Diagnoza herpesa

Diagnoza herpesa temelji na klasični izolaciji virusa na občutljivih celičnih kulturah, imunofluorescenčnih in seroloških metodah, kolposkopskem pregledu ter uporabi sodobnih molekularno-bioloških metod (PCR, pikčasta hibridizacija), ki omogočajo diagnosticiranje celotne skupine herpesvirusov, vključno s tipoma HHV-6 in HHV-7.

Laboratorijske diagnostične metode za okužbo s herpesom

Glavne metode za izolacijo HSV ali odkrivanje virusnih delcev in/ali njihovih komponent	Pomožne metode za odkrivanje protiteles proti HSV v bioloških tekočinah človeškega telesa
Izolacija HSV v občutljivih celičnih in živalskih kulturah Neposredna in imunska elektronska mikroskopija Neposredne in posredne različice IPA IFA Molekularno biološke metode Reakcija aglutinacije lateksa	Nevtralizacijska reakcija RSC Določanje protiteles proti nestrukturnim beljakovinam HSV-1,2

Pokazalo se je, da pri 76 % bolnikov genitalni herpes (GH) povzroča HSV-2, pri 24 % pa HSV-1. Poleg tega se je GH kot monoinfekcija pojavil le pri 22 % bolnikov, v 78 % primerov pa so bile odkrite mikrobne asociacije. Pri 46 % posameznikov je bila odkrita parazitocenoza, ki sta jo povzročila dva patogena, vključno s klamidijo, ki je bila odkrita v 40 % primerov. Gardnerella, Trichomonas in gonokoki so bili v razmazih manj pogosto odkriti.

Pri 27 % bolnikov je bila parazitocenoza predstavljena s tremi patogeni, pri 5,2 % pa s štirimi patogeni. Poleg tega je bila najpogosteje opažena kombinacija klamidije z gardnerelo in glivami Candida. Ti podatki utemeljujejo potrebo po temeljitem bakteriološkem pregledu bolnikov z GH, da bi ugotovili kombinacije patogenih povzročiteljev, ter poglobljeno študijo patogeneze mešanih okužb urogenitalnega trakta, kar bo omogočilo diferencirano kompleksno zdravljenje herpesne okužbe.

Materiali, preučevani za izolacijo HSV glede na lokalizacijo herpetičnih lezij

Lokalizacija lezij	Vsebina veziklov	Strganje celic				Likvor	Bronhialni aspirat	Biopsija	Kri
		1	2	3	4
Usnje	+								+
Oči			+						+
Genitalije				+					+
Anus	+				+				+
Usta	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Pljuča		+					+		+
Jetra								+	+
Prirojeni herpes	+	+	+				+		+

Metode laboratorijske diagnostike okužbe s citomegalovirusom

Metode	Čas, potreben za pridobitev rezultatov	Opombe
VIROLOŠKO
Elektronska mikroskopija	3 ure	Ni zelo dostopno
Izolacija virusa v celični kulturi (VCI)	4–20 dni	Standardno, Počasno
Imunofluorescenčno barvanje zgodnje AG z uporabo monoklonskih protiteles	6 ur	Manj specifično
CITOLOŠKI	2–3 ure	Manj specifično
SEROLOŠKO
RSC	2 dni	Standardno
RGA	1 dan	Delovno intenzivno
GREBEN	6 ur	Preprosto, specifično
NRIF	6 ur	Težko
RIMP	6 ur	Težko
ELISA (IgM, DO)	6 ur	Hitro, preprosto
Imunoblot	6 ur	Drago
MOLEKULARNO BIOLOŠKO
MG	5–7 dni	Drago, delovno intenzivno
PCR	3 ure	Drago

Metode diagnosticiranja virusa herpes zoster

Diagnostične metode	Laboratorijske tehnike
POSREDNO
Izbor	Tkivne kulture, piščančji zarodki, laboratorijske živali, sokulture s permisivnimi celicami ali pomožnimi virusi
Identifikacija izolatov	Nevtralizacijske reakcije, RSC, IF, PIEF, reakcija precipitacije izolatov, aglutinacija, IF
NEPOSREDNO
Citologija	Razmazi: barvna imunofluorescenca
Histologija	Patomorfologija celice
Struktura	Embrionalna mikroskopija, imunoelektronska mikroskopija
Določanje antigenov	ČE, PIEF, RIM, IFA
Določanje lokalne proizvodnje protiteles	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekularno biološki pristopi	Molekularna hibridizacija, PCR

Laboratorijska diagnostika okužbe, ki jo povzroča virus herpes zoster

Diagnostične težave	Metode	Pričakovani rezultati
Akutna primarna okužba	1	Zaznavanje v 2 urah
	2	Raven protiteles se počasi zvišuje
	3	Pojavi se 3 dni po okužbi
Akutna reaktivirana okužba	1	Zaznavanje UUU po 2 urah
	2	Raven protiteles se počasi zvišuje
	4	Pojavi se 4 dni po pojavu izpuščaja

1. določanje veziklov VEGF v tekočini;
2. serologija: CSC, ELISA, namenjena detekciji
3. serologija: ELISA, namenjena odkrivanju IgM;
4. serologija: ELISA, namenjena odkrivanju IgA, IgM.

Metode za prikaz imunskega odziva na okužbo z virusom herpes zoster

Pristop	Metoda
Zaznavanje povečanega titra protiteles v drugem serumu	RSK, RTGA, RPGA, IF nevtralizacijske reakcije, RIM, ELISA
Detekcija specifičnih protiteles Ig G in Ig A v prvem vzorcu seruma	ELISA, IF, RIM, lateks aglutinacija

Interpretacija rezultatov serološke preiskave serumov bolnikov za okužbe s herpesvirusi (ELISA)

Ime okužbe/označevalca	Povprečne mejne vrednosti za okužbe
	Rezultati analize	Interpretacija
Citomegalija Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Protitelesa proti CMV IgM (100–300 %)	Pozitivno 1–6 Pozitivno 6–10 Pozitivno >10 Negativno Pozitivno 100–300 Negativno <90 Dvomljivo 90–100	Remisija Poslabšanje bolezni Akutna faza bolezni Brez okužbe (bolezni) Akutna faza bolezni Analizo ponovite čez 2–3 tedne
Herpes simplex 1, 2 serotipa Anti-HSV 1/2 skupaj (100–900 %)	Pozitivno 100–400 Pozitivno 400–800 Pozitivno >800 Negativno <100	Remisija Poslabšanje bolezni Akutna faza bolezni Brez okužbe (bolezni)

V tabeli so predstavljene glavne metode laboratorijske diagnostike okužb s herpesvirusom, pa tudi priporočeni biološki materiali, ki se pregledujejo pri izolaciji HSV, ob upoštevanju lokalizacije herpetičnih lezij.

Zanesljiva izolacija virusov herpes simpleksa in CMV z okužbo občutljivih celičnih kultur. Tako je bil med virološkim pregledom 26 bolnikov v obdobju ponovitve HSV izoliran na občutljivi celični kulturi Vero v 23 primerih (88,4 %). Okužene kulture so pokazale sliko citopatnega delovanja, značilno za HSV - nastanek večjedrnih velikanskih celic ali kopičenje zaobljenih in povečanih celic v obliki grozdov. V 52,1 % primerov je bilo mogoče žarišča citopatnega delovanja virusa odkriti že 16–24 ur po okužbi. Po 48–72 urah inkubacije okuženih kultur se je odstotek snovi, ki povzročajo specifično uničenje celic, povečal na 87 %. In le v 13 % primerov so bili pozitivni rezultati odkriti 96 ur po okužbi ali več ali med ponovnim pasiranjem.

Metode laboratorijske diagnostike generalizirane herpesne okužbe

Glavne metode za odkrivanje (izolacijo) herpesvirusov, njihovih delcev in njihovih komponent

Pomožne metode, namenjene odkrivanju protiteles proti herpesvirusom v bioloških tekočinah, odkrivanju encimskih premikov v krvnem serumu

Izolacija herpesvirusov na občutljivih celičnih in živalskih kulturah Neposredna in imunska elektronska mikroskopija Neposredne in posredne različice imunoperoksidazne metode Neposredne in posredne različice metode s fluorescentnimi protitelesi Različice encimskega imunskega testa v trdni fazi Različice metode molekularne (DNA-DNA) hibridizacije Polimerazna verižna reakcija Reakcija lateks aglutinacije

Nevtralizacijski test Test fiksacije komplementa Test lateks aglutinacije Indirektna različica metode s fluorescentnimi protitelesi Indirektna različica imunoperoksidazne metode Različice encimskega imunskega testa v trdni fazi Metoda imunskega blotinga Metoda radialne fiksacije komplementa Določanje ravni alanina in aspartat aminotransferaze

Za diagnosticiranje infekcijske mononukleoze (okužbe, ki jo povzroča EBV) se uporabljajo serološke metode. Paul-Bunnellova reakcija z ovnovimi eritrociti, diagnostični titer 1:28 ali več pri enkratnem testu krvnega seruma ali 4-kratno povečanje protiteles pri pregledu parnih serumov. Uporablja se Hoff-Bauerjeva reakcija s 4 % suspenzijo formaliniziranih konjskih eritrocitov. Rezultat se upošteva po 2 minutah; pri infekcijski mononukleozi je reakcija zelo specifična.

Trenutno se razvija metoda encimsko-imunskega testa (EIA) za diagnosticiranje infekcijske mononukleoze. V tem primeru se protitelesa IgG in IgM v bolnikovem serumu določijo z inkubacijo z limfoblasti, okuženimi z EBV, čemur sledi zdravljenje s fluorescentnimi protitelesi. V akutnem obdobju bolezni se protitelesa proti virusnemu kapsidnemu antigenu določajo v titru 1:160 in več.

Pri uporabi številnih uvoženih komercialnih testnih sistemov lahko ELISA zazna: protitelesa proti ovojnici EBV, protitelesa proti zgodnjemu antigenu EBV, skupna protitelesa proti zgodnjemu antigenu EBV, določena v akutni fazi bolezni tako v jedru kot v celični citoplazmi, in omejena protitelesa proti zgodnjemu EBV, določena v akutni fazi bolezni tako v jedru kot v celični citoplazmi, omejena protitelesa proti zgodnjemu antigenu EBV, določena na vrhuncu bolezni samo v celični citoplazmi, in protitelesa proti jedrnemu antigenu EBV. Uporaba teh testnih sistemov omogoča diferencialno diagnostiko številnih bolezni, povezanih z EBV.

Po pozitivnem testu ELISA, ki razkrije protitelesa proti EBV, se izvede potrditvena imunobloting reakcija, ki določa prisotnost protiteles proti posameznim markerskim proteinom EBV (p-proteinom): p23, p54, p72 (prisotnost tega proteina kaže na možnost razmnoževanja EBV), p 138. Zgornje laboratorijske metode se uporabljajo tudi za spremljanje učinkovitosti zdravljenja.

Občutljivost viroloških metod je 85–100 %, specifičnost 100 %, čas študije pa 2–5 dni. V praksi se pogosto uporablja metoda direktne imunofluorescence (DIF) s poliklonskimi ali monoklonskimi protitelesi proti HSV-1 in HSV-2. Metoda DIF je v običajnem kliničnem laboratoriju dokaj enostavno ponovljiva, ni draga, občutljivost je nad 80 %, specifičnost pa 90–95 %. Imunofluorescenčna mikroskopija je razkrila prisotnost citoplazemskih vključkov, morfološke značilnosti in odstotek okuženih celic v razmazih-strganjih iz sečnice, cervikalnega kanala, materničnega vratu in danke.

Metoda PIF daje predstavo o morfoloških lastnostih celic in spremembah v lokalizaciji antigenov HSV. Poleg neposrednih znakov poškodbe celic s herpesvirusi (zaznavanje specifične luminiscence) obstajajo tudi posredni znaki okužbe s herpesom glede na podatke PIF:

• agregacija jedrne snovi, odstop karioleme;
• prisotnost tako imenovanih "luknjastih" jeder, ko iz celičnega jedra ostane le ena kariolema;
• prisotnost intranuklearnih vključkov - Cowdryjeva telesca.

Pri izvajanju PIF zdravnik prejme ne le kvalitativno, temveč tudi kvantitativno oceno stanja okuženih celic, ki smo jo uporabili za oceno učinkovitosti protivirusnega zdravljenja z aciklovirjem (AC). Tako je bilo z metodo PIF v dinamiki pregledanih 80 bolnikov z enostavnim genitalnim herpesom (GH). Izkazalo se je, da je imelo pred zdravljenjem z aciklovirjem 88 % bolnikov visok odstotek okuženih celic (50–75 % in več) v razmazih, po enem ciklu aciklovirja pa so v razmazih pri 44 % bolnikov odkrili zdrave celice, v 31 % primerov so opazili posamezne okužene celice, pri 25 % bolnikov pa je bilo okuženih celic do 10 %.

Vsebnost okuženih celic v razmazih (PIF reakcija) bolnikov z genitalnim herpesom, zdravljenih z aciklovirjem

Obdobja bolezni	Odstotek vsebnosti v razmazih
	Okužene celice					Normalne celice
	Več kot 75 %	50–75 %	40–50 %	10 %	Posamezne celice v vidnem polju
Recidiv (pred zdravljenjem)	25 %	63 %	12 %
	(20)	(50)	(10)
Remisija (po zdravljenju)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Z uporabo PIF in metode pikčaste hibridizacije že vrsto let ugotavljamo, da se rezultati študije ujemajo v skoraj 100 % primerov. Treba je opozoriti, da je za povečanje zanesljivosti diagnoze herpesa, zlasti v primerih subkliničnih in nizko manifestnih oblik herpesa, priporočljivo uporabljati 2-3 metode laboratorijske diagnostike pri delu, zlasti pri pregledu nosečnic, žensk z neugodno porodniško anamnezo in oseb z nedoločeno ginekološko diagnozo.

Pri PCR diagnostiki virusnih in bakterijskih okužb urogenitalnega trakta je torej treba pozitivne rezultate oceniti ob upoštevanju anamneze ter prisotnosti (ali odsotnosti) specifičnih kliničnih simptomov bolezni. Če se s PCR odkrije klamidija, obstaja velika verjetnost okužbe in se lahko ustrezno rešijo vprašanja terapije. V primeru odkritja mikoplazem (ureaplazm), ki so oportunistični mikroorganizmi, so za potrditev diagnoze potrebne dodatne kulturne študije, tj. setev materiala bolnika na občutljive celične kulture. Le če se pri kulturni analizi dobijo pozitivni rezultati, lahko govorimo o laboratorijski potrditvi diagnoze mikoplazmoze. Ista metoda bo po potrebi omogočila določitev občutljivosti izoliranih mikoplazem na pogosto uporabljene farmacevtske oblike (antibiotiki, fluorokinoloni itd.).

Možna je sočasna okužba z več virusi družine Herpesviridae. Pogosto smo pri enem bolniku odkrili okužbo z virusi HSV-1, HSV-2 in CMV. Bolniki s kliničnimi in laboratorijskimi manifestacijami sekundarnega IDS (onkohematološki, onkološki, z virusom HIV okuženi bolniki) so bili bistveno pogosteje okuženi z več herpesvirusi. Tako je bilo dokazano, da klinične in imunološke motnje, ki napredujejo pri okužbi z virusom HIV, spremlja povečanje števila herpesvirusov, odkritih z metodo molekularne hibridizacije. V tem primeru lahko za prognostično najpomembnejšo kompleksno sočasno odkrivanje DNK tipa HSV-1, CMV in HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]