Krvotvorne matične celice rumenjakove vrečke

Očitno so različni proliferativni in diferenciacijski potenciali hematopoetskih matičnih celic določeni s posebnostmi njihovega ontogenetskega razvoja, saj se celo lokalizacija glavnih področij hematopoeze pri ljudeh med ontogenezo spreminja. Hematopoetske matične celice plodnega rumenjakove vrečke so zavezane k tvorbi izključno eritropoetske celične linije. Po migraciji primarnih HSC v jetra in vranico se spekter zavezanostnih linij v mikrookolju teh organov razširi. Zlasti hematopoetske matične celice pridobijo sposobnost tvorbe celic limfoidne linije. V prenatalnem obdobju hematopoetske matične celice dosežejo območje končne lokalizacije in naselijo kostni mozeg. Med intrauterinim razvojem fetalna kri vsebuje znatno število hematopoetskih matičnih celic. Na primer, v 13. tednu nosečnosti raven HSC doseže 18 % celotnega števila mononuklearnih krvnih celic. Kasneje opazimo postopno zmanjševanje njihove vsebnosti, vendar se že pred rojstvom količina HSC v popkovnični krvi malo razlikuje od njihove količine v kostnem mozgu.

Po klasičnih konceptih se naravna sprememba lokalizacije hematopoeze med embrionalnim razvojem sesalcev izvaja z migracijo in vnosom pluripotentnih hematopoetskih matičnih celic v novo mikrookolje - iz rumenjakove vrečke v jetra, vranico in kostni mozeg. Ker v zgodnjih fazah embrionalnega razvoja hematopoetsko tkivo vsebuje veliko število matičnih celic, ki se z dozorevanjem ploda zmanjšuje, se za najbolj obetavno za pridobivanje hematopoetskih matičnih celic šteje hematopoetsko tkivo embrionalnih jeter, izolirano iz splavljenega materiala v 5-8 tednih nosečnosti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Vprašanja o izvoru hematopoetskih matičnih celic

Ni dvoma, da embrionalna tvorba eritrocitov izvira iz krvnih otokov rumenjakove vrečke. Vendar pa je potencial diferenciacije hematopoetskih celic rumenjakove vrečke in vitro zelo omejen (diferencirajo se predvsem v eritrocite). Treba je opozoriti, da presaditev hematopoetskih matičnih celic rumenjakove vrečke dolgo časa ne more obnoviti hematopoeze. Izkazalo se je, da te celice niso predhodnice odraslih HSC. Prave HSC se pojavijo prej, v 3. do 5. tednu intrauterinega razvoja, v območju tvorbe želodčnega tkiva in endotelija krvnih žil (paraaortna splanhnoplevra, P-SP), pa tudi na mestu aorte, gonad in primarnih ledvic - v mezonefrosu ali tako imenovani regiji AGM. Dokazano je, da so celice regije AGM vir ne le HSC, temveč tudi endotelijskih celic krvnih žil, pa tudi osteoklastov, ki sodelujejo v procesih tvorbe kostnega tkiva. V 6. tednu nosečnosti se zgodnje hematopoetske progenitorske celice iz regije AGM preselijo v jetra, ki ostajajo glavni hematopoetski organ ploda do rojstva.

Ker je ta točka izjemno pomembna z vidika presaditve celic, si problem izvora HSC v procesu človeške embriogeneze zasluži podrobnejšo predstavitev. Klasične ideje, da hematopoetske matične celice sesalcev in ptic izvirajo iz zunajembrionalnega vira, temeljijo na študijah Metcalfa in Moora, ki sta prva uporabila metode kloniranja HSC in njihovih potomcev, izoliranih iz rumenjakove vrečke. Rezultati njunega dela so služili kot osnova za teorijo migracije, po kateri HSC, ki se najprej pojavijo v rumenjakovi vrečki, zaporedno naseljujejo prehodne in dokončne hematopoetske organe, ko se v njih oblikuje ustrezno mikrookolje. Tako je bilo uveljavljeno stališče, da nastajanje HSC, sprva lokaliziranih v rumenjakovi vrečki, služi kot celična osnova za dokončno hematopoezo.

Hematopoetske progenitorske celice rumenjakove vrečke spadajo v kategorijo najzgodnejših hematopoetskih progenitorskih celic. Njihov fenotip je opisan s formulo AA4.1+CD34+c-kit+. Za razliko od zrelih HSC kostnega mozga ne izražajo antigenov Sca-1 in molekul MHC. Zdi se, da pojav markernih antigenov na površinskih membranah HSC rumenjakove vrečke med gojenjem ustreza njihovi diferenciaciji med embrionalnim razvojem z nastankom zavezanih hematopoetskih linij: raven izražanja antigenov CD34 in Thy-1 se zmanjša, izražanje CD38 in CD45RA se poveča, pojavijo pa se molekule HLA-DR. Z nadaljnjo specializacijo in vitro, ki jo inducirajo citokini in rastni faktorji, se začne izražanje antigenov, specifičnih za hematopoetske progenitorske celice določene celične linije. Vendar pa so rezultati študije embrionalne hematopoeze pri predstavnikih treh razredov vretenčarjev (dvoživke, ptice in sesalci) in zlasti analiza izvora HSC, odgovornih za dokončno hematopoezo v postnatalni ontogenezi, v nasprotju s klasičnimi koncepti. Ugotovljeno je bilo, da se pri predstavnikih vseh obravnavanih razredov med embriogenezo oblikujeta dve neodvisni regiji, v katerih nastanejo HSC. Ekstraembrionalno "klasično" regijo predstavlja rumenjakova vrečka ali njeni analogi, medtem ko nedavno identificirana intraembrionalna cona lokalizacije HSC vključuje paraaortni mezenhim in regijo AGM. Danes lahko trdimo, da pri dvoživkah in pticah dokončne HSC izvirajo iz intraembrionalnih virov, medtem ko pri sesalcih in ljudeh sodelovanja HSC rumenjakove vrečke pri dokončni hematopoezi še ni mogoče popolnoma izključiti.

Embrionalna hematopoeza v rumenjakovi vrečki je pravzaprav primarna eritropoeza, za katero je značilno ohranjanje jedra v vseh fazah zorenja eritrocitov in sinteza hemoglobina fetalnega tipa. Po najnovejših podatkih se val primarne eritropoeze konča v rumenjakovi vrečki 8. dan embrionalnega razvoja. Sledi obdobje kopičenja dokončnih eritroidnih progenitorskih celic - BFU-E, ki nastajajo izključno v rumenjakovi vrečki in se prvič pojavijo 9. dan brejosti. V naslednji fazi embriogeneze so že oblikovane dokončne eritroidne progenitorske celice - CFU-E, pa tudi (!) mastociti in CFU-GM. To je osnova za stališče, da dokončne progenitorske celice nastanejo v rumenjakovi vrečki, migrirajo s krvnim obtokom, se naselijo v jetrih in hitro sprožijo prvo fazo intraembrionalne hematopoeze. V skladu s temi koncepti lahko rumenjakovo vrečko po eni strani obravnavamo kot mesto primarne eritropoeze, po drugi strani pa kot prvi vir dokončnih hematopoetskih progenitorskih celic v embrionalnem razvoju.

Dokazano je, da je mogoče celice, ki tvorijo kolonije, z visokim proliferativnim potencialom, izolirati iz rumenjakove vrečke že 8. dan brejosti, torej veliko pred zaprtjem žilnega sistema zarodka in rumenjakove vrečke. Poleg tega celice z visokim proliferativnim potencialom, pridobljene iz rumenjakove vrečke in vitro, tvorijo kolonije, katerih velikost in celična sestava se ne razlikujeta od ustreznih parametrov kulturne rasti matičnih celic kostnega mozga. Hkrati se pri ponovni presaditvi celic rumenjakove vrečke z visokim proliferativnim potencialom, ki tvorijo kolonije, tvori bistveno več hčerinskih celic, ki tvorijo kolonije, in multipotentnih progenitorskih celic kot pri uporabi progenitorskih celic kostnega mozga hematopoeze.

Končni sklep o vlogi hematopoetskih matičnih celic rumenjakove vrečke pri dokončni hematopoezi bi lahko podali rezultati dela, v katerem so avtorji pridobili linijo endotelijskih celic rumenjakove vrečke (G166), ki je učinkovito podpirala proliferacijo svojih celic s fenotipskimi in funkcionalnimi značilnostmi HSC (AA4.1+WGA+, nizka gostota in šibke adhezivne lastnosti). Vsebnost slednjih se je pri 8-dnevnem gojenju na hranilni plasti celic C166 povečala za več kot 100-krat. V mešanih kolonijah, vzgojenih na podplasti celic C166, so bili identificirani makrofagi, granulociti, megakariociti, blastne celice in monociti ter predhodniške celice B- in T-limfocitov. Celice rumenjakove vrečke, ki rastejo na podplasti endotelijskih celic, so imele sposobnost samorazmnoževanja in so v avtorjevih poskusih prestale do tri pasaže. Obnovitev hematopoeze z njihovo pomočjo pri odraslih miših s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (SCID) je spremljala tvorba vseh vrst levkocitov, pa tudi limfocitov T in B. Vendar pa so avtorji v svojih študijah uporabili celice rumenjakove vrečke 10 dni starega zarodka, pri katerem sta zunaj- in znotrajembrionalni žilni sistem že zaprta, kar nam ne omogoča izključitve prisotnosti znotrajembrionalnih HSC med celicami rumenjakove vrečke.

Hkrati je analiza diferenciacijskega potenciala hematopoetskih celic zgodnjih faz razvoja, izoliranih pred združitvijo žilnih sistemov rumenjakove vrečke in zarodka (8–8,5 dni brejosti), pokazala prisotnost predhodnikov T- in B-celic v rumenjakovi vrečki, ne pa tudi v telesu zarodka. V sistemu in vitro so se z metodo dvostopenjske gojenja na monosloju epitelijskih in subepitelnih celic timusa mononuklearne celice rumenjakove vrečke diferencirale v pred-T- in zrele T-limfocite. V enakih pogojih gojenja, vendar na monosloju stromalnih celic jeter in kostnega mozga, so se mononuklearne celice rumenjakove vrečke diferencirale v pred-B-celice in zrele IglVT-B-limfocite.

Rezultati teh študij kažejo na možnost razvoja celic imunskega sistema iz zunajembrionalnega tkiva rumenjakove vrečke, nastanek primarnih T- in B-celičnih linij pa je odvisen od dejavnikov stromalnega mikrookolja embrionalnih hematopoetskih organov.

Drugi avtorji so prav tako pokazali, da rumenjak vsebuje celice s potencialom za limfoidno diferenciacijo, nastali limfociti pa se po antigenih značilnostih ne razlikujejo od tistih pri spolno zrelih živalih. Ugotovljeno je bilo, da so celice rumenjakove vrečke 8-9 dni starega zarodka sposobne obnoviti limfopoezo v atimocitnem timusu z nastankom zrelih CD3+CD4+- in CD3+CD8+-limfocitov, ki imajo oblikovan repertoar receptorjev T-celic. Tako lahko timus naseljujejo celice ekstraembrionalnega izvora, vendar ni mogoče izključiti verjetne migracije zgodnjih celic predhodnikov T-limfocitov iz intraembrionalnih virov limfopoeze v timus.

Hkrati presaditev hematopoetskih celic rumenjakove vrečke odraslim obsevanim prejemnikom ne povzroči vedno dolgoročne repopulacije osiromašenih con lokalizacije hematopoetskega tkiva, celice rumenjakove vrečke pa in vitro tvorijo bistveno manj vraničnih kolonij kot celice regije AGM. V nekaterih primerih je z uporabo celic rumenjakove vrečke 9 dni starega zarodka še vedno mogoče doseči dolgoročno (do 6 mesecev) repopulacijo hematopoetskega tkiva pri obsevanih prejemnikih. Avtorji menijo, da se celice rumenjakove vrečke s fenotipom CD34+c-kit+ ne le ne razlikujejo od tistih iz regije AGM po svoji sposobnosti repopulacije osiromašenih hematopoetskih organov, temveč tudi učinkoviteje obnavljajo hematopoezo, saj jih rumenjakova vrečka vsebuje skoraj 37-krat več.

Treba je opozoriti, da so v poskusih uporabili hematopoetske celice rumenjakove vrečke z markernimi antigeni hematopoetskih matičnih celic (c-kit+ in/ali CD34+ in CD38+), ki so jih injicirali neposredno v jetra ali trebušno veno potomcev mišjih samic, ki so 18. dan nosečnosti prejele injekcijo busulfana. Pri takšnih novorojenih živalih je bila lastna mielopoeza močno zavirana zaradi izločanja hematopoetskih matičnih celic, ki ga je povzročil busulfan. Po presaditvi hematopoetskih matičnih celic rumenjakove vrečke so v periferni krvi prejemnikov 11 mesecev zaznali oblikovane elemente, ki so vsebovali donorski marker - glicerofosfat dehidrogenazo. Ugotovljeno je bilo, da HSC rumenjakove vrečke obnovijo vsebnost limfoidnih, mieloidnih in eritroidnih linijskih celic v krvi, timusu, vranici in kostnem mozgu, raven himerizma pa je bila višja v primeru intrahepatičnega kot intravenskega dajanja celic rumenjakove vrečke. Avtorji menijo, da HSC rumenjakove vrečke zarodkov v zgodnji fazi (do 10 dni) zahtevajo predhodno interakcijo s hematopoetskim mikrookoljem jeter, da se uspešno naselijo v hematopoetskih organih odraslih prejemnikov. Možno je, da obstaja edinstvena faza razvoja v embriogenezi, ko celice rumenjakove vrečke, ki se sprva preselijo v jetra, nato pridobijo sposobnost naselitve strome hematopoetskih organov zrelih prejemnikov.

V zvezi s tem je treba opozoriti, da se himerizem celic imunskega sistema pogosto opazi po presaditvi celic kostnega mozga obsevanim zrelim prejemnikom - v krvi slednjih se celice donorske fenotipa nahajajo v precej velikih količinah med B-, T-limfociti in granulociti prejemnika, kar traja vsaj 6 mesecev.

Hematopoetske celice pri sesalcih prvič odkrijemo z morfološkimi metodami 7. dan embrionalnega razvoja in so predstavljene s hematopoetskimi otoki znotraj žil rumenjakove vrečke. Vendar pa je naravna hematopoetska diferenciacija v rumenjakovi vrečki omejena na primarne eritrocite, ki zadržujejo jedra in sintetizirajo fetalni hemoglobin. Kljub temu je tradicionalno veljalo prepričanje, da rumenjakova vrečka služi kot edini vir HSC, ki se selijo v hematopoetske organe razvijajočega se zarodka in zagotavljajo dokončno hematopoezo pri odraslih živalih, saj pojav HSC v telesu zarodka sovpada z zaprtjem žilnih sistemov rumenjakove vrečke in zarodka. To stališče podpirajo podatki, da celice rumenjakove vrečke, ko so klonirane in vitro, povzročijo nastanek granulocitov in makrofagov, in vivo pa kolonij vranice. Nato so med poskusi presaditve ugotovili, da hematopoetske celice rumenjakove vrečke, ki se v sami rumenjakovi vrečki lahko diferencirajo le v primarne eritrocite, v mikrookolju jeter novorojenih in odraslih miši SCID, osiromašenega timusa oziroma stromalne hranilne žleze, pridobijo sposobnost ponovne naselitve hematopoetskih organov z obnovo vseh hematopoetskih linij tudi pri odraslih živalih prejemnicah. Načeloma nam to omogoča, da jih uvrstimo med prave HSC – kot celice, ki delujejo v postnatalnem obdobju. Domneva se, da rumenjakova vrečka skupaj z regijo AGM služi kot vir HSC za dokončno hematopoezo pri sesalcih, vendar njihov prispevek k razvoju hematopoetskega sistema še vedno ni jasen. Prav tako ni jasen biološki pomen obstoja dveh hematopoetskih organov s podobnimi funkcijami v zgodnji embriogenezi sesalcev.

Iskanje odgovorov na ta vprašanja se nadaljuje. In vivo je bilo mogoče dokazati prisotnost celic, ki obnavljajo limfopoezo, v rumenjakovi vrečki 8–8,5 dni starih zarodkov pri subletalno obsevanih miših SCID z izrazitim pomanjkanjem T- in B-limfocitov. Hematopoetske celice iz rumenjakove vrečke so bile injicirane tako intraperitonealno kot neposredno v tkivo vranice in jeter. Po 16 tednih so bili pri prejemnikih odkriti TCR/CD34 CD4+ in CD8+ T-limfociti ter B-220+IgM+ B-limfociti, označeni z donorskimi MHC antraksenskimi geni. Hkrati avtorji v telesu 8–8,5 dni starih zarodkov niso našli matičnih celic, ki bi bile sposobne takšne obnove imunskega sistema.

Hematopoetske celice rumenjakove vrečke imajo visok proliferativni potencial in so sposobne dolgotrajne samoreprodukcije in vitro. Nekateri avtorji te celice identificirajo kot HSC na podlagi podaljšane (skoraj 7 mesecev) generacije eritroidnih progenitorskih celic, ki se od progenitorjev kostnega mozga eritroidne linije razlikujejo po daljšem obdobju pasiranja, večjih velikostih kolonij, povečani občutljivosti na rastne faktorje in daljši proliferaciji. Poleg tega se v ustreznih pogojih gojenja celic rumenjakove vrečke in vitro tvorijo tudi limfoidne progenitorske celice.

Predstavljeni podatki nam na splošno omogočajo, da rumenjakovo vrečko obravnavamo kot vir HSC, ki je manj vezana in ima zato večji proliferativni potencial kot matične celice kostnega mozga. Vendar pa kljub dejstvu, da rumenjakova vrečka vsebuje pluripotentne hematopoetske progenitorske celice, ki in vitro dolgo časa ohranjajo različne linije hematopoetske diferenciacije, je edino merilo za popolnost HSC njihova sposobnost dolgoročne ponovne naselitve hematopoetskih organov prejemnika, katerih hematopoetske celice so uničene ali genetsko okvarjene. Ključno vprašanje je torej, ali lahko pluripotentne hematopoetske celice rumenjakove vrečke migrirajo in naseljujejo hematopoetske organe ter ali je smiselno revidirati znana dela, ki dokazujejo njihovo sposobnost ponovne naselitve hematopoetskih organov odraslih živali z nastankom glavnih hematopoetskih linij. Intraembrionalni viri dokončnih GSC so bili v ptičjih zarodkih identificirani že v sedemdesetih letih prejšnjega stoletja, kar je že takrat postavilo pod vprašaj ustaljene predstave o zunajembrionalnem izvoru GSC, tudi pri predstavnikih drugih razredov vretenčarjev. V zadnjih nekaj letih so se pojavile publikacije o prisotnosti podobnih intraembrionalnih območij, ki vsebujejo GSC, pri sesalcih in ljudeh.

Še enkrat je treba opozoriti, da je temeljno znanje na tem področju izjemno pomembno za praktično transplantologijo celic, saj bo pomagalo ne le določiti prednostni vir HSC, temveč tudi ugotoviti značilnosti interakcije primarnih hematopoetskih celic z gensko tujim organizmom. Znano je, da vnos hematopoetskih matičnih celic človeških fetalnih jeter v zarodek ovce v fazi organogeneze vodi do rojstva himernih živali, v krvi in kostnem mozgu katerih je stabilno določenih 3 do 5 % človeških hematopoetskih celic. Hkrati človeške HSC ne spremenijo svojega kariotipa, ohranjajo visoko stopnjo proliferacije in sposobnost diferenciacije. Poleg tega presajene ksenogene HSC ne nasprotujejo imunskemu sistemu in fagocitom gostiteljskega organizma ter se ne transformirajo v tumorske celice, kar je bila osnova za intenziven razvoj metod za intrauterino korekcijo dedne genetske patologije z uporabo HSC ali ESC, transficiranih s pomanjkljivimi geni.

Toda v kateri fazi embriogeneze je primerneje izvesti takšno korekcijo? Celice, določene za hematopoezo, se pri sesalcih prvič pojavijo takoj po implantaciji (6. dan brejosti), ko še vedno ni morfoloških znakov hematopoetske diferenciacije in domnevnih hematopoetskih organov. V tej fazi so razpršene celice mišjega zarodka sposobne ponovno naseliti hematopoetske organe obsevanih prejemnikov z nastankom eritrocitov in limfocitov, ki se od gostiteljskih celic razlikujejo po vrsti hemoglobina oziroma glicerofosfat izomeraze, pa tudi po dodatnem kromosomskem markerju (Tb) donorskih celic. Pri sesalcih, tako kot pri pticah, se sočasno z rumenjakovo vrečko, pred zaprtjem skupne žilne reže, hematopoetske celice pojavijo neposredno v telesu zarodka v paraaortni splanhnoplevri. Hematopoetske celice fenotipa AA4.1+ so bile izolirane iz regije AGM in označene kot multipotentne hematopoetske celice, ki tvorijo T- in B-limfocite, granulocite, megakariocite in makrofage. Fenotipsko so te multipotentne progenitorske celice zelo blizu HSC kostnega mozga odraslih živali (CD34+c-kit+). Število multipotentnih celic AA4.1+ med vsemi celicami regije AGM je majhno - predstavljajo največ 1/12 njenega dela.

V človeškem zarodku je bila identificirana tudi intraembrionalna regija, ki vsebuje HSC, homologne regiji AGM pri živalih. Poleg tega je pri ljudeh več kot 80 % multipotentnih celic z visokim proliferativnim potencialom v telesu zarodka, čeprav so takšne celice prisotne tudi v rumenjakovi vrečki. Podrobna analiza njihove lokalizacije je pokazala, da je na stotine takšnih celic zbranih v kompaktnih skupinah, ki se nahajajo v neposredni bližini endotelija ventralne stene dorzalne aorte. Fenotipsko gre za celice CD34CD45+Lin. Nasprotno pa so v rumenjakovi vrečki, pa tudi v drugih hematopoetskih organih zarodka (jetra, kostni mozeg), takšne celice posamezne.

Posledično v človeškem zarodku regija AGM vsebuje skupke hematopoetskih celic, tesno povezanih z ventralnim endotelijem dorzalne aorte. Ta stik je zasledljiv tudi na imunokemični ravni - tako celice hematopoetskih skupkov kot endotelijske celice izražajo vaskularni endotelijski rastni faktor, ligand Flt-3, njuna receptorja FLK-1 in STK-1, pa tudi transkripcijski faktor levkemičnih matičnih celic. V regiji AGM so mezenhimski derivati predstavljeni z gosto verigo zaobljenih celic, ki se nahajajo vzdolž celotne dorzalne aorte in izražajo tenascin C - glikoprotein osnovne snovi, ki aktivno sodeluje v procesih medcelične interakcije in migracije.

Multipotentne matične celice regije AGM po presaditvi hitro obnovijo hematopoezo pri odraslih obsevanih miših in zagotavljajo učinkovito hematopoezo dolgo časa (do 8 mesecev). Avtorji v rumenjakovi vrečki niso našli celic s takimi lastnostmi. Rezultate te študije potrjujejo podatki druge raziskave, ki je pokazala, da je pri zarodkih v zgodnjih fazah razvoja (10,5 dni) regija AGM edini vir celic, ki ustrezajo definiciji HSC, in obnavljajo mieloidno in limfoidno hematopoezo pri odraslih obsevanih prejemnikih.

Stromalna linija AGM-S3 je bila izolirana iz regije AGM, katere celice podpirajo nastanek predniških celic CFU-GM, BFU-E, CFU-E in enot mešanega tipa, ki tvorijo kolonije, v kulturi. Vsebnost slednjih se med gojenjem na hranilni podplasti celic linije AGM-S3 poveča od 10 do 80-krat. Tako mikrookolje regije AGM vsebuje bazne stromalne celice, ki učinkovito podpirajo hematopoezo, zato lahko sama regija AGM deluje kot embrionalni hematopoetski organ - vir dokončnih HSC, torej HSC, ki tvorijo hematopoetsko tkivo odrasle živali.

Razširjena imunofenotipizacija celične sestave regije AGM je pokazala, da vsebuje ne le multipotentne hematopoetske celice, temveč tudi celice, namenjene mieloidni in limfoidni diferenciaciji (T- in B-limfociti). Vendar pa je molekularna analiza posameznih celic CD34+c-kit+ iz regije AGM z uporabo verižne reakcije s polimerazo pokazala aktivacijo le genov beta-globina in mieloperoksidaze, ne pa tudi limfoidnih genov, ki kodirajo sintezo CD34, Thy-1 in 15. Delna aktivacija genov, specifičnih za linijo, je značilna za zgodnje ontogenetske faze nastajanja HSC in progenitorskih celic. Glede na to, da je število predniških celic v regiji AGM 10-dnevnega zarodka za 2-3 velikostne razrede manjše kot v jetrih, lahko trdimo, da se 10. dan embriogeneze hematopoeza v regiji AGM šele začenja, medtem ko so se v glavnem hematopoetskem organu ploda v tem obdobju hematopoetske linije že razvile.

Dejansko za razliko od prejšnjih (9-11 dni) hematopoetskih matičnih celic rumenjakove vrečke in regije AGM, ki ponovno naseljujejo hematopoetsko mikrookolje novorojenčka, ne pa odraslega organizma, hematopoetske progenitorske celice 12-17 dni starih embrionalnih jeter ne potrebujejo več zgodnjega postnatalnega mikrookolja in naseljujejo hematopoetske organe odrasle živali nič slabše kot novorojenček. Po presaditvi embrionalnih jetrnih HSC je imela hematopoeza pri obsevanih odraslih prejemniških miših poliklonski značaj. Poleg tega je bilo z uporabo označenih kolonij dokazano, da je delovanje presadjenih klonov popolnoma podvrženo klonskemu sukcesiji, odkritemu v odraslem kostnem mozgu. Posledično imajo embrionalne jetrne HSC, označene v najbolj nežnih pogojih, brez predhodne stimulacije z eksogenimi citokini, že glavne lastnosti odraslih HSC: ne potrebujejo zgodnjega postembrionalnega mikrookolja, po presaditvi vstopijo v stanje globokega mirovanja in se zaporedno mobilizirajo v klonsko tvorbo v skladu z modelom klonskega sukcesije.

Očitno se je treba podrobneje osredotočiti na pojav klonskega sukcesije. Eritropoezo izvajajo hematopoetske matične celice, ki imajo visok proliferativni potencial in sposobnost diferenciacije v vse linije zavezanih prekurzorskih celic krvnih celic. Pri normalni intenzivnosti hematopoeze je večina hematopoetskih matičnih celic v stanju mirovanja in so mobilizirane za proliferacijo in diferenciacijo, pri čemer zaporedno tvorijo klone, ki se medsebojno nadomeščajo. Ta proces se imenuje klonsko sukcesija. Eksperimentalni dokazi o klonskem sukcesiji v hematopoetskem sistemu so bili pridobljeni v študijah s HSC, za katere je značilen retrovirusni prenos genov. Pri odraslih živalih hematopoezo vzdržujejo številni hkrati delujoči hematopoetski kloni, derivati HSC. Na podlagi pojava klonskega sukcesije je bil razvit pristop repopulacije k identifikaciji HSC. V skladu s tem načelom se razlikuje med dolgoročnimi hematopoetskimi matičnimi celicami (LT-HSC), ki so sposobne obnavljati hematopoetski sistem skozi vse življenje, in kratkoročnimi HSC, ki to funkcijo opravljajo le omejeno časovno obdobje.

Če hematopoetske matične celice obravnavamo z vidika repopulacijskega pristopa, je posebnost hematopoetskih celic embrionalnih jeter njihova sposobnost ustvarjanja kolonij, ki so bistveno večje od kolonij pri rasti HSC iz popkovnične krvi ali kostnega mozga, in to velja za vse vrste kolonij. Že samo to dejstvo kaže na večji proliferativni potencial hematopoetskih celic embrionalnih jeter. Edinstvena lastnost hematopoetskih progenitorskih celic embrionalnih jeter je krajši celični cikel v primerjavi z drugimi viri, kar je zelo pomembno z vidika učinkovitosti repopulacije hematopoetskih organov med presaditvijo. Analiza celične sestave hematopoetske suspenzije, pridobljene iz virov zrelega organizma, kaže, da so jedrne celice v vseh fazah ontogeneze pretežno predstavljene s končno diferenciranimi celicami, katerih število in fenotip sta odvisna od ontogenetske starosti darovalca hematopoetskega tkiva. Predvsem suspenzije mononuklearnih celic kostnega mozga in popkovnične krvi sestavljajo več kot 50 % zrelih celic limfoidne serije, medtem ko hematopoetsko tkivo embrionalnih jeter vsebuje manj kot 10 % limfocitov. Poleg tega so celice mieloidne linije v embrionalnih in fetalnih jetrih predstavljene predvsem z eritroidno serijo, medtem ko v popkovnični krvi in kostnem mozgu prevladujejo granulocitno-makrofagni elementi.

Pomembno je tudi, da embrionalna jetra vsebujejo celoten nabor najzgodnejših hematopoetskih predhodnikov. Med slednjimi je treba omeniti eritroidne, granulopoetske, megakariopoetske in večlinijske celice, ki tvorijo kolonije. Njihovi bolj primitivni predhodniki - LTC-IC - so sposobni proliferacije in diferenciacije in vitro 5 tednov ali več ter ohranijo funkcionalno aktivnost tudi po vsaditvi v telo prejemnika med alogensko in celo ksenogeno presaditvijo imunsko pomanjkljivim živalim.

Biološka smotrnost prevlade eritroidnih celic v embrionalnih jetrih (do 90 % celotnega števila hematopoetskih elementov) je posledica potrebe po zagotavljanju hitro naraščajočega volumna krvi razvijajočega se ploda z eritrocitno maso. V embrionalnih jetrih eritropoezo predstavljajo jedrni eritroidni prekurzorji različnih stopenj zrelosti, ki vsebujejo fetalni hemoglobin (a2u7), ki zaradi svoje večje afinitete za kisik zagotavlja učinkovito absorpcijo slednjega iz materine krvi. Intenzifikacija eritropoeze v embrionalnih jetrih je povezana z lokalnim povečanjem sinteze eritropoetina (EPO). Omeniti velja, da je že sama prisotnost eritropoetina zadostna za realizacijo hematopoetskega potenciala hematopoetskih celic v embrionalnih jetrih, medtem ko je za zavezo HSC kostnega mozga in popkovnične krvi k eritropoezi potrebna kombinacija citokinov in rastnih faktorjev, ki jih sestavljajo EPO, SCF, GM-CSF in IL-3. Hkrati se zgodnje hematopoetske progenitorske celice, izolirane iz embrionalnih jeter, ki nimajo receptorjev za EPO, ne odzivajo na eksogeni eritropoetin. Za indukcijo eritropoeze v suspenziji mononuklearnih celic embrionalnih jeter je potrebna prisotnost naprednejših celic, občutljivih na eritropoetin, s fenotipom CD34+CD38+, ki izražajo receptor za EPO.

V literaturi še vedno ni soglasja o razvoju hematopoeze v embrionalnem obdobju. Funkcionalni pomen obstoja zunaj- in znotrajembrionalnih virov hematopoetskih progenitorskih celic ni bil ugotovljen. Vendar pa ni dvoma, da so v človeški embriogenezi jetra osrednji organ hematopoeze in v 6. do 12. tednu nosečnosti služijo kot glavni vir hematopoetskih matičnih celic, ki naseljujejo vranico, timus in kostni mozeg. GDR zagotavljajo izvajanje ustreznih funkcij v pre- in postnatalnem obdobju razvoja.

Še enkrat je treba opozoriti, da so za embrionalna jetra v primerjavi z drugimi viri značilna najvišja vsebnost HSC. Približno 30 % celic CD344 embrionalnih jeter ima fenotip CD38. Hkrati število limfoidnih progenitorskih celic (CD45+) v zgodnjih fazah hematopoeze v jetrih ne presega 4 %. Ugotovljeno je bilo, da se z razvojem ploda, od 7. do 17. tedna nosečnosti, število B-limfocitov progresivno povečuje z mesečnim "korakom" 1,1 %, medtem ko se raven HSC trajno zmanjšuje.

Funkcionalna aktivnost hematopoetskih matičnih celic je odvisna tudi od obdobja embrionalnega razvoja njihovega vira. Študija koloniozne aktivnosti jetrnih celic človeških zarodkov v 6-8 in 9-12 tednih nosečnosti med gojenjem v poltekočem mediju v prisotnosti SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 in EPO je pokazala, da je skupno število kolonij 1,5-krat večje pri zasejanju HSC embrionalnih jeter v zgodnjih fazah razvoja. Hkrati je število mielopoetskih progenitorskih celic, kot je CFU-GEMM, v jetrih v 6-8 tednih embriogeneze več kot trikrat večje od njihovega števila v 9-12 tednih nosečnosti. Na splošno je bila koloniozna aktivnost hematopoetskih jetrnih celic zarodkov v prvem trimesečju nosečnosti bistveno višja kot pri fetalnih jetrnih celicah v drugem trimesečju nosečnosti.

Zgornji podatki kažejo, da se embrionalna jetra na začetku embriogeneze ne odlikujejo le s povečano vsebnostjo zgodnjih hematopoetskih progenitorskih celic, temveč so njihove hematopoetske celice značilne po širšem spektru diferenciacije v različne celične linije. Te značilnosti funkcionalne aktivnosti hematopoetskih matičnih celic embrionalnih jeter imajo lahko določen klinični pomen, saj njihove kvalitativne značilnosti omogočajo pričakovanje izrazitega terapevtskega učinka pri presaditvi že majhnega števila celic, pridobljenih v zgodnjih fazah brejosti.

Kljub temu ostaja problem količine hematopoetskih matičnih celic, potrebnih za učinkovito presaditev, odprt in relevanten. Poskušajo ga rešiti z uporabo visokega potenciala samoreprodukcije hematopoetskih celic embrionalnih jeter in vitro, ko jih stimulirajo citokini in rastni faktorji. S konstantno perfuzijo zgodnjih embrionalnih jetrnih HSC v bioreaktorju je mogoče po 2-3 dneh dobiti količino hematopoetskih matičnih celic, ki je 15-krat večja od njihove začetne ravni. Za primerjavo je treba opozoriti, da sta za doseganje 20-kratnega povečanja proizvodnje človeških HSC iz popkovnične krvi pod enakimi pogoji potrebna vsaj dva tedna.

Embrionalna jetra se tako od drugih virov hematopoetskih matičnih celic razlikujejo po višji vsebnosti tako zavezanih kot zgodnjih hematopoetskih progenitorskih celic. V kulturi z rastnimi faktorji embrionalne jetrne celice s fenotipom CD34+CD45Ra1 CD71l0W tvorijo 30-krat več kolonij kot podobne celice popkovnične krvi in 90-krat več kot HSC kostnega mozga. Najbolj izrazite razlike v navedenih virih so v vsebnosti zgodnjih hematopoetskih progenitorskih celic, ki tvorijo mešane kolonije - količina CFU-GEMM v embrionalnih jetrih presega količino v popkovnični krvi in kostnem mozgu za 60 oziroma 250-krat.

Pomembno je tudi, da je do 18. tedna embrionalnega razvoja (obdobje začetka hematopoeze v kostnem mozgu) pri izvajanju hematopoetske funkcije vključenih več kot 60 % jetrnih celic. Ker človeški plod nima timusa in s tem timocitov do 13. tedna razvoja, presaditev hematopoetskih celic iz embrionalnih jeter v 6.–12. tednu nosečnosti znatno zmanjša tveganje za razvoj reakcije »presadek proti gostitelju« in ne zahteva izbire histokompatibilnega darovalca, saj omogoča relativno enostavno doseganje hematopoetske himerizma.