bo povzročila njene toksične razgradnje in vnetne reakcije. Vendar pa ima fibrin pomanjkljivosti, kot so difuzija in izpiranje v okolje ter nizke mehanske lastnosti.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Umetne srčne zaklopke iz sintetičnih materialov

Umetne srčne zaklopke so prav tako izdelane iz sintetičnih materialov. Več poskusov izdelave matric zaklopk je temeljilo na uporabi poliglaktina, poliglikolne kisline (PGA), polimlečne kisline (PLA), kopolimera PGA in PLA (PLGA) ter polihidroksialkanoatov (PHA). Visoko porozni sintetični material je mogoče pridobiti iz pletenih ali nepletenih vlaken in z uporabo tehnologije izpiranja s soljo. Obetaven kompozitni material (PGA/P4HB) za izdelavo matric se pridobiva iz nepletenih zank poliglikolne kisline (PGA), prevlečenih s poli-4-hidroksibutiratom (P4HB). Umetne srčne zaklopke, izdelane iz tega materiala, so sterilizirane z etilen oksidom. Vendar pa znatna začetna togost in debelina zank teh polimerov, njihova hitra in nenadzorovana razgradnja, ki jo spremlja sproščanje kislih citotoksičnih produktov, zahtevajo nadaljnje raziskave in iskanje drugih materialov.

Uporaba avtolognih plošč za tkivne kulture miofibroblastov, gojenih na nosilcu za tvorbo podpornih matric s spodbujanjem proizvodnje teh celic, je omogočila pridobitev vzorcev zaklopk z aktivnimi živimi celicami, obdanimi z zunajceličnim matriksom. Vendar pa mehanske lastnosti tkiv teh zaklopk še vedno niso zadostne za njihovo implantacijo.

Zahtevane ravni proliferacije in regeneracije tkiva ustvarjene zaklopke morda ni mogoče doseči zgolj z združevanjem celic in matriksa. Izražanje celičnih genov in tvorbo tkiva je mogoče regulirati ali spodbuditi z dodajanjem rastnih faktorjev, citokinov ali hormonov, mitogenih faktorjev ali adhezijskih faktorjev v matrike in nosilce. Možnost vnosa teh regulatorjev v matrične biomateriale se preučuje. Na splošno primanjkuje raziskav o regulaciji tvorbe tkivnih zaklopk z biokemičnimi dražljaji.

Acelularna prašičja ksenogena pljučna bioproteza Matrix P je sestavljena iz decelulariziranega tkiva, obdelanega po posebnem patentiranem postopku podjetja AutoTissue GmbH, vključno z obdelavo z antibiotiki, natrijevim deoksiholatom in alkoholom. Ta metoda obdelave, ki jo je odobrila Mednarodna organizacija za standardizacijo, odstrani vse žive celice in postcelične strukture (fibroblaste, endotelijske celice, bakterije, viruse, glive, mikoplazmo), ohrani arhitekturo zunajceličnega matriksa, zmanjša raven DNK in RNK v tkivih na minimum, kar zmanjša verjetnost prenosa prašičjega endogenega retrovirusa (PERV) na ljudi na nič. Bioproteza Matrix P je sestavljena izključno iz kolagena in elastina z ohranjeno strukturno integracijo.

V poskusih na ovcah je bila 11 mesecev po implantaciji bioproteze Matrix P zabeležena minimalna reakcija okoliških tkiv z dobro stopnjo preživetja, kar je bilo še posebej očitno na sijoči notranji površini endokarda. Vnetne reakcije, odebelitev in skrajšanje zaklopk so bili praktično odsotni. Zabeležene so bile tudi nizke ravni kalcija v tkivu bioproteze Matrix P, pri čemer je bila razlika statistično pomembna v primerjavi s tistimi, ki so bile zdravljene z glutaraldehidom.

Umetna srčna zaklopka Matrix P se prilagodi individualnemu stanju bolnika v nekaj mesecih po vstavitvi. Pregled na koncu kontrolnega obdobja je pokazal intakten zunajcelični matriks in konfluentni endotelij. Ksenograft Matrix R, vsajen 50 bolnikom s prirojenimi napakami med Rossovim postopkom med letoma 2002 in 2004, je pokazal vrhunsko delovanje in nižje transvalvularne gradiente tlaka v primerjavi s krioprezerviranimi in decelulariziranimi alografti SynerGraftMT in z glutaraldehidom obdelanimi bioprotezami brez odra. Umetne srčne zaklopke Matrix P so namenjene zamenjavi pljučne zaklopke med rekonstrukcijo iztočnega trakta desnega prekata pri operacijah prirojenih in pridobljenih napak ter med zamenjavo pljučne zaklopke med Rossovim postopkom. Na voljo so v 4 velikostih (po notranjem premeru): za novorojenčke (15–17 mm), za otroke (18–21 mm), srednje velike (22–24 mm) in odrasle (25–28 mm).

Napredek pri razvoju tkivno inženirskih zaklopk bo odvisen od napredka v biologiji celic zaklopk (vključno z vprašanji izražanja in regulacije genov), študij embriogenega in starostno povezanega razvoja zaklopk (vključno z angiogenimi in nevrogenimi dejavniki), natančnega poznavanja biomehanike vsake zaklopke, identifikacije ustreznih celic za sejanje in razvoja optimalnih matric. Nadaljnji razvoj naprednejših tkivnih zaklopk bo zahteval temeljito razumevanje razmerja med mehanskimi in strukturnimi značilnostmi naravnih zaklopk ter dražljaji (biološkimi in mehanskimi) za poustvarjanje teh značilnosti in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]