Corynebacterium

Davica je akutna nalezljiva bolezen, ki prizadene predvsem otroke in se kaže kot globoka zastrupitev telesa z davičnim toksinom in značilno fibrinozno vnetje na mestu lokalizacije povzročitelja. Ime bolezni izvira iz grške besede diftera - koža, film, saj se na mestu razmnoževanja povzročitelja tvori gost, sivkasto bel film.

Povzročitelja davice - Corynebacterium diphtheriae - je leta 1883 prvič odkril E. Klebs v rezinah filma, v čisti kulturi pa ga je leta 1884 pridobil F. Leffler. Leta 1888 sta E. Roux in A. Yersin odkrila njegovo sposobnost tvorbe eksotoksina, ki igra pomembno vlogo v etiologiji in patogenezi davice. Proizvodnja antitoksičnega seruma, ki ga je leta 1892 izdelal E. Behring, in njegova uporaba od leta 1894 za zdravljenje davice je omogočila znatno zmanjšanje umrljivosti. Uspešen boj proti tej bolezni se je začel po letu 1923 v povezavi z razvojem metode za pridobivanje davičnega anatoksina, ki jo je razvil G. Raion.

Povzročitelj davice spada v rod Corynebacterium (razred Actinobacteria). Morfološko je značilno, da so celice paličaste oblike in na koncih odebeljene (grško coryne - paličica), tvorijo veje, zlasti v starih kulturah, in vsebujejo zrnate vključke.

Rod Corynebacterium vključuje veliko število vrst, ki so razdeljene v tri skupine.

• Korinebakterije so paraziti ljudi in živali ter so zanje patogene.
• Korinebakterije, patogene za rastline.
• Nepatogene korinebakterije. Številne vrste korinebakterij so normalni prebivalci kože, sluznic žrela, nazofarinksa, oči, dihal, sečnice in genitalij.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfologija korinebakterij

C. diphtheriae so ravne ali rahlo ukrivljene negibne paličice, dolge 1,0–8,0 μm in premera 0,3–0,8 μm; ne tvorijo spor ali kapsul. Pogosto imajo na enem ali obeh koncih otekline in pogosto vsebujejo metakromatske granule – volutinska zrna (polimetafosfate), ki pri barvanju z metilenskim modrim dobijo modrikasto-vijolično barvo. Za njihovo odkrivanje je bila predlagana posebna Neisserjeva metoda barvanja. V tem primeru so paličice obarvane slamnato rumeno, volutinska zrna pa so temno rjava in se običajno nahajajo na polih. Corynebacterium diphtheriae se dobro obarva z anilinskimi barvili, je grampozitivna, vendar se v starih kulturah pogosto razbarva in ima negativno barvanje po Gramu. Zanjo je značilen izrazit polimorfizem, zlasti v starih kulturah in pod vplivom antibiotikov. Vsebnost G + C v DNK je približno 60 mol %.

Biokemijske lastnosti korinebakterij

Davični bacil je aerob ali fakultativni anaerob, temperaturni optimum za rast je 35–37 °C (meje rasti so 15–40 °C), optimalni pH je 7,6–7,8. Ni zelo zahteven do hranilnih medijev, vendar bolje raste na medijih, ki vsebujejo serum ali kri. Za davične bakterije so selektivna serumska gojišča Roux ali Loeffler, rast na njih se pojavi po 8–12 urah v obliki konveksnih kolonij velikosti bucikine glavice, sivkasto bele ali rumenkasto kremne barve. Njihova površina je gladka ali rahlo zrnata, na obodu so kolonije nekoliko bolj prozorne kot v središču. Kolonije se ne združijo, zaradi česar kultura dobi videz šagrenskega usnja. Na brozgi se rast kaže kot enakomerna motnost ali pa brozga ostane prozorna, na njeni površini pa se tvori nežen film, ki se postopoma zgosti, drobi in v kosmičih posede na dno.

Značilnost bakterij davice je njihova dobra rast na krvnih in serumskih gojiščih, ki vsebujejo takšne koncentracije kalijevega telurita, da zavirajo rast drugih vrst bakterij. To je posledica dejstva, da C. diphtheriae reducira kalijev telurit v kovinski telur, ki se odlaga v mikrobnih celicah in daje kolonijam značilno temno sivo ali črno barvo. Uporaba takšnih gojišč poveča odstotek zasejanja bakterij davice.

Corynebacterium diphtheriae fermentirajo glukozo, maltozo, galaktozo s tvorbo kisline brez plina, vendar ne fermentirajo (praviloma) saharoze, imajo cistinazo, nimajo ureaze in ne tvorijo indola. Po teh značilnostih se razlikujejo od tistih korineformnih bakterij (difteroidov), ki se najpogosteje nahajajo na sluznici očesa (Corynebacterium xerosus) in nazofarinksa (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum), in od drugih difteroidov.

V naravi obstajajo tri glavne različice (biotipi) davičnega bacila: gravis, intermedins in mitis. Razlikujejo se po morfoloških, kulturnih, biokemijskih in drugih lastnostih.

Razdelitev bakterij davice na biotipe je bila narejena ob upoštevanju oblik davice, pri katerih so te bakterije najpogosteje izolirane. Tip gravis je najpogosteje izoliran pri bolnikih s hudo obliko davice in povzroča skupinske izbruhe. Tip mitis povzroča blažje in sporadične primere bolezni, tip intermedius pa zaseda vmesni položaj med njima. Corynebacterium belfanti, ki je bil prej pripisan biotipu mitis, je izoliran kot samostojen, četrti biotip. Njegova glavna razlika od biotipov gravis in mitis je sposobnost redukcije nitratov v nitrite. Sevi Corynebacterium belfanti imajo izrazite adhezivne lastnosti, med njimi pa najdemo tako toksigene kot netoksigene različice.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Antigenska struktura korinebakterij

Korinebakterija je zelo heterogena in mozaična. V vseh treh vrstah povzročiteljev davice je bilo najdenih več deset somatskih antigenov, po katerih so razdeljeni na serotipe. V Rusiji je bila sprejeta serološka klasifikacija, po kateri ločimo 11 serotipov bakterij davice, od katerih je 7 glavnih (1-7) in 4 dodatni, redko srečljivi serotipi (8-11). Šest serotipov (1, 2, 3, 4, 5, 7) spada v tip gravis, pet (6, 8, 9, 10, 11) pa v tip mitis. Slabost metode serotipizacije je, da imajo mnogi sevi, zlasti netoksigeni, spontano aglutinacijo ali poliaglutinacijo.

[ 11 ]

Fagno tipiziranje bakterije Corynebacterium diphtheriae

Za razlikovanje bakterij davice so bile predlagane različne sheme fagotipizacije. Po shemi M. D. Krylova je mogoče z uporabo nabora 9 fagov (A, B, C, D, F, G, H, I, K) tipizirati večino toksigenih in netoksigenih sevov tipa gravis. Ob upoštevanju občutljivosti na določene fage, pa tudi kulturnih, antigenskih lastnosti in sposobnosti sinteze koricinov (baktericidnih beljakovin) je M. D. Krylova identificirala 3 neodvisne skupine korinebakterij tipa gravis (I-III). Vsaka od njih vsebuje podskupine toksigenih in njihovih netoksigenih analogov povzročiteljev davice.

Odpornost na korinebakterije

Corynebacterium diphtheriae kaže visoko odpornost na nizke temperature, vendar hitro umre pri visokih temperaturah: pri 60 °C - v 15-20 minutah, pri vrenju - po 2-3 minutah. Vsa razkužila (lizol, fenol, kloramin itd.) v običajno uporabljeni koncentraciji ga uničijo v 5-10 minutah. Vendar pa povzročitelj davice dobro prenaša sušenje in lahko dolgo časa ostane sposoben preživetja v posušeni sluzi, slini in prašnih delcih. V finem aerosolu ostanejo bakterije davice sposobne preživetja 24-48 ur.

Dejavniki patogenosti korinebakterij

Patogenost bakterije Corynebacterium diphtheriae je odvisna od prisotnosti številnih dejavnikov.

Dejavniki adhezije, kolonizacije in invazije

Strukture, odgovorne za adhezijo, niso bile identificirane, vendar brez njih davični bacil ne bi mogel kolonizirati celic. Njihovo vlogo opravljajo nekatere komponente celične stene patogena. Invazivne lastnosti patogena so povezane s hialuronidazo, nevraminidazo in proteazo.

Strupeni glikolipid, ki ga vsebuje celična stena patogena. Gre za 6,6'-diester trehaloze, ki vsebuje korinemikolno kislino (C32H64O3) in korinemikolno kislino (C32H62O3) v ekvimolarnih razmerjih (trehaloza-6,6'-dikorinemikolat). Glikolipid ima uničujoč učinek na tkivne celice na mestu razmnoževanja patogena.

Eksotoksin, ki določa patogenost povzročitelja in naravo patogeneze bolezni. Netoksigene variante C. diphtheriae ne povzročajo davice.

Eksotoksin se sintetizira kot neaktivni predhodnik - ena sama polipeptidna veriga z molekulsko maso 61 kD. Aktivira ga sama bakterijska proteaza, ki polipeptid razdeli na dva peptida, povezana z disulfidnimi vezmi: A (mw 21 kD) in B (mw 39 kD). Peptid B opravlja akceptorsko funkcijo - prepozna receptor, se nanj veže in tvori intramembranski kanal, skozi katerega peptid A prodre v celico in izvaja biološko aktivnost toksina. Peptid A je encim ADP-riboziltransferaza, ki zagotavlja prenos adenozin difosfat riboze iz NAD na enega od aminokislinskih ostankov (histidin) elongacijskega faktorja beljakovin EF-2. Zaradi modifikacije EF-2 izgubi svojo aktivnost, kar vodi do zaviranja sinteze beljakovin s strani ribosomov v fazi translokacije. Toksin sintetizirajo le tiste bakterije C. diphtheriae, ki v svojem kromosomu nosijo gene zmernega konvertirajočega profaga. Operon, ki kodira sintezo toksina, je monocistronski, sestavljen je iz 1,9 tisoč nukleotidnih parov in ima promotor toxP ter 3 regije: toxS, toxA in toxB. Regija toxS kodira 25 aminokislinskih ostankov signalnega peptida (zagotavlja sproščanje toksina skozi membrano v periplazemski prostor bakterijske celice), toxA - 193 aminokislinskih ostankov peptida A in toxB - 342 aminokislinskih ostankov peptida B toksina. Izguba profaga s strani celice ali mutacije v tox operonu naredijo celico rahlo toksigeno. Nasprotno, lizogenizacija netoksigenih C. diphtheriae s strani konvertirajočega faga jih spremeni v toksigene bakterije. To je bilo nedvoumno dokazano: toksigenost davičnih bakterij je odvisna od njihove lizogenizacije s toks-konvertirajočimi korinefagi. Korinefagi se integrirajo v kromosom korinebakterij z mehanizmom rekombinacije na specifičnem mestu, sevi bakterij davice pa lahko vsebujejo 2 mesti rekombinacije (attB) v svojih kromosomih, korinefagi pa se integrirajo v vsako od njih z enako frekvenco.

Genetska analiza številnih netoksičnih sevov bakterij davice, izvedena z uporabo označenih DNK sond, ki nosijo fragmente korinefagnega tox operona, je pokazala, da njihovi kromosomi vsebujejo zaporedja DNK, homologna korinefagnemu tox operonu, vendar bodisi kodirajo neaktivne polipeptide bodisi so v "tihem" stanju, tj. neaktivne. V zvezi s tem se postavlja zelo pomembno epidemiološko vprašanje: ali se lahko netoksične bakterije davice v naravnih pogojih (v človeškem telesu) transformirajo v toksigene, podobno kot se to dogaja in vitro? Možnost takšne transformacije netoksičnih kultur korinebakterij v toksigene z uporabo fagne konverzije je bila dokazana v poskusih na morskih prašičkih, piščančjih zarodkih in belih miših. Vendar pa še ni ugotovljeno, ali se to zgodi med naravnim epidemičnim procesom (in če se, kako pogosto).

Ker ima davični toksin v telesu bolnikov selektiven in specifičen učinek na določene sisteme (prizadeti so predvsem simpatično-adrenalni sistem, srce, krvne žile in periferni živci), je očitno, da ne le zavira biosintezo beljakovin v celicah, temveč povzroča tudi druge motnje v njihovi presnovi.

Za odkrivanje toksičnosti bakterij davice se lahko uporabijo naslednje metode:

• Biološki testi na živalih. Intradermalna okužba morskih prašičkov s filtratom jušne kulture davičnih bakterij povzroči nekrozo na mestu injiciranja. En minimalni smrtonosni odmerek toksina (20-30 ng) ubije morskega prašička, ki tehta 250 g, če ga injiciramo subkutano 4.-5. dan. Najbolj značilna manifestacija delovanja toksina je poškodba nadledvičnih žlez, ki so povečane in močno hiperemične.
• Okužba piščančjih zarodkov. Davični toksin povzroči njihovo smrt.
• Okužba celičnih kultur. Davični toksin povzroča izrazit citopatogeni učinek.
• Encimsko-imunski test na trdni fazi z uporabo antitoksinov, označenih s peroksidazo.
• Uporaba DNK sonde za neposredno detekcijo tox operona v kromosomu bakterij davice.

Vendar pa je najpreprostejša in najpogostejša metoda za določanje toksičnosti bakterij davice serološka - metoda gelske precipitacije. Njeno bistvo je naslednje. Trak sterilnega filtrirnega papirja velikosti 1,5 x 8 cm navlažimo z antitoksičnim antidifteričnim serumom, ki vsebuje 500 AE v 1 ml, in ga nanesemo na površino hranilnega medija v petrijevki. Posodica se suši v termostatu 15-20 minut. Testne kulture se zasejejo s plaki na obeh straneh papirja. Na eno posodo se zaseje več sevov, od katerih eden, očitno toksičen, služi kot kontrola. Plošče s kulturami se inkubirajo pri 37 °C, rezultati se upoštevajo po 24-48 urah. Zaradi protidifuzije antitoksina in toksina v gelu se na mestu njune interakcije tvori jasna precipitacijska linija, ki se združi s precipitacijsko linijo kontrolnega toksigenega seva. Nespecifični precipitacijski pasovi (nastanejo, če so poleg antitoksina v serumu v majhnih količinah prisotna tudi druga protimikrobna protitelesa) se pojavijo pozno, so šibko izraženi in se nikoli ne združijo s precipitacijskim pasom kontrolnega seva.

Postinfekcijska imunost

Močni, vztrajni, praktično vseživljenjski, ponavljajoči se primeri bolezni so redki - pri 5-7 % tistih, ki so preboleli bolezen. Imunost je predvsem antitoksične narave, protimikrobna protitelesa so manj pomembna.

Schickov test se je prej pogosto uporabljal za oceno stopnje imunosti proti davici. V ta namen so otrokom intradermalno injicirali 1/40 toksina morskega prašička v volumnu 0,2 ml. Če ni antitoksične imunosti, se na mestu injiciranja po 24–48 urah pojavita rdečina in oteklina s premerom več kot 1 cm. Takšna pozitivna Schickova reakcija kaže bodisi na popolno odsotnost antitoksina bodisi na to, da je njegova vsebnost manjša od 0,001 AE/ml krvi. Negativna Schickova reakcija se opazi, ko je vsebnost antitoksina v krvi višja od 0,03 AE/ml. Če je vsebnost antitoksina nižja od 0,03 AE/ml, vendar višja od 0,001 AE/ml, je Schickova reakcija lahko pozitivna ali včasih negativna. Poleg tega ima sam toksin izrazito alergeno lastnost. Zato je za določitev stopnje imunosti proti davici (kvantitativna vsebnost antitoksina) bolje uporabiti RPGA z eritrocitnim diagnostikumom, senzibiliziranim z davičnim toksoidom.

Epidemiologija davice

Edini vir okužbe je oseba – bolna oseba, okrevajoča oseba ali zdrav nosilec bakterije. Okužba se pojavi s kapljicami v zraku, prahom v zraku in prek različnih predmetov, ki jih uporabljajo bolni ali zdravi nosilci: posoda, knjige, perilo, igrače itd. V primeru kontaminacije živil (mleko, kreme itd.) je okužba možna po prehranski poti. Največje izločanje povzročitelja se pojavi v akutni obliki bolezni. Vendar pa so ljudje z latentnimi, atipičnimi oblikami bolezni največji epidemiološki pomen, saj pogosto niso hospitalizirani in niso takoj odkriti. Bolnik z davico je kužen ves čas bolezni in del obdobja okrevanja. Povprečno obdobje prenašanja bakterij pri okrevajočih se giblje od 2 do 7 tednov, lahko pa traja tudi do 3 mesece.

Zdravi nosilci imajo posebno vlogo v epidemiologiji davice. V pogojih sporadične obolevnosti so glavni distributerji davice in prispevajo k ohranjanju povzročitelja v naravi. Povprečno trajanje prenašanja toksigenih sevov je nekoliko krajše (približno 2 meseca) kot netoksigenih (približno 2-3 mesece).

Razlog za nastanek zdravega nosilca toksigenih in netoksigenih bakterij davice ni povsem razkrit, saj tudi visoka raven antitoksične imunosti ne zagotavlja vedno popolne osvoboditve telesa od povzročitelja. Morda ima raven antibakterijske imunosti določen pomen. Primarnega epidemiološkega pomena je nosilstvo toksigenih sevov bakterij davice.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Simptomi davice

Ljudje vseh starosti so dovzetni za davico. Povzročitelj lahko prodre v človeško telo skozi sluznice različnih organov ali skozi poškodovano kožo. Glede na lokalizacijo procesa ločimo davico žrela, nosu, grla, ušesa, očesa, genitalij in kože. Možne so mešane oblike, na primer davica žrela in kože itd. Inkubacijska doba je 2-10 dni. Pri klinično izraženi obliki davice se na mestu lokalizacije povzročitelja razvije značilno fibrinozno vnetje sluznice. Toksin, ki ga proizvaja povzročitelj, najprej prizadene epitelijske celice, nato pa bližnje krvne žile, kar poveča njihovo prepustnost. Izhajajoči eksudat vsebuje fibrinogen, katerega koagulacija povzroči nastanek sivkasto bele filmske prevleke na površini sluznice, ki je tesno spojena s podložnim tkivom in ob odtrganju povzroči krvavitev. Posledica poškodbe krvnih žil je lahko razvoj lokalnega edema. Davica žrela je še posebej nevarna, saj lahko povzroči difteritični krup zaradi edema sluznice grla in glasilk, zaradi katerega je prej zaradi zadušitve umrlo 50–60 % otrok z davico. Davični toksin, ki vstopi v kri, povzroči splošno globoko zastrupitev. Prizadene predvsem srčno-žilni, simpatično-nadledvični sistem in periferne živce. Tako so simptomi davice sestavljeni iz kombinacije lokalnih znakov, odvisnih od lokacije vstopnih vrat, in splošnih simptomov, ki jih povzroča zastrupitev s toksinom in se kažejo v obliki adinamije, letargije, bledice kože, nizkega krvnega tlaka, miokarditisa, paralize perifernih živcev in drugih motenj. Davica pri cepljenih otrocih, če jo opazimo, običajno poteka v blagi obliki in brez zapletov. Stopnja umrljivosti v obdobju pred uporabo seroterapije in antibiotikov je bila 50–60 %, zdaj pa je 3–6 %.

Laboratorijska diagnostika davice

Edina metoda mikrobiološke diagnostike davice je bakteriološka, z obveznim testiranjem izolirane kulture korinebakterij na toksičnost. Bakteriološke študije za davico se izvajajo v treh primerih:

• za diagnozo davice pri otrocih in odraslih z akutnimi vnetnimi procesi v žrelu, nosu in nazofarinksu;
• po epidemioloških indikacijah oseb, ki so bile v stiku z virom povzročitelja davice;
• osebe, ki so bile na novo sprejete v sirotišnice, vrtce, internate in druge posebne ustanove za otroke in odrasle, da bi med njimi odkrili morebitne nosilce davičnega bacila.

Material za študijo je sluz iz žrela in nosu, film iz tonzil ali drugih sluznic, ki so vstopna točka za patogena. Sejanje se opravi na teluritni serum ali krvno gojišče in hkrati na koagulirano serumsko gojišče Roux (koagulirani konjski serum) ali Loeffler (3 deli govejega seruma + 1 del sladkorne juhe), na katerem se rast korinebakterij pojavi po 8–12 urah. Izolirano kulturo identificiramo s kombinacijo morfoloških, kulturnih in biokemijskih lastnosti, pri čemer se po možnosti uporabijo metode sero- in fagotipizacije. V vseh primerih je obvezen test toksičnosti z eno od zgoraj navedenih metod. Morfološke značilnosti korinebakterij je najbolje preučiti s tremi metodami barvanja razmaza: Gram, Neisser in metilensko modro (ali toluidinsko modro).

Zdravljenje davice

Specifično zdravljenje davice je uporaba antitoksičnega seruma proti davici, ki vsebuje vsaj 2000 ie na 1 ml. Serum se daje intramuskularno v odmerkih od 10.000 do 400.000 ie, odvisno od resnosti bolezni. Učinkovita metoda zdravljenja je uporaba antibiotikov (penicilini, tetraciklini, eritromicin itd.) in sulfonamidov. Za spodbujanje proizvodnje lastnih antitoksinov se lahko uporabi anatoksin. Za odstranitev bakterijskega nosilca je treba uporabiti antibiotike, na katere je dani sev korinebakterij zelo občutljiv.

Specifična profilaksa davice

Glavna metoda boja proti davici je množično načrtovano cepljenje prebivalstva. V ta namen se uporabljajo različne možnosti cepljenja, vključno s kombiniranimi, tj. tistimi, ki so namenjene hkratnemu ustvarjanju imunosti proti več patogenom. Najbolj razširjeno cepivo v Rusiji je DPT. Gre za suspenzijo bakterij oslovskega kašlja, adsorbiranih na aluminijev hidroksid, ubitih s formalinom ali timerosalom (20 milijard v 1 ml), ki vsebuje davični toksoid v odmerku 30 flokulirajočih enot in 10 enot vezavnega tetanusnega toksoida v 1 ml. Otroci se cepijo od 3. meseca starosti, nato pa se izvajajo revakcinacije: prva po 1,5-2 letih, naslednja pri 9 in 16 letih ter nato vsakih 10 let.

Zahvaljujoč množičnemu cepljenju, ki se je v ZSSR začelo leta 1959, se je incidenca davice v državi do leta 1966 v primerjavi z letom 1958 zmanjšala za 45-krat, njen kazalnik pa je bil leta 1969 0,7 na 100.000 prebivalcev. Kasnejše zmanjšanje obsega cepljenja v osemdesetih letih prejšnjega stoletja je povzročilo resne posledice. V letih 1993–1996 je Rusijo zajela epidemija davice. Zboleli so odrasli, predvsem necepljeni, in otroci. Leta 1994 je bilo registriranih skoraj 40 tisoč bolnikov. V zvezi s tem se je nadaljevalo množično cepljenje. V tem obdobju je bilo cepljenih 132 milijonov ljudi, od tega 92 milijonov odraslih. V letih 2000–2001 je bila precepljenost otrok v predpisanem roku 96-odstotna, s revakcinacijo pa 94-odstotna. Zaradi tega se je incidenca davice leta 2001 v primerjavi z letom 1996 zmanjšala za 15-krat. Da pa bi zmanjšali incidenco na posamezne primere, je treba cepiti vsaj 97–98 % otrok v prvem letu življenja in zagotoviti množično revakcinacijo v naslednjih letih. Zaradi širokega prenašalstva toksigenih in netoksigenih bakterij davice je malo verjetno, da bo davica v prihodnjih letih popolnoma izkoreninjena. Rešitev tega problema bo trajala tudi nekaj časa.