Vloga kristalnih depozitov v patogenezi osteoartritisa

Kristali bazičnega kalcijevega fosfata (BCP) se nahajajo v sinovialni tekočini 30–60 % bolnikov z osteoartritisom. Po podatkih A. Swan et al. (1994) se kristali, ki vsebujejo kalcij, nahajajo v sinovialni tekočini veliko večjega števila bolnikov z osteoartritisom; vendar zaradi izjemno majhne velikosti kristalov ali njihovega majhnega števila niso identificirani s konvencionalnimi tehnikami. Prisotnost kristalov BCP v sinovialni tekočini je povezana z radiografskimi znaki degeneracije sklepnega hrustanca in je povezana z večjim volumnom izliva v primerjavi z izlivom v kolenskih sklepih brez kristalov. Študija dejavnikov, ki vplivajo na radiografsko napredovanje gonartroze, je pokazala, da je odlaganje kristalov kalcijevega pirofosfat dihidrata (CPPD) napovedovalec neugodnega kliničnega in radiografskega izida. V študiji starejših bolnikov so ugotovili, da je osteoartritis povezan s hondrokalcinozo, zlasti v lateralnem tibiofemoralnem predelu kolena in prvih treh metakarpofalangealnih sklepih. Ni neobičajno, da pri bolnikih z osteoartritisom najdemo obe vrsti kristalov, OFC in PFC.

Klinično se degeneracija sklepnega hrustanca, ki jo povzroča odlaganje kalcijevih kristalov, razlikuje od tiste, ki jo opazimo pri primarni osteoartrozi. Če bi bili kristali preprost epifenomen degeneracije hrustanca, bi jih našli v sklepih, ki jih primarna osteoartroza najpogosteje prizadene, tj. kolena, kolki in majhni sklepi rok. Nasprotno pa bolezni odlaganja kristalov najpogosteje prizadenejo sklepe, ki niso značilni za primarno osteoartrozo, kot so rama, zapestje in komolec. Prisotnost kristalov v sklepni (izlivni) tekočini je povezana s hujšo degeneracijo sklepnega hrustanca. Razpravlja se o tem, kaj je vzrok in kaj posledica, odlaganje kristalov ali degeneracija hrustanca. Vmesni položaj zaseda naslednja predpostavka: primarna anomalija v presnovi hrustanca vodi do njegove degeneracije, sekundarno odlaganje kristalov pa pospešuje njegovo razgradnjo (tako imenovana teorija amplifikacijske zanke).

Natančen mehanizem, s katerim kalcijevi kristali poškodujejo sklepni hrustanec, ni znan in je povzet spodaj. Teoretično lahko kalcijevi kristali neposredno poškodujejo hondrocite. Vendar histološki pregled redko razkrije kristale v bližini hondrocitov, še redkeje pa jih ti zaužijejo. Najverjetnejši mehanizem je fagocitoza kristalov s strani celic sinovialne obloge, ki ji sledi sproščanje proteolitičnih encimov ali izločanje citokinov, ki spodbujajo sproščanje encimov iz hondrocitov. Ta koncept podpira študija vloge sinovitisa, ki ga povzroča PFKD, pri razvoju hitro napredujoče osteoartritisa pri pirofosfatni artropatiji. V tej študiji so bili kristali kalcijevega pirofosfat dihidrata (1 ali 10 mg) tedensko injicirani v desno koleno kuncev z osteoartritisom, povzročenim z delno lateralno meniscektomijo. Izkazalo se je, da je po 8 injekcijah desni kolenski sklep pokazal bistveno resnejše spremembe v primerjavi z levim. Intenzivnost sinovialnega vnetja je bila v korelaciji z intraartikularnimi injekcijami kristalov kalcijevega pirofosfat dihidrata in njihovim odmerkom. Kljub temu, da odmerki kristalov CPPD, uporabljeni v tej študiji, presegajo tiste in vivo, rezultati kažejo na vlogo vnetja, ki ga povzroča CPPD, pri napredovanju osteoartritisa pri pirofosfatni artropatiji.

Potencialni mehanizmi indukcije poškodbe sklepnega hrustanca s kristali, ki vsebujejo kalcij, so povezani z njihovimi mitogenimi lastnostmi, sposobnostjo indukcije MMP in spodbujanja sinteze prostaglandinov.

Mitogeni učinek kristalov, ki vsebujejo kalcij. Pri artropatijah, povezanih s kristali, pogosto opazimo proliferacijo celic sinovialne obloge, pri čemer so kristali sami le delno odgovorni za ta proces. Povečanje števila sinovialnih celic spremlja povečano izločanje citokinov, ki spodbujajo hondrolizo in inducirajo izločanje proteolitičnih encimov. Kristali OFC v koncentracijah, ki jih najdemo v patologiji človeških sklepov, odvisno od odmerka spodbujajo mitogenezo mirujočih kultur kožnih fibroblastov ter sinovialnih fibroblastov psov in miši. Kristali kalcijevega pirofosfat dihidrata, urata, sulfata, karbonata in kalcijevega fosfata spodbujajo rast celic. Začetek in vrh vgradnje ( ^3H )-timidina, ki ga povzročajo ti kristali, se premakneta za 3 ure v primerjavi s stimulacijo celic s krvnim serumom. To obdobje je lahko potrebno za fagocitozo in raztapljanje kristalov. Dodatek kontrolnih kristalov enake velikosti (npr. diamantni prah ali delci lateksa) ni spodbudil mitogeneze. Kristali natrijevega urata monohidrata so imeli šibke mitogene lastnosti in so bili bistveno slabši od lastnosti kalcijevega urata, kar kaže na pomen vsebnosti kalcija v kristalih pri mitogenezi. Sintetični kristali OFC so imeli enake mitogene lastnosti kot kristali, pridobljeni od bolnikov s hondrokalcinozo. Mitogeni učinek kristalov, ki vsebujejo kalcij, ni bil posledica povečanja vsebnosti kalcija v okoliškem hranilnem mediju in vitro, saj raztapljanje bazičnih kristalov kalcijevega fosfata v hranilnem mediju ni spodbudilo vgradnje ( ^3H )-timidina v fibroblaste.

En predlagani mehanizem za mitogenezo, ki jo povzroča OFC, je, da je nenormalna proliferacija sinovialnih celic lahko vsaj delno posledica endocitoze in znotrajcelične razgradnje kristalov, kar poveča citoplazemske koncentracije Ca2 ⁺ in aktivira od kalcija odvisno pot, ki vodi do mitogeneze. Ta koncept podpira zahteva po neposrednem stiku med celicami in kristali za spodbujanje mitogeneze, saj je izpostavljenost celičnih kultur kristalom povzročila rast celic, medtem ko izpostavljenost celic, ki so bile prikrajšane za tak stik, ni. Za preučevanje zahteve po fagocitozi kristalov po interakciji celic in kristalov so bile celice gojene z ⁴⁵ Ca-OPC in ( ^3H )-timidinom. Ugotovljeno je bilo, da so celice, ki vsebujejo ⁴⁵ Ca-OPC, vključile bistveno več ( ^3H )-timidina kot celice brez označevanja z bazičnim kalcijevim fosfatom. V makrofagnih kulturah je inhibicija kristalne endocitoze s citokalazinom povzročila inhibicijo razgradnje kristalov, kar še dodatno poudarja nujnost fagocitoze.

Kristali, ki vsebujejo kalcij, so topni v kislini. Po fagocitozi se kristali raztopijo v kislem okolju makrofagnih fagolizosomov. Klorokin, amonijev klorid, bafilomicin A1 in vsa lizosomotropna sredstva, ki zvišajo pH lizosomov, odvisno od odmerka zavirajo znotrajcelično raztapljanje kristalov in privzem (3H)-timidina ^v fibroblastih, gojenih z bazičnimi kristali kalcijevega fosfata.

Dodatek kristalov OFC v enoslojno kulturo fibroblastov je povzročil takojšnje desetkratno povečanje znotrajceličnega kalcija, ki se je po 8 minutah vrnil na izhodiščno vrednost. Vir kalcija je bil pretežno zunajcelični ion, saj so bili bazični kristali kalcijevega fosfata dodani v gojišče brez kalcija. Naslednje povečanje znotrajcelične koncentracije kalcija je bilo opaženo po 60 minutah in je trajalo vsaj 3 ure. Tukaj je bil vir kalcija fagocitirani kristali, raztopljeni v fagolizomih.

Ugotovljeno je bilo, da je mitogeni učinek kristalov OFC podoben učinku PDGF kot rastnega faktorja; tako kot slednji tudi kristali OFC kažejo sinergizem z IGF-1 in krvno plazmo. Blokada IGF-1 zmanjša celično mitogenezo kot odziv na OFC. PG Mitchell in sodelavci (1989) so pokazali, da indukcija mitogeneze v fibroblastih Balb/c- ₃ T3 _s kristali OFC zahteva prisotnost serin/treonin protein kinaze C (PKC), enega glavnih mediatorjev signalov, ki nastanejo med zunanjo stimulacijo celic s hormoni, nevrotransmiterji in rastnimi faktorji. Zmanjšanje aktivnosti PKC v celicah Balb/c-3 T3 _{zavira indukcijo protoonkogenov c-fos in c-myc, ki jo posredujeOFC}, vendar ne vpliva na stimulacijo teh onkogenov, ki jo posreduje PDGF.

Povečanje znotrajceličnega kalcija po raztapljanju fagocitiziranih kristalov ni edina signalna pot za mitogenezo. Ko se rastni faktorji, kot je PDGF, vežejo na svoj membranski receptor, se stimulira fosfolipaza C (fosfodiesteraza), ki hidrolizira fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat in tvori znotrajcelične prenašalce inozitol-3-fosfat in diacilglicerol. Prvi sprošča kalcij iz endoplazemskega retikuluma z moduliranjem aktivnosti od kalcija odvisnih in od kalcija/kalmodulina odvisnih encimov, kot so protein kinaze in proteaze.

R. Rothenberg in H. Cheung (1988) sta poročala o povečani razgradnji fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfata s fosfolipazo C v sinovialnih celicah kuncev kot odziv na stimulacijo s kristali OFC. Slednji so znatno povečali vsebnost inozitol-1-fosfata v celicah z označenim ( ^3H )-inozitolom; vrh je bil dosežen v 1 minuti in je trajal približno 1 uro.

Diacilglicerol je potencialni aktivator kalcijevega pirofosfat dihidrata. Ker kristali OFC povečajo aktivnost fosfolipaze C, kar vodi do kopičenja diacilglicerola, lahko posledično pričakujemo povečanje aktivacije PKC. PG Mitchell in sod. (1989) so primerjali učinke kristalov OFC in PDGF na sintezo DNK s _{fibroblasti Balb/c-3T3}. V celični kulturi je bil PKC inaktiviran z inkubacijo celic s forbol diestrom (TPD), ki podpira tumor, analogom diacilglicerola. Dolgotrajna stimulacija z nizkimi odmerki TPD je zmanjšala aktivnost PKC, medtem ko jo je enkratna stimulacija z visokim odmerkom aktivirala. Stimulacija sinteze DNK s kristali OFC je bila po inaktivaciji PKC zavrta, kar kaže na pomen tega encima pri mitogenezi, ki jo povzroča OFC. Pred tem so GM McCarthy in sod. (1987) pokazali povezavo med mitogenim odzivom človeških fibroblastov na kristale OFC in aktivacijo PKC. Vendar pa kristali OFC ne aktivirajo fosfatidilinozitol 3-kinaze ali tirozin kinaz, kar potrjuje, da je mehanizem aktivacije celic s kristali OFC selektiven.

Proliferacijo celic nadzira skupina genov, imenovanih protoonkogeni. Proteina foe in mye, produkta protoonkogenov c-fos in c-myc, sta lokalizirana v celičnem jedru in vezana na specifična zaporedja DNK. Stimulacija fibroblastov 3T3 s kristali OFC povzroči izražanje c-fos v nekaj minutah, ki doseže maksimum 30 minut po stimulaciji. Indukcija transkripcije c-myc s kristali OFC ali PDGF se pojavi v 1 uri in doseže maksimum 3 ure po stimulaciji. Celice vzdržujejo povišano raven transkripcije c-fos in c-myc vsaj 5 ur. V celicah z inaktivirano PCD je stimulacija c-fos in c-myc s kristali OFC ali TFD znatno zavirana, medtem ko se indukcija teh genov s strani PDGF ne spremeni.

Člani družine mitogenom aktiviranih proteinskih kinaz (MAP K) so ključni regulatorji različnih znotrajceličnih signalnih kaskad. En podrazred te družine, p42/p44, uravnava proliferacijo celic z mehanizmom, ki vključuje aktivacijo protoonkogenov c-fos in c-jun. Kristali OFC in PFKD aktivirajo signalno pot proteinske kinaze, ki vključuje tako p42 kot p44, kar kaže na vlogo te poti pri mitogenezi, ki jo povzročajo kristali, ki vsebujejo kalcij.

Končno, mitogeneza, ki jo inducira OFC, vključuje transkripcijski faktor jedrskega faktorja κB (NF-κB), ki je bil prvič opisan kot gen za lahko verigo imunoglobulina κ (IgK). Je inducibilni transkripcijski faktor, pomemben v številnih signalnih poteh, ker uravnava izražanje različnih genov. Indukcija NF-κB je običajno povezana s sproščanjem inhibitornih beljakovin, imenovanih IκB, iz citoplazme. Indukciji NF-κB sledi premestitev aktivnega transkripcijskega faktorja v jedro. Kristali OFC inducirajo NF-κB v fibroblastih Balb/c- _3T3 in fibroblastih človeške kože.

V signalno transdukcijo po aktivaciji NF-κB je lahko vključenih več poti, vendar vse vključujejo proteinske kinaze, ki fosforilirajo (in s tem razgradijo) IκB. Na podlagi študij in vitro se je prej domnevalo, da IκB služi kot substrat za kinaze (npr. PKC in proteinsko kinazo A). Vendar pa je bil pred kratkim identificiran kompleks kinaze IκB z veliko molekulsko maso. Te kinaze specifično fosforilirajo serinske ostanke IκB. Aktivacija NF-κB s TNF-α in IL-1 zahteva učinkovito delovanje kinaze, ki inducira NF-κB (NIK), in kinaze IκB. Molekularni mehanizem aktivacije NIK trenutno ni znan. Čeprav kristali OFC aktivirajo tako PKC kot NF-κB, ni znano, v kolikšni meri sta ta dva procesa lahko povezana. Ker se modifikacija kinaze GκB pojavi preko fosforilacije, vloge PKC pri indukciji NF-κB s kristali OFC preko fosforilacije in aktivacije kinaze GκB ni mogoče izključiti. Ta koncept podpira zaviranje mitogeneze, ki jo povzročajo kristali OFC, in izražanja NF-κB z zaviralcem PKC, stavrosporinom. Podobno lahko stavrosporin zavira kinazo GκB in s tem zavira protein kinazo A in druge protein kinaze.

Mehanizem mitogeneze, ki jo v fibroblastih inducirajo kristali OFC, torej vključuje vsaj dva različna procesa:

• hiter membransko vezan dogodek, ki povzroči aktivacijo PKC in MAP K, indukcijo NF-κB in protoonkogenov,
• počasnejše znotrajcelično raztapljanje kristalov, kar vodi do povečanja znotrajcelične vsebnosti Ca2 ⁺ in nato do aktivacije številnih od kalcija odvisnih procesov, ki spodbujajo mitogenezo.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukcija s kristali, ki vsebujejo MMP-kalcij

Mediatorji poškodb tkiva s kristali, ki vsebujejo kalcij, so MMP - kolagenaza-1, stromelizin, 92 kD želatinaza in kolagenaza-3.

Glede na povezavo med vsebnostjo kristalov OFC in uničenjem sklepnega tkiva je bila postavljena hipoteza, da sinovialne celice fagocitirajo kristale OFC in morda tudi nekatere kolagene. Stimulirani sinovociti proliferirajo in izločajo proteaze. To hipotezo so in vitro preizkusili z dodajanjem naravnih ali sintetičnih kristalov OFC, PFCD in drugih kristalov gojenim človeškim ali pasjim sinovocitom. Aktivnost nevtralnih proteaz in kolagenaz se je povečala odvisno od odmerka in je bila približno 5–8-krat večja kot v kontrolni celični kulturi, gojeni brez kristalov.

V celicah, gojenih v mediju, ki je vseboval kristale, so zaznali sočasno indukcijo mRNA kolagenaze-1, stromelizina in želatinaze-92 kDa, čemur je sledilo izločanje encimov v medij.

Kristali OFC so prav tako povzročili kopičenje mRNA kolagenaze-1 in kolagenaze-2 v zrelih prašičjih hondrocitih, čemur je sledilo izločanje encimov v medij.

GM McCarty in sodelavci (1998) so preučevali vlogo znotrajceličnega raztapljanja kristalov pri nastajanju MMP, ki ga povzročajo kristali. Zvišanje lizosomskega pH z bafilomicinom A je zavrlo znotrajcelično raztapljanje kristalov in tudi oslabilo proliferativni odziv človeških fibroblastov na kristale OFC, vendar ni zavrlo sinteze in izločanja MMP.

Niti bazični kalcijev fosfat niti kristali PFCD niso in vitro sprožili nastajanja IL-1, so pa to storili kristali natrijevega urata.

Trenutni podatki jasno kažejo na neposredno stimulacijo proizvodnje MMP s strani fibroblastov in hondrocitov ob stiku s kristali, ki vsebujejo kalcij.

Simptomi osteoartritisa kažejo na pomembno vlogo MMP pri napredovanju bolezni. Prisotnost kristalov, ki vsebujejo kalcij, poveča degeneracijo tkiv prizadetih sklepov.

Stimulacija sinteze prostaglandinov

Poleg spodbujanja rasti celic in izločanja encimov kristali, ki vsebujejo kalcij, povzročajo sproščanje prostaglandinov iz celičnih kultur sesalcev, zlasti PGE2 _. Sproščanje PGE2 se _{v vseh primerih pojavi v prvi uri po izpostavitvi celic kristalom. R. Rothenberg (1987) je ugotovil, dasta} glavna vira arahidonske kisline za sintezo PGE2 fosfatidilholin in fosfatidiletanolamin, ter potrdil, da sta fosfolipaza A2 _{in NOX prevladujoči poti zaproizvodnjo} PGE2.

PGE1 se lahko sprosti tudi kot odziv na kristale OFA. GM McCarty in sodelavci (1993, 1994) so preučevali učinke PGE2 _, PGE in njegovega analoga misoprostola na mitogeni odziv človeških fibroblastov na kristale OFA. Vsa tri sredstva so zavirala mitogeni odziv na od odmerka odvisen način, pri čemer sta PGE in misoprostol pokazala izrazitejšo zaviralno aktivnost. PGE2 in misoprostol, ne pa PGE2 _, sta zavirala kopičenje kolagenazne mRNA kot odziv na kristale OFA.

MG McCarty in H. Cheung (1994) sta raziskovala mehanizem aktivacije celic s PGE, ki jo povzroča OFC. Avtorja sta pokazala, da PGE, močnejši induktor znotrajceličnega cAMP kot PGE2 _in PGE, zavira z OFC inducirano mitogenezo in proizvodnjo MMP prek od cAMP odvisne signalne transdukcijske poti. Možno je, da povečanje proizvodnje PGE, ki ga povzročajo kristali OFC, oslabi njihove druge biološke učinke (mitogenezo in proizvodnjo MMP) prek mehanizma povratne zanke.

Kristalno povzročeno vnetje

Kristali, ki vsebujejo kalcij, se pogosto nahajajo v sinovialni tekočini bolnikov z osteoartrozo, vendar so epizode akutnega vnetja z levkocitozo redke tako pri osteoartrozi kot pri artropatijah, povezanih s kristali (na primer Milwaukeejev sindrom rame). Flogistični potencial kristalov lahko spremenijo številni inhibitorni dejavniki. R. Terkeltaub in sod. (1988) so dokazali sposobnost krvnega seruma in plazme, da znatno zavirajo odziv nevtrofilnih granulocitov na bazične kristale kalcijevega fosfata. Dejavniki, ki povzročajo takšno zaviranje, so beljakovine, ki vežejo kristale. Študija ene od teh beljakovin, ₂ -HS glikoproteina (AHSr), je pokazala, da je AHSr najmočnejši in specifičen zaviralec odziva nevtrofilnih granulocitov na kristale OFC. AHSr je serumska beljakovina jetrnega izvora; znano je, da se v primerjavi z drugimi serumskimi beljakovinami nahaja v relativno visokih koncentracijah v kosteh in mineralizirajočem tkivu. Poleg tega je AHSr prisoten v "nevneti" sinovialni tekočini in je bil odkrit tudi na bazičnih kristalih kalcijevega fosfata v nativni sinovialni tekočini. Zato ni mogoče izključiti možnosti, da AHSr modulira flogogeni potencial bazičnih kristalov kalcijevega fosfata in vivo.

Če povzamemo vse zgoraj navedeno, predstavljamo dve shemi patogeneze osteoartritisa, ki sta jih predlagala WB van den Berg et al. (1999) in M. Carrabba et al. (1996), ki združujejo mehanske, genetske in biokemične dejavnike.