Laboratorijska diagnostika tuberkuloze

Tuberkuloza je bolezen, ki jo je težko diagnosticirati v sodobnih razmerah in znanstvenih dosežkih. Laboratorijska diagnoza tuberkuloze je osrednjega pomena za druge diagnostične metode, drugič pa le za rentgenske metode raziskovanja.

[1], [2], [3], [4],

Klinični test krvi

Pri bolnikih s tuberkulozo spremembe v splošni analizi krvi niso patognomonične. Z omejenimi in neaktivnimi oblikami tuberkuloze je eritrocit v normalni količini hipokromna. Ko masivne infiltrati ali kazeozni pljučnica, medtem Razširjenost kazeoznega limfadenitis, določenih črevesnih lezij, kot tudi za velike pljučni ali pooperativne krvavitve in note erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytoza in še posebej poikilotsitoz se srečujeta veliko manj pogosto, običajno s hudo anemijo. Število retikulocitov v koraku tuberkuloze vodena v območju od 0,1 do 0,6%, pri čemer subcompensated - od 0,6 do 1,0% in 1%, ki je označen z dekompenzirano retikulocitov.

Ko tuberkuloze v nekaterih primerih lahko pride do zmerno levkocitoza (do 15 tisoč levkocitov.), Zmanjšano sevanje, ki se pojavijo pri 2-7% bolnikov z omejenimi in enostaven postopek pojavljajo oblikah in pri 12,5% - s porušitvijo in napredujočega pljučno tuberkulozo .

Najpogostejši premiki se pojavijo v formuli levkocitov. Označite relativno in absolutno nevtrofilijo, zmeren premik levkocitne formule na levo pred promielociti. Mielociti so zelo redki v primeru nezapletene tuberkuloze. Povečanje števila nevtrofilcev z nenormalno žita pri bolnikih s tuberkulozo haemogram vedno kaže na trajanje postopka: pri bolnikih s hudo tuberkulozo skoraj vse nevtrofilci vsebujejo nenormalno žito. Ko tuberkularni izbruh preneha, se jedrski premik sorazmerno hitro približuje normalnemu. Patološka granularnost nevtrofilcev običajno traja dlje kot druge spremembe hemograma.

Vsebnost eozinofilov v periferni krmi se spreminja tudi glede na fazo procesa in alergijsko stanje organizma. Njihovo število zmanjšuje, dokler aneozinofiliya v hude in podaljšane izbruha bolezni in obratno, povečanje kot resorpcijo infiltratov in plevralni izliv, ter zgodnje oblike primarne tuberkuloze.

Večino oblik primarne tuberkuloze spremlja limfopenija, ki se včasih opazuje že vrsto let, tudi po brazgotinjenju specifičnih sprememb. Sekundarno tuberkulozo v fazi poslabšanja, odvisno od resnosti procesa, lahko spremlja bodisi normalno število limfocitov ali limfopenija.

To ima posebno mesto odločilno določanje sedimentacije eritrocitov Dodatni testi za oceno tuberkulozne postopek (SR), ki ima vrednost v ocenjevanju procesa tuberkuloze pretoka in opredeljevanje aktivne oblike. Povečanje ESR kaže na prisotnost patološkega procesa (infekcijska protivnetno, supuratvni septični, hemoblastoze, Hodgkinov et al.) In kaže na njeno težo, vendar normalno raven ESR vedno ne kažejo na odsotnost patologije. Pospeševanje sedimentacije eritrocitov olajša povečanje vsebnosti globulina, fibrinogena, holesterola v krvi in zmanjšanja viskoznosti krvi. Upočasnitev sedimentacije eritrocitov je značilna za stanja, ki jih spremlja hemokoncentracija, povečanje vsebnosti albuminov in žolčnih kislin.

Hemogram pri bolnikih s tuberkulozo se med zdravljenjem spremeni. Hematološki premiki izginejo hitreje, bolj uspešna je terapevtska intervencija. Vendar pa je treba upoštevati učinek na hemopoezo različnih antibakterijskih zdravil. Pogosto povzročajo eozinofilijo, v nekaterih primerih - levkocitozo in pogosteje levkopenijo do agranulocitoze in limfoidno-retikularne reakcije. Sistematični hematološki nadzor in pravilna analiza pridobljenih podatkov sta bistvenega pomena za oceno kliničnega stanja pacienta, dinamiko postopka in učinkovitost uporabljenega zdravljenja.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinična analiza urina

S tuberkulozo urinskega sistema je glavna laboratorijska diagnostična metoda analiza urina. Lahko opazite levkociturijo, eritrociturijo, proteinurijo, hipoisostenurijo, mikobakterijo tuberkuloze, nespecifično bakteriurijo.

Levkociturija - najpogostejši simptom tuberkuloze v sečilih pred kemoterapijo in obstaja nobena posebna le v izjemnih primerih, kot so popolno zaporo na lumen sečevod. Test Nechyporenko (določanje števila levkocitov v 1 ml urina), pripomore k bolj objektivno oceniti stopnjo leukocyturia nefrotuberkuloze s, in v nekaterih primerih, da ga prepoznajo na normalno urina. Vendar pa je treba upoštevati, da lahko pri akutnem in kroničnem pijelonefritisu, cistitisu, uretritisu, ledvicah in uretricih pride do levkociturije.

Eritrociturija. Kot tudi levkociturija. Se štejejo za enega najpogostejših laboratorijskih znakov tuberkuloze genitourinarskega sistema. Pogostost hematurije je odvisna od razširjenosti procesa, se povečuje, ko se v ledvicah razvije destruktivni proces tuberkuloze. Eritrociturija brez levkociturije je bolj značilna za zgodnje faze ledvične tuberkuloze. Hematurija, ki prevladuje nad levkociturijo, je pomemben argument v korist tuberkuloze ledvic pri njeni diferenciaciji z nespecifičnim pijelonefritisom.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokemijski test krvi

Pri tuberkulozi so spremembe v nekaterih biokemičnih parametrih odvisne predvsem od faze procesa, zapletov in različnih sočasnih bolezni. Pri bolnikih z neaktivnim tuberkulozo pljuč in drugih organov so skupne beljakovinske in proteinske frakcije krvnega seruma nespremenjene in določajo njihovo normalno vsebnost.

Pri akutnih oblikah bolezni, pa tudi pri poslabšanju in napredovanju kroničnih oblik tuberkuloze se koeficient albumin-globulin zmanjša.

Bistveno pri ocenjevanju funkcionalnega stanja organske poškodbe in jeter pri tuberkulozi in njenih zapletov je določitev serumskega parova in neposrednega bilirubina, AST (ACT), alanin aminotransferaze (ALT) o. Dinamično določanje ravni aminotransferaz. Bilirubin pri zdravljenju bolnikov s tuberkulozo, zlasti pri težjih oblikah, - obvezno komponento biokemijske preizkusa bolnikih s tuberkulozo in poteka mesečno.

Ocena funkcionalnega stanja ledvic vključuje določanje serumskega kreatinina in izračun hitrosti glomerularne filtracije po formuli Cockcroft-Gault. Izračun hitrosti glomerularne filtracije z uporabo Rebergovega vzorca daje manj natančne rezultate.

Glavni cilj dinamičnih biokemijskih študij bolnikov s tuberkulozo je spremljanje poteka procesa, pravočasna odkrivanje neželenih učinkov zdravil in ustrezna korekcija nastajajočih homeostatskih motenj.

[17], [18], [19]

Uporaba biokemijskih metod preiskave pri zunajlujoči tuberkulozi

Najbolj informativen kazalnik je vsebnost tuberkulostearinske kisline v bioloških tekočinah, vendar je njegova opredelitev povezana s tehničnimi težavami (potreba po plinski kromatografiji in masni spektrometriji).

Prospektivno merjenje aktivnosti adenozin deaminaze - encima, določenega v tekočinah: sinovialni, perikardialni, ascitični ali hrbtenični. Glavni proizvajalci adenozin deaminaze so limfociti in monociti. Določitev aktivnosti adenozin deaminaze v bioloških tekočinah olajša diagnozo sinovitisa tuberkuloze, tuberkuloze bezgavk, meningitisa tuberkuloze, serozitisa tuberkuloze.

Nekateri biokemični kazalci zaradi njihove nespecifičnosti so določeni samo v bioloških tekočinah, blizu lezijskega ostrenja. Izmerite raven kazalcev kot odziv na subkutano ali intradermalno vbrizgavanje tuberkulina (ponavadi prej in 48 ur in 72 ur po njej). Po tem se stopnja povečanja stopnje markerja (v%) izračuna glede na začetno raven.

Optimalno določanje aktivnosti urgentnega encima transamnidaze v urinu, katerega videz je opazen pri porazdukciji ledvic različnih vrst. Študija transamidinaze je upravičena samo pod pogoji subkutane injekcije tuberkulina, da bi se poslabšal lokalni vnetni proces. Določite aktivnost transamidina v urinu na začetku in 24-72 ur po uvedbi 50 TE tuberkulina. Povečanje fermentije v 2-kratni in večji količini omogoča, da v 82% primerov razlikuje aktivno tuberkulozo ledvic pred poslabšanjem kroničnega pielonefritisa.

S tuberkulozo ženskih spolnih organov se koncentracije haptoglobina in maloničnega dialdehida v krvi določijo v pogojih provokativnega tuberkulinskega testa. Subkutano injiciran tuberkulin v odmerku 50 TE in 72 ur pozneje je izvedel drugo biokemijsko študijo. V primeru etiologije tuberkuloze stopnja zvišanja ravni haptoglobina ni manjša od 28%, raven malondialdehida pa 39% ali več. Uporablja se tudi določitev aktivnosti adenozin deaminaze v peritonealni tekočini, pridobljeni iz prostora Douglas. Pankat se ponovno pregleda 72 ur po intradermalni uporabi tuberkulina v odmerkih 0,1 TE in 0,01 TE v projekcijo notranjih spolnih organov na sprednji trebušni steni. V korist tuberkuloznega procesa je povečanje aktivnosti adenozin deaminaze 10% ali več v primerjavi z začetnim.

Ko je okuženo, se proučuje žariščna reakcija, ki se pojavi v očesu kot odziv na antigensko stimulacijo. Ni zaželeno razviti izrazitega odziva, ki ga spremlja zmanjšanje vizualnih funkcij. Ker je ocena minimalnih žariščnih reakcij pogosto težka, je za objektivizacijo sklepa priporočljivo vzporedno orientirati in na stopnjo rasti serumskega krvnega tlaka haptoglobina ali adenozin deaminaze.

Vse biokemijske študije je treba izvesti v povezavi z drugimi metodami.

[20], [21], [22], [23],

Raziskave krvnega koagulacijskega sistema

Ustreznost stanja raziskovalnega sistema strjevanja krvi TB je posledica prisotnosti številnih bolnikih s pljučno tuberkulozo hemoptizo ali pljučna krvavitev, kot tudi hemocoagulation zapletov pri kirurškem zdravljenju tuberkuloze. Poleg tega latentni tok intravaskularne hemokaguagulacije, ki seveda spremlja tuberkulozo, vpliva na potek bolezni in učinkovitost kemoterapije.

Pri bolnikih s pljučno TB razširjenosti eksudativne vnetje sestavina je zmanjšanje krvnega antikoagulacijsko aktivnost. Pri bolnikih z nizko stopnjo prevalence določene lezije v pljučih s katerimi prevladujejo produktivno hemocoagulation intravaskularno vnetno komponento rahlo izraženo. Pri bolnikih s pljučno tuberkulozo s hemoptiza in pljučne krvavitve državne sistem strjevanja krvi je drugačen: pri bolnikih z nizko izgubo krvi na višini gemoptoe ali takoj po prenehanju obstaja močno povečan krvni koagulacijski sposobnosti zaradi hude okrepitev trombinoobrazovaniya ob ohranjanju večje "strukturne" strjevanja. Pri bolnikih z masivno izgubo krvi opazili strjevanja morebitnega padca na račun znižanje koncentracije fibrinogena. Dejavnost faktorja XIII, število trombocitov. V fazi kirurškega zdravljenja pri bolnikih z omejenimi oblik pljučne tuberkuloze s pomembnimi kršitve pojavlja sistem homeostaze. Bolniki z razširjeno procesa pri izvajanju pnevmon- ali plevropnevmonektomii pogosto razvijejo DIC, ki lahko prevzamejo obliko "drugo bolezen."

Za spremljanje stanja strjevanja krvi pri bolnikih treba pulmonalne tuberkuloze izvede določanje aktiviranega delnega tromboplastinskega časa (aPTT), fibrinogen, trombinskega časa, protrombinskega indeksa in čas krvavitve in čas strjevanja.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonska raziskava

Sodobne eksperimentalne in klinične opazke kažejo na prisotnost sprememb hormonskega stanja pri specifičnem tuberkuloznem vnetju pljuč. Dokazano je, da je korekcija disfunkcije hipofiznih-nadledvično žlezo, hipofizo-ščitnice sistemov in funkcijo trebušne slinavke v povezavi s terapijo proti TB prispeva k aktiviranju fibrogeneze in popravilo pri vnetju posebno lokus.

Funkcionalno stanje hipofize, ščitnice sistema se ocenjuje z vsebnostjo v krvnem serumu trijodotironina (T ₃ ), tiroksina (T ₄ ), hipofizno ščitnico stimulirajočega hormona (TSH). Ugotovljeno je bilo, da je subklinično hipotiroidizem odkrili pri 38-45% bolnikov s pljučno tuberkulozo in najpogosteje je diagnosticiran z diseminirano in fibroserozne kavernozni oblike postopka. Pod temi enake oblike večina drastično znižana koncentracija obeh T ₃ in T ₄, in pride neravnovesja teh hormonov v obliki višanje razmerja T ₄ / T _ih.

Adrenokortikalne funkcija ovrednoti raven kortizola v krvnem serumu in endokrino funkcijo trebušne slinavke - koncentracija imuno-reaktivnega insulina. V akutni fazi nalezljive bolezni se poveča potreba po endogenem kortizolu in insulinu. Hiperinsulinemija tudi priča o inzulinski rezistenci telesnih tkiv, kar je značilno za vsak aktivni vnetni proces, še posebej specifičen. Določanje glyukokortiko idnoy-nadledvične funkcije z aktivno pljučno tuberkulozo pokaže prisotnost Cushingov pri večini bolnikov. Normalne vrednosti koncentracije kortizola v krvi pri bolniku z nalezljivo vnetje v akutnem obdobju je treba obravnavati kot relativnega neuspeha glukokortikoidi funkcije skorje nadledvične žleze, ki lahko služijo kot podlaga za držanje dozah ustrezno nadomestno terapijo glukokortikoidi.

Skoraj se tretjina bolnikov s pljučno tuberkulozo lahko dokaže, da je raven Ince-lin precej nizko in blizu spodnje meje normale, medtem ko so 13-20% doživela velik hyperinsulinism. Tako relativni hipo- in hyperinsulinizem so visoki dejavniki tveganja za razvoj kršitev presnove ogljikovih hidratov v različnih stopnjah. Te spremembe funkcijske aktivnosti celic B trebušne slinavke zahtevajo redno spremljanje glikemije pri bolnikih s tuberkulozo in pravočasno preprečevanje diabetesa mellitusa. Poleg tega. To služi kot dodatna utemeljitev za primernost uporabe fizioloških odmerkov insulina pri kompleksnem zdravljenju tuberkuloze.

Na splošno nižje ravni ščitničnih hormonov in njihovih neravnovesjem hiperkortizolemija in hyperinsulinism največjim mreže pri bolnikih s hudim potekom tuberkulozo postopka, z obsežnimi poškodbami pljuč in hudih simptomov tuberkuloze zastrupitve.

Mikrobiološka diagnoza tuberkuloze

Mikrobiološke študije so potrebne pri prepoznavanju bolnikov s tuberkulozo, preverjanju diagnoze, spremljanju in popravljanju kemoterapije, vrednotenju rezultatov zdravljenja, z drugimi besedami, od trenutka, ko je bolnik registriran s tuberkulozo, preden ga vzamemo.

Vsi epidemiološki programi in projekti temeljijo na oceni števila bakterijskih izločevalcev, ki je ni mogoče storiti brez uporabe laboratorijskih metod za odkrivanje tuberkuloze mikobakterij. V raziskavi tako imenovane neorganizirane populacije odstotek bakterijskih napadalcev doseže 70 ali več, zaradi česar so laboratorijske metode dovolj učinkovito sredstvo za identifikacijo bolnikov s tuberkulozo med to populacijsko skupino.

Tradicionalne mikrobiološke metode za diagnosticiranje tuberkuloze so bakterioskopske in kulture. Sodobne metode obravnavajo gojenje mikobakterijske tuberkuloze v avtomatiziranih sistemih, nastavitev PCR. Vseeno pa vse te metode nujno kombinirajo s klasičnimi bakteriološkimi metodami.

Zbiranje diagnostičnega gradiva

Učinkovitost laboratorijskih študij je v veliki meri odvisna od kakovosti diagnostičnega materiala. Skladnost s pravili za zbiranje, shranjevanje in prevoz diagnostičnih materialov ter natančno izvajanje algoritma za oceno bolnika neposredno vplivajo na izid in zagotavljajo biološko varnost.

Za testiranje na tuberkulozo se uporabljajo različni materiali. Zaradi dejstva, da TB logkih- najpogostejša oblika tuberkulozo lezije, osnovni material za raziskave preuči sputum in druge vrste ločljivo tracheobronchial: zgornjih dihalnih izločkov dihal, dobljene po aerosolno inhalacijo: bronhialne sprane; bronhoalveolarni izpirki; material, pridobljen z bronhoskopijo in intrapulmonarno transtrahealni biopsije iz bronhialnega aspirati, grla brisi, izcedkov iz rane in brisom al.

Učinkovitost raziskav se poveča, če se izvede nadzorovano zbiranje materiala od pacienta. V ta namen je dodeljena posebej opremljena soba ali kupljena posebna kabina. Zbiranje gradiva je nevaren postopek, zato je potrebno zbirati gradivo za raziskave, pri tem pa upoštevati pravila okužbe.

Material za testiranje na mikobakterijski tuberkulozi se zbira v sterilnih steklenicah s tesno privijačenimi pokrovi, da se prepreči kontaminacija okolja in zaščita zbranega materiala pred kontaminacijo.

Viale za zbiranje diagnostičnega materiala morajo izpolnjevati naslednje zahteve:

• morajo biti izdelani iz materiala, odpornega na udarce;
• naj se med avtoklavom zlahka stopi;
• biti dovolj volumna (40-50 ml):
• imajo široko odprtino za zbiranje izpljunka (premer ne manj kot 30 mm);
• biti enostaven za rokovanje, prozoren ali prosojen, tako da lahko ocenite količino in kakovost vzorca, odvzetega brez odpiranja pokrova.

Za doseganje optimalnih rezultatov raziskav je treba upoštevati naslednje pogoje:

• Zbrati material pred začetkom kemoterapije;
• material za študijo je treba zbirati pred jutranjim vnosom hrane in zdravil;
• za raziskovanje je zaželeno zbrati vsaj 3 vzorce jutranjih flegmov. Zbirajte sputum 3 dni zapored;
• zbrani material mora biti dostavljen v laboratorij čim prej:
• če je takoj nemogoče dostaviti material v laboratorij, se hrani v hladilniku pri temperaturi zraka 4 ° C za največ 48 ur;
• Pri transportu materiala je potrebno skrbno spremljati celovitost vial.

Pravilno zbrani izpljun je sluz ali mukopurulent. Optimalna prostornina testiranega izpljunka je 3-5 ml.

Sputum se zbere pod nadzorom zdravstvenega delavca. Osebe, odgovorne za zbiranje mleka, morajo slediti izvajanju določenih pravil:

• je treba pacientu razložiti namen študije in potrebo po kašlju, ne pa slinu ali nazofaringeusu sluzu, temveč vsebini globokega dihalnega trakta. To je mogoče doseči kot posledica produktivnega kašlja, ki se pojavi po več (2-3) globokih vdihih. Prav tako je treba pacientu opozoriti, da mora sprati usta s kuhano vodo, da se odstrani glavni del mikroflore, ki raste v ustni votlini in ostanki hrane, ki ovirajo preiskavo sputuma;
• medicinski delavec, ki sodeluje pri zbiranju sputuma, mora poleg kopalniškega in klobučevine nositi masko, gumijaste rokavice in gumijasti predpasnik;
• stoji za bolnika, je priporočljivo, da stekleničko čim bližje k ustnicam in mu takoj ločiti izpljunku izkašljevanje, kot je, zato je treba zagotoviti, da se zračni tok usmerjen stran od izvajalca zdravstvenih storitev:
• Po zaključku zbiranja sputuma mora zdravstveni delavec skrbno zaprati vialo s pokrovom in oceniti količino in kakovost zbranega izpljunka. Potem je steklenica označena in postavljena v posebni bix za prevoz v laboratorij.

Ali uporabiti razdražljiv vdihavanje z opremo, nameščeno v prostoru za zbiranje - Če se pri bolniku pred in zgodaj zjutraj na dan odvzema materiala, ki je potreben, da mu je izkašljevanje :. Izvleček korenine marshmallow (mukaltin), bromheksin, ambroksola, itd ne proizvajajo sluz, noč flegm. Zbrani material na ta način ni predmet ohranjanja in ga je treba pregledati na dan zbiranja. Da bi se izognili njegovemu "izločanju" v laboratoriju v smeri, bi morala biti posebna oznaka.

Če se na tem objektu ne izvedejo mikrobiološke raziskave, je treba odvzeti diagnostični material centralno dostaviti v laboratorij, pod pogojem, da se material ohranja v intervalih med dobavo v hladilniku ali z uporabo konzervansov. V laboratorijih dostavite material v transportne škatle, ki jih je mogoče enostavno razkužiti. Vsak vzorec mora biti opremljen z ustrezno nalepko, celotno serijo pa mora biti napolnjena s priloženim obrazcem.

[29], [30], [31],

Načini in pogostnost pregleda bolnikov

Na začetnem, tako imenovanem diagnostičnem pregledu bolnika za tuberkulozo je treba pregledati vsaj 3 delce izločanja za 2 ali 3 dni. Zbranih pod nadzorom medicinskega osebja, kar poveča učinkovitost mikroskopije.

Primarni pregled za tuberkulozo bi morali izvajati vse medicinske diagnostične ustanove zdravstvenega sistema. V zadnjem času so bili na podlagi kliničnih diagnostičnih laboratorijev organizirani tako imenovani centri mikroskopije, ki so opremljeni s sodobnimi mikroskopi in opremo za epidemično varnost, da bi izboljšali učinkovitost začetnega pregleda.

V objektih za preprečevanje tuberkuloze se uporablja presejalni test, ki vključuje trikratne preiskave izpljunka ali drugega diagnostičnega materiala vsaj 3-krat. Med zdravljenjem se mikrobiološke študije redno izvajajo vsaj enkrat mesečno med intenzivno fazo kemoterapije. Pri prehodu v fazo zdravljenja se študije izvajajo manj pogosto - s presledkom 2-3 mesecev, medtem ko se pogostnost študije zmanjša na dve.

Značilnosti zbiranja diagnostičnega gradiva za zunajpljučno tuberkulozo

Funkcija patološkega materiala z Zunajpljučna oblike TB - Mycobacterium tuberculosis nizko koncentracijo v njem, kar zahteva bolj občutljive metode mikrobioloških študij, predvsem sejalne tehnike mediju.

S tuberkulozo genitourinarnega sistema je urina najbolj dostopen študijski material. Zbiranje urina mora opraviti posebej usposobljena medicinska sestra.

Zunanje genitalije speremo z vodo z milom ali šibko raztopino kalijevega permanganata. Zunanje odprtine sečnice skrbno obdelujejo. V sterilni viali se zbira povprečen del jutranjega urina: pri moških, seveda pri ženskah, z uporabo katetra. Urina iz ledvičnega medenina se zbere v sterilnih ceveh z kateterizacijo enega ali dveh ledvic, v zadnjem primeru - nujno ločeno od vsake ledvice. Majhno količino tega urina centrifugiramo, sediment preiskujemo.

Pri moških, spermo, punctate testes, se skrivnost prostate izpostavlja centrifugiranju, da dobimo oborino. S kakršno koli lokalizacijo določenega procesa v spolovilnem območju pri moških lahko masaža prostate spodbudi izločanje izločkov, ki vsebujejo mikobakterijsko tuberkulozo.

Menstrualna kri pri ženskah se zbira s sesanjem ali z uporabo kapice Kafka. Dobljeni material se osvobodi rdečih krvnih celic, ga pere z destilirano vodo in centrifugira. Oborina se preučuje.

Dodelitve iz materničnega kanala v maternici so zbrane v nekaterih kapsulah ali kapici, kar pomeni, da je zaželeno kopičiti 1-2 ml patološkega materiala.

Material, pridobljen iz operativnih posegov na ledvice, genitalije. Z biopsijami, strganjem iz endometrija, homogeniziramo. Da bi to naredili, se postavi v sterilno malto in temeljito zdrobijo s sterilnimi škarjami. V ta gošči dodamo sterilno mivke v količini, ki je enaka njegovo težo, nato pa dolili 0,5-1.0 ml izotonične raztopine natrijevega klorida in vse trituriramo, dokler pastastega maso z dodatkom izotonično raztopino natrijevega klorida (4-5 ml). Nato se masa pusti, da se usede 1-1,5 minut, nadnacionalno preiskuje.

Tuberkuloza kosti in sklepov. Pankat (gnoj abscesov), pridobljen s sterilno brizgo, se postavi v sterilne posode in takoj dostavi v laboratorij. Sterilna pipeta, predhodno navlažena s sterilno izotonično raztopino natrijevega klorida, vzamemo 2-5 ml gnojila, jo prenesemo v steklenico kroglic in dodamo še 2-3 ml izotonične raztopine natrijevega klorida. Steklenička je zaprta z pluto in stresana v joker-aparatu 8-10 minut. Raziskujemo homogenizirano suspenzijo.

Pri fistuloznih oblikah osteoartikularne tuberkuloze se vzame gnoj iz fistule. Obsežni izpust se zbira neposredno v epruveto. V primerih pusto pyorrhea fistule izperemo s sterilno fiziološko raztopino natrijevega klorida in izpiralne zberemo v epruveti, ali kos tampona, prepojen z gnoj poslan za analizo.

Kirurški material, dobljen med operacijo na kosti in sklepov je lahko sestavljena iz gnojnimi-nekrotične mas, granulacij, brazgotine, kostnega tkiva sinovialne membrane in drugih substratov. Njegovo zdravljenje se izvaja, tako kot pri tuberkulozi ledvic.

Mikrobiološka študija sinovialne tekočine v 3-odstotni raztopini natrijevega citrata (razmerje 1: 1) za preprečevanje koagulacije opravimo takoj po punkciji.

Tuberkuloza bezgavk. Prav tako se preučuje gnoj, ki se pridobiva med prebadanjem bezgavk. Kot gnoj abscesov. Pregledujemo tkiva bezgavk, pridobljenih med kirurškimi posegi, biopsijami, kot pri drugih oblikah tuberkuloze.

Študija mase blata na mikobakterijski tuberkulozi je izredno redka zaradi skoraj popolnega pomanjkanja pozitivnih rezultatov.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium mikroskopija

Mikroskopija na sputumu je sorazmerno hitra, enostavna in poceni metoda, ki jo je treba v vseh primerih uporabljati s sumom na tuberkulozo. Poleg tega se ta študija izvaja za oceno učinkovitosti kemoterapije in za ugotavljanje okrevanja ali neuspešnega zdravljenja, če ni nobenega kulture testa.

Uporabljata se dve metodi mikroskopskega pregleda:

• metodo neposredne mikroskopije, kadar se brisanje pripravi neposredno iz diagnostičnega materiala;
• metoda mikroskopije sedimenta, pripravljenega iz obdelanega materiala za dekontaminacijo za kulturo.

Prva metoda se uporablja v tistih laboratorijih, kjer se izvajajo le mikroskopske študije (klinični in diagnostični laboratoriji splošne medicinske mreže).

Najboljše rezultate mikroskopskega pregleda dobimo s koncentriranjem diagnostičnega materiala (na primer s centrifugiranjem).

Za odkrivanje mikobakterijske tuberkuloze z verjetnostjo 50% pri mikroskopiji mora 1 ml spatuma vsebovati več kot 5000 mikrobnih celic. Sputum bolnikov s pljučnimi oblikami tuberkuloze običajno vsebuje znatno količino kislih hitro bakterij, kar jim omogoča zanesljivo odkrivanje z bakterioskopijo. Diagnostično občutljivost te metode je mogoče izboljšati s preučevanjem več vzorcev izpljunka pri enem bolniku. Negativen rezultat bakterioskopskega pregleda ne izključuje diagnoze tuberkuloze, saj pljuča nekaterih pacientov vsebuje manj mikobakterij, kot jih lahko odkrije z mikroskopijo. Slaba priprava raztrganine na sputumu lahko povzroči tudi negativni rezultat bakterioskopskega pregleda.

Najpogostejša metoda za odkrivanje acidobioloških mikobakterij v brisu je barva po Tsiol-Nelsen. Metoda temelji na prodoru karbolnega fuksina v mikrobno celico skozi membrano, ki vključuje voski-lipidni sloj, hkrati pa segrevanje in močno jedkanje fenola. Naknadno razbarvanje mrčesa s 25% raztopino žveplove kisline ali 3% klorovodikove kisline povzroči razbarvanje vseh ne-kisle-hitrih struktur. Obarvani elementi mrčesa so obarvani z 0,3% raztopino metilen modre barve. Mycobacteria ne zaznavajo običajnih anilinskih barvil, zaradi katerih so kislo-hitro mikobakterije obarvane rdeče-rdeče in drugi mikrobi in celični elementi - v modri barvi.

Za brisom s Ziehl-Nelsenu obarvanih uporabo svetlobe binokularni mikroskop z oljem potopno leče (90- ali 100-kratno povečanje) in okular do 7- ali 10-kratno povečavo. Raziščite 100 vidnih polj, kar je dovolj za identifikacijo posameznih mikobakterij v razmazu. Če je rezultat takšne študije negativen, je za potrditev priporočljivo, da si ogledate še 200 vidnih področij. Zapišite rezultate, pri čemer navedite število odkritih kislih hitrih bacilijev (KUM).

Poleg te tehnike se za luminescentno mikroskopijo uporabljajo barvni fluorohromi, kar omogoča doseganje najboljših rezultatov. Uporaba te metode poveča učinkovitost mikroskopije za 10-15%. Pri zdravljenju mikobakterij z luminescentnimi barvili (auramin, rhodamin itd.) Se te snovi tudi vežejo na voska podobne strukture mikrobne celice. Ko obsevajo barvne celice z vznemirljivim svetlobnim virom (določenim spektrom ultravijoličnega sevanja), začnejo žareči z oranžno ali svetlo rdečo svetlobo na črni ali temno zeleni podlagi. Zaradi visoke svetlosti in kontrasta vidne slike se lahko celotno povečanje mikroskopa zmanjša 4-10 krat, se vidno polje razširi in čas gledanja priprave se zmanjša. Poleg tega, zaradi veliko večje globine polja, lahko povečate udobje študije.

Ko se fluorescenčna mikroskopija uporablja za ogled istega območja, se raztrgajo znatno manj časa kot pri lahki mikroskopiji obarvanja Tsiol-Nelsen. Če za delovni dan mikroskop pregleda približno 20-25 takšnih brisov, potem s pomočjo fluorescenčne mikroskopije lahko istočasno preišče več kot 60-80 vzorcev. Izkušeni mikroskopi vedo, da je obarvanje celic z mešanico avramina in rhodamina na nek način specifično za kisle bakterije, ki v tem primeru izgledajo kot zlate palice. Sapropiti so naslikani v zelenkasti barvi.

Druga pomembna prednost metodo fluorescenčne mikroskopije - sposobnost za odkrivanje spremenjeno Mycobacterium, izgubljena pod vplivom neugodnih dejavnikov, vključno z intenzivno kemoterapijo, kislotousotoychivosti lastnine in je ne zazna v zvezi s tem barvanjem Ziehl-Nelsenu.

Slabosti metode fluorescenčne mikroskopije vključujejo sorazmerno visoke stroške mikroskopa in njegovega delovanja. Vendar pa v centraliziranih ali drugih velikih laboratorijih, kjer obremenitev presega normo treh laboratorijskih tehnikov, ki delajo s tremi konvencionalnimi mikroskopi, je namesto enega fluorescenćnega mikroskopa ceneje.

Bakterioskopske metode imajo precej visoko specifičnost (89-100%). O rezultatih setve nedvoumno potrjuje približno 97% pozitivnih rezultatov, pridobljenih s katero koli metodo mikroskopije.

Opozoriti je treba, da pri mikroskopskem pregledu patološkega materiala ni mogoče določiti vrst, ki spadajo v opredeljene mikobakterije s hitrimi kislinami. Postopek mikroskopija omogoča, da smo dobili mnenje le na prisotnosti ali odsotnosti kisline v pripravi mikroorganizmov, ki lahko pojasnimo z obstojem v naravi velikega števila morfološko podobna tuberkulozne mikobakterije kompleksnih nontubercular kisline odpornih mikroorganizmov.

Rezultati mikroskopije so ocenjeni v semiquantitative enotah.

Da bi lahko primerjali rezultate različnih metod mikroskopije, se uvedejo empirični koeficienti. Na primer, za primerjavo rezultatov brisom obarvanih s fluorescenčnimi barvili, raziskave podatki svetlo mikroskop (1000 kratni povečavi), je treba razdeliti število acido-bacile, ki ga predlaga fluorescenčnem mikroskopu zazna, ustrezen koeficient pri 250-kratni povečavi - do 10, 450-krat - na 4, s 630-krat - na 2.

Značilnosti mikroskopije za zunajcelično tuberkulozo

Izvede se neposredna mikroskopija in mikroskopija brisov, pripravljenih po obogatitvi, čemur sledijo barvila Tsiol-Nelsen ali luminiscentna barvila. Neposredna mikroskopija brisov ni učinkovita zaradi nizke koncentracije mikobakterij v materialu, zato je bolj smiselno uporabljati metode obogatitve. Najbolj učinkovit je centrifugiranje. Če biološki material je viskozna, se centrifugiranje uporabi s simultanim utekočinjanje in homogenizacijo materiala, ki se izvaja z uporabo visoke hitrosti centrifuge s centrifugalno silo 3000 g in hipoklorita rešitve. Druge metode obogatitve, kot je mikro flotacija, se trenutno ne uporabljajo zaradi nastajanja biološko nevarnih aerosolov.

[37], [38],

Kulturna metoda diagnoze tuberkuloze

Metoda setve ali metoda kulture je bolj občutljiva kot mikroboskopa in ima več prednosti pred slednjo. Omogoča odkrivanje več ducatov sposobnih mikobakterij v testnem materialu in ima veliko diagnostično vrednost. To je še posebej pomembno pri preučevanju gradiva pri novorojenčkih ali zdravljenih bolnikih, ki sproščajo majhno količino mikobakterij.

V primerjavi z mikroskopijo raziskave na področju kulture omogočajo povečanje števila bolnikov s tuberkulozo, ki so jih diagnosticirali več kot 15-25%, ter preverjanje tuberkuloze v prejšnjih fazah, ko je bolezen še vedno mogoče zdraviti. Zelo pomembna prednost preskusa kulture je možnost pridobitve kulture vzbujanja, ki jo je mogoče identificirati in preučiti glede občutljivosti na zdravilo, virulence in drugih bioloških lastnosti.

Pomanjkljivosti načinov gojenja vključujejo njihovo trajanje (čakalni čas materialov doseže 10 tednov). Višji stroški, zapletenost obdelave diagnostičnega gradiva.

Načela predporodnega zdravljenja diagnostičnega materiala

Konvencionalne mikrobiološke metode ni mogoče uporabiti pri izvajanju študij o tuberkulozi. To je posledica dejstva. Da miokobakterija tuberkuloza raste zelo počasi, in večina kliničnih vzorcev vsebuje hitro rastoče gnojne in gnusne mikroorganizme, glive. Njihova hitra rast na bogatih hranilnih sredstvih posega v razvoj mikobakterij in ne omogoča izoliranja povzročitelja tuberkuloze, zato je treba diagnostični material pred sejanjem predhodno predati. Poleg tega miokobakterije, sproščene iz pacientovih dihalnih poti, običajno obkrožajo velika količina sluzi, zaradi česar je težko koncentrirati. V zvezi s tem, pred sajenjem sputuma in drugih podobnih materialov, njihovo utekočinjanje je potrebna dekontaminacija.

Vsi detergenti in dekontaminini imajo bolj ali manj izrazit toksični učinek na mikobakterije. Zaradi predelave lahko umre do 90% mikobakterij. Da bi ohranili dovolj prebivalstva mikobakterijske, varčujejo potrebo po uporabi tehnike obdelave, ki omogočajo, na eni strani, za zatiranje hitro rastoče piogeni bakterije in Trud, in na drugi strani - da se ohrani rentabilnost prisotne v materialu mikobakterije.

Glede na material, njegovo stopnjo homogenosti in onesnaževanje za predobdelavo uporabo različnih Dekontaminacijsko: izpljunku - 4% -nega natrijevega luga, raztopine trohzameschonnogo natrijevega fosfata 10%, benzalkonijev klorid, trinatrijev fosfat, NALC-NaOH (N-acetil-L-cistein natrijev hidroksid) s končno koncentracijo 1% NaOH, v urinu in drugih tekočih materialov - raztopini žveplove kisline 3%, pri kontaminiranih vzorcev, materialov, ki vsebujejo maščobe - raztopine oksalne kisline v 5%. Poleg tega se v nekaterih primerih uporabljajo encimi, površinsko aktivne snovi (detergenti). Uporaba Tween detergenti in nekaterih drugih mikobakterijski smrt spremlja manj celic (40-50% preživetje). Vendar pa se lahko uporabljajo samo za tekoče materiale. Največja distribucija na svetu je bila NALC-NaOH. Proizvedena v kompletih. Ta metoda omogoča dodelitev več kot 85% populacije mikobakterijskih celic. Dekontaminacijo tkanesoderzhaschih trdne snovi težje uganiti, ker je stopnja disperzije materiala med homogenizacijo depresijo. Na primer, je biopsija čiščenju bezgavk pogosto spremlja povečano pogostnost okužbe s tujih rastlinskih vrst. V tem primeru se lahko uporabi 1% etonija.

Homogeni material homogeniziramo s steklenimi kroglicami v prisotnosti dekontaminantov. Tekoči materiali se predhodno centrifugirajo in obdelajo le oborine.

Sejalne in inkubacijske tehnike

Po predhodni obdelavi se material centrifugira, s čimer se precipitirajo mikobakterije in povečajo njihova vsebnost v sedimentu ("bogatenje blata"). Nastalo oborino nevtraliziramo in inokuliraramo (inokulira) z gosto hranilno snovjo ali cevmi s tekočimi (semilastnimi) mediji. Od ostanka sedimentov se pripravijo brisine za mikroskopsko preiskavo. Tehnika sejanja mora preprečiti navzkrižno kontaminacijo diagnostičnega materiala.

Za zanesljivo klinično interpretacijo rezultatov mikrobiološke študije je treba upoštevati naslednje pravilo: mikroskopske in kulturne študije je treba izvajati vzporedno z istim vzorcem diagnostičnega materiala.

Inokulirane cevi namestite v termostat pri 37 ^° C 2 dni v vodoravni legi. To zagotavlja bolj enakomerno absorpcijo materiala v gojišče. Po dveh dneh se cevi prenesejo v navpični položaj in hermetično zapirajo z gumijastimi ali silikonskimi čepi, da se prepreči sušenje posejanega medija.

Pridelki so inkubirali pri 37 ^o C za 10-12 tednih redne tedenske ogled. Za vsak predogled se zapisujejo naslednji parametri:

• obdobje, vizualno opazovano od dneva setve rasti;
• stopnja rasti (število CFU);
• onesnaženje pridelka z zunanjo mikrobno floro ali glivicami (take cevi se odstranijo);
• pomanjkanje vidne rasti. Cevi ostanejo v termostatu do naslednjega ogleda.

Hranljivi mediji

Za gojenje mikobakterij se uporabljajo različni hranilni mediji; gosto, polteklenično, tekoče. Vendar noben od znanih hranilnih snovi nima lastnosti, ki zagotavljajo rast vseh mikobakterijskih celic. V povezavi s tem je priporočljivo, da se hkrati uporabita 2-3 hranilna sredstva različnih sestavin, da se poveča učinkovitost.

Svetovna zdravstvena organizacija priporoča okolje Levenstein-Jensen kot standardno sredstvo za primarno izolacijo povzročitelja tuberkuloze in za določanje njegove občutljivosti na zdravila. To je gosto okolje jajc, na katerem se rast mikobakterij doseže 20. In 25. Dan po sejanju bakterioskopsko pozitivnega materiala. Pridelki bakterioskopsko negativnega materiala zahtevajo daljšo inkubacijsko obdobje (do 10-12 tednov).

V naši državi predlagani E.R. Finn jajca okolje Finn-II. Razlikuje se po tem, da namesto L-asparagina uporablja natrijev glutamat, ki sproži druge načine sintetiziranja aminokislin mikobakterij. Na tem mediju se pojavlja rahlo nekoliko zgodaj, pogostost dodelitve mikobakterij pa je 6-8% višja kot v mediju Lowenstein-Jensen.

Za izboljšanje učinkovitosti bakteriološke diagnoze ekstrapulmonalne tuberkuloze je priporočljivo vključiti modificirane medije Finn-II v kompleks hranilnih snovi. Če želite pospešiti rast, se 0,05% natrijevega tioglikolata, ki zmanjša koncentracijo kisika, dodatno doda na hranilni medij Finn-II. Za zaščito encimskih sistemov mikobakterij iz toksičnih produktov peroksidacije lipidov v hranilnem mediju Finn-II se v koncentraciji 0,001 μg / ml doda antioksidantni α-tokoferol acetat. Sejanje diagnostičnega materiala poteka po standardnem postopku.

V ruskih laboratorijih proti tuberkulozi se uporabljajo tudi druge modifikacije gostih hranilnih snovi; predlagal G.G. Mordovski hranilni medij "New", ki ga je razvil V.A. Anikalni hranilni mediji A-6 in A-9 itd.

Glede na to, da je v postopku kemoterapije poškodbe različnih presnovnih sistemov mikrobnih celic, nekateri mikobakterijska populacija je izgubil možnost, da se običajno razvije v konvencionalnih medijih hranil in zahteva osmotsko uravnotežen (ali pol-tekočina) ustrezen medij.

Ocenjevanje in beleženje rezultatov sejanja diagnostičnega materiala

Nekateri sevi in vrste mikobakterij počasi rastejo, rast pa se lahko pojavi tudi do 90. Dneva. Število takšnih poljščin je majhno, vendar to omogoča, da se pridelki v termostatu zdržijo 2,5-3 mesece.

Virulentne kulture mycobacterium tuberculosis navadno rastejo v gostih jajčnih okoljih v obliki kolonij R oblike različnih velikosti in vrst. Kolonije suhe, nagubane, slonokoščene, rahlo pigmentirane. V drugih medijih je kolonija mikobakterijske tuberkuloze lahko vlažnejša. Po poteku kemoterapije ali med zdravljenjem lahko razdelimo gladke kolonije z vlažno rastjo (S-obrazci).

Pri izolaciji poljščin se za ločevanje mikobakterijske tuberkuloze od mikobakterij, ki niso tuberkuloze, in saprofitov, odpornih na kisline, uporablja poseben študij.

Pozitiven odziv je dan po obveznem mikroskopskem pregledu obarvanega Tsiol-Nelsenove brisev iz vzgojenih kolonij. V primeru rasti mikobakterij v brisih najdemo svetlo rdeče palice, ki ležijo posamično ali v skupinah, ki tvorijo grozdje v obliki klobučevine ali pletenice. Pri mladih kultur, zlasti ločene med dolgotrajno zdravljenje bolnikov s kemoterapijo, mikobakterije razlikujejo izraženega polimorfizem, dokler prisotnosti droga v obliki, skupaj s kratkimi, skoraj kokoidne ali podolgovatih različic, ki so podobni micelij.

Hitrost rasti mikobakterij je indicirana z naslednjo shemo: (+) - 1-20 cfu in vitro (skromna bakterijska izločanja); (++) - 20-100 CFU in vitro (zmerno bakterijsko izločanje); (+++) -> 100 CFU in vitro (bogato bakterijsko izločanje). Pri laboratorijski diagnostiki tuberkuloze ni dovolj odgovoriti, ali je mikobakterija odkrita z eno ali drugo metodo. Podrobno razumeti obseg in naravo populacije mikobakterij, njegovo sestavo in lastnosti. Te podatke nam omogočajo, da pravilno razlagamo stanje procesa, načrtujemo taktiko in pravočasno popravimo zdravljenje.

V zadnjih letih smo predlagali pospešitev rasti mikobakterij, hranilnih substratov na osnovi agarja z različnimi rastnimi aditivi in uporabo posebne mešanice plinov. Da bi pridobili rast mikobakterij na teh medijih, med gojenjem nastane atmosfera z visoko vsebnostjo ogljikovega dioksida (4-7%). V ta namen se uporabljajo posebni CO ₂ -inubatorji. Vendar pa so najbolj razviti avtomatizirani sistemi za gojenje mikobakterij: MGIT-BACTEC-960 in MB / Bact.

En tak sistem - MGIT sistem (rast mikobakterije navedbo cev), ki se nanaša na razvoj visoke tehnologije in je namenjen za hitro bakteriološko diagnostiko tuberkuloze in Mycobacterium dovzetnost za prvo linijo zdravil in nekatera zdravila druge izbire. MGIT se osredotoča na njegovo uporabo kot del naprave VASTES-960. Mikroorganizmi se gojijo v posebnih ceveh s tekočim hranilnim sredstvom, ki temelji na modificiranem središču Middlebrook-7H9. Za spodbujanje rasti mikobakterij in zatiranje rasti tujih mikroflora se uporablja MGIT dodatek za rast in mešanica antibiotikov PANTA.

Rast mikroorganizmov je optično zapisana. Temelji na fluorescenci, ki se pojavi, ko kisik porabijo mikobakterije med rastjo. Na dnu posebne epruvete najdemo fluorohromno barvilo, ki je odvisno od kisika, in prekrito s plastjo silikona. Reprodukcija mikobakterije vodi do zmanjšanja količine kisika v cevi in zmanjša koncentracija, ki povzroči povečanje fluorescence, ki postane vidna pod obsevanjem z ultravijolično svetlobo cevi in se samodejno registrira svetlobni Vgradni aparat VASTES-960. Intenzivnost luminescence je zabeležena v enotah rasti (enote za rast GU). Podatki o rasti se zabeležijo v računalniku, kjer jih je mogoče samodejno shraniti. Računalniška analiza krivulj rasti lahko zagotovi informacije o prisotnosti različnih Mycobacterium bazenih, vključno nontubercular, in tudi pomaga oceniti lastnosti rasti mikobakterije.

Zaradi uvedbe takih sistemov se je čas za rast mikobakterij znatno zmanjšal, v povprečju 11 dni na zdravilih VASTES-960 in 19 dneh na MB / Bact v primerjavi s 33 dnevi na standardnem gostem hranilnem mediju. Treba je opozoriti, da ti sistemi zahtevajo visoko usposobljeno osebje. Sejanje materiala na tekočih medijih nujno spremlja setev na mediju Levenstein-Jensen, ki ima vlogo rezervne kopije v primerih, ko miokobakterija tuberkuloze ne povzroča drugih medijev.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Določanje občutljivosti na zdravila pri mikobakterijah

Določitev spektra in stopnja občutljivosti mikobakterij na zdravila proti tuberkulozi je klinično pomembna, pa tudi za epidemiološko oceno širjenja tuberkuloze z odpornostjo na zdravila. Poleg tega spremljanje odpornosti proti drogam omogoča oceno učinkovitosti programa tuberkuloze kot celote, saj je sestavni kazalnik uspešnosti vseh komponent dejavnosti proti tuberkulozi.

Množnost in čas občutljivosti na zdravila:

• pred začetkom zdravljenja enkrat za določitev strategije in taktike zdravljenja:
• kadar so izolirani iz obolelih kultur iz različnih materialov (sputum, BAL tekočina, urina, eksudati, liker itd.), se preučijo vsi izolirani sevi:
• na koncu intenzivne faze zdravljenja brez klinične in radiološke dinamike:
• če je treba režim zdravljenja spremeniti v naslednjih primerih:
  • odsotnost raztrganja sputuma;
  • ponovna izolacija kulture po negativnem razlitju sputuma;
  • drastično povečanje števila CMU v brisu po prvem upadu. Znano je, da so sevi mikobakterije tuberkuloze, ki so heterogeni v smislu občutljivosti na zdravilo, izolirani iz materiala pri bolniku s tuberkulozo. Občutljivost sevov proti zdravilom proti tuberkulozi se lahko razlikuje glede na obseg zdravil, stopnjo, pogostost in stopnjo pojavnosti odpornosti.

Stopnja odpornosti na zdravila Mycobacterium tuberculosis je bila določena v skladu z določenimi merili, ki so osredotočeni na kliničnem pomenu in stabilnost odvisna od aktivnosti anti-TB zdravila, njegovih farmakokinetiko, koncentracije v lezijo. Največji terapevtski odmerek in tako naprej.

Določanje občutljivosti na zdravila mikobakterij trenutno poteka z mikrobiološkimi metodami:

• Absolutne koncentracije (metoda redčenja na gostih ali tekočih hranilih),
• razsežnosti,
• koeficient odpornosti.

Običajno se odpornost manifestira v obliki vidno opazne rasti kolonij mikobakterijske tuberkuloze, vendar obstajajo metode, ki spodbujajo rast v zgodnjih fazah celične delitve mikobakterij v obliki barvnih reakcij. Te metode skrajšajo čas testa od 3-4 do 2 tedna.

Kot je enotna v Rusiji je bil podaljšan, po metodi odbora WHO kemoterapije absolutnih koncentracij, ki je z metodološkega vidika priporočljivo, je najbolj preprosta, vendar zahteva veliko natančnost in standardizacije laboratorijskih postopkov. Preskus občutljivosti na zdravilo je sestavljen iz nabora epruvet s hranilnim sredstvom, modificiranim z zdravili proti TB. Komplet vsebuje 2-3 cevi z različnimi koncentracijami vsake od drog uporablja, ena kontrolna cevi brez zdravila za okolje in eno cev, ki vsebuje 1000 mcg / ml natrijevega Sali tsilovokislogo ali 500 ug / ml paranitrobenzoynoy kisline nontubercular za odkrivanje rast mikobakterije.

Za pripravo nabora medijev s pripravami se uporablja modificiran Levenstein-Jensenov medij (brez škroba), ki se vlije v bučke. V vsaki bučki se doda poseben volumen ustreznega razredčenja antituberkuloze. Vsebino bučk temeljito pomešamo, vlijemo v cevi in zložimo v nagnjenem položaju 40 minut pri temperaturi 85 ° C. Priporočljivo je, da medij vijačite v električni previjalnik z avtomatskim nadzorom temperature. Sreda z zdravili proti TB

1. Serijo lahko shranite v hladilniku pri 2-4 ° C 1 mesec, pri pripravkih iz druge vrstice pa ne več kot 2 tedna. Skladiščenje medijev s pripravki pri sobni temperaturi je nesprejemljivo. Pri pripravi rešitev anti-tuberkuloznih zdravil se upošteva njihova aktivnost, izračunavanje koncentracije, popravljeno za molekulsko maso nespecifičnega dela pripravka, čistosti itd. Za določanje občutljivosti na zdravilo se uporabljajo samo kemično čiste snovi.

Načelo metode je določiti koncentracijo antituberkuloznega zdravila, ki zavira rast znatnega dela mikobakterijske populacije. Če je to storjeno pravilno, je ta metoda dobra zanesljivost.

Pred preskusom je treba zagotoviti, da izolirana kultura mikobakterijske tuberkuloze nima tuje mikroflore. Iz kulture mikobakterij v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida pripravimo homogeno suspenzijo, ki vsebuje 500 milijonov mikrobnih teles na ml (standardna optična motnost 5 enot). Dobljeno suspenzijo razredčimo z 0,9% raztopino natrijevega klorida (1:10) in dodamo 0,2 ml gošče v vsako epruveto množice medijev za kulturo. Zasejane cevi namestimo v termostat pri 37 ° C in hranimo v vodoravni legi 2-3 dni, tako da je nagnjena površina kultiviranega medija enakomerno cepljena z suspenzijo mikobakterijske tuberkuloze. Cevi nato prenesemo v navpični položaj in inkubiramo 3-4 tedne. Rezultati so zabeleženi po 3-4 tednih.

Ker je čas izločanja iz kliničnega gradiva na hranljivem mediju vsaj 1 do 5 mesecev, se rezultati za določanje občutljivosti na zdravilo s to metodo lahko pridobijo ne prej kot 2 do 2,5 meseca po setvi materiala. To je ena od glavnih pomanjkljivosti metode.

Interpretirajte rezultate določanja občutljivosti za mikobakterije na podlagi določenih meril. V gostih medijih velja, da je kultura občutljiva na koncentracijo zdravila, ki jo vsebuje medij, če število kolonij mikobakterij, vzgojenih na tej cevi z zdravilom, ne presega 20, z obilno rastjo kontrolne cevi brez zdravil. Samo v prisotnosti več kot 20 kolonij je kultura, ki se šteje kot odporna na to koncentracijo. V praksi, ko pridobivanje rasti rezultira v epruvetah blizu 20 cfu. Je treba klinično enoto obvestiti, da je občutljivost ali odpornost v tem primeru mejna, saj včasih lahko razloži mehko dinamiko kliničnih kazalcev.

Pri različnih zdravilih je ugotovljena določena koncentracija, pri kateri je opaziti razmnoževanje kritičnega deleža mikobakterijske populacije. Te koncentracije imenujemo "kritične". Kot merilo stabilnosti se uporablja rast populacije mikobakterij na hranilnem mediju s pripravo pri kritični koncentraciji.

V domačih praksah TB, pri določanju odpornosti na zdravila, niso omejeni na določanje samo kritičnih koncentracij. To je posledica dejstva. Da je razširjena raven opredelitev odpornosti na zdravila omogoča, da zdravnik bolj natančno pozicioniranje taktike kemoterapijo s pomočjo znanja potenciranje delovanje kombinacij drog, prekrižali pričakuje odpor ali uporabljati bolj učinkovito skupino zdravil uporabljajo anti-TB drog.

Metoda absolutne koncentracije je najpreprostejša, vendar je tudi najbolj občutljiva na napake pri izvedbi. Bolj zanesljivejši, zlasti pri določanju občutljivosti za druga zdravila, in skupni zunaj Rusije, je metoda sorazmernosti. Upošteva pomanjkljivosti metode absolutnih koncentracij, toda pri izvedbi je bolj težko.

Metoda je zelo podobna metodi absolutne koncentracije. Priprava epruvet z zdravili poteka na enak način. Kot v metodi absolutne koncentracije. Vendar pa se odmerek semena suspenzije mikobakterijske tuberkuloze zmanjša za faktor 10. Ki odpravlja pogostost spontane odpornosti nekaterih sevov mikobakterijske tuberkuloze na zdravila, kot sta Etambutol, protionamid, kapreomicin. Kot kontrolo se uporabljajo dve ali tri cevke z odmerkom semena, enakim v epruvetah, zaporedno razredčenih 10 in 100-krat. Kriterij stabilnosti je delež vizualno opazne rasti mikobakterijske tuberkuloze. Za zdravila iz prve serije je kriterij stabilnosti presežek rasti 1% začetne populacije, za zdravila iz druge vrstice - povečanje za 1 ali več kot 10% začetne vrednosti, odvisno od izbrane kritične koncentracije.

Leta 1997 je delovna skupina WHO in Mednarodne zveze za identifikacijo dobra tuberkuloze odpornosti TB drog je prilagoditev teh meril, ki ponuja šteje odporna mikobakterije, ki raste na trdna jajce medijev Lowenstein-Jensen pri naslednjih koncentracijah:

• dihidrostreptomicin - 4 μg / ml;
• izoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Etambutol - 2 μg / ml.

Leta 2001 so bile predlagane kritične koncentracije za naslednja zdravila druge krme (za kritičen delež 1%):

• kapreomicin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamicin - 30 μg / ml;
• viomicin - 30 mcg / ml;
• cikloserin 40 μg / ml;
• aminosalicilna kislina - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Rezultate rasti ocenjujemo po predhodnih štirih tednih in po 6 tednih gojenja - kot zadnje.

Za določitev občutljivosti na zdravilo pirazinamid, ki se v sodobni kemoterapiji uporablja za tuberkulozo, priporočamo kritično koncentracijo 200 μg / ml. Vendar pa doslej sploh ni splošno sprejeta metoda za določanje odpornosti zdravila na to zdravilo na trdnem hranilnem mediju, saj se njegova antibakterijska aktivnost kaže samo v kislem mediju (pH 6), ki je tehnično težko vzdrževati. Poleg tega številne klinične kulture mikobakterij tuberkuloze nerado rastejo na jajčnem okolju s kislim okoljem.

Za oceno kakovosti rezultatov testiranja občutljivosti drog z Mycobacterium, priporočamo, da vsako novo serijo srednje LJ nadzor vzporedno določitev občutljivosti standardne muzej seva H37Rv. Poleg tega obstajajo nekatera mikrobiološka merila, ki jih je treba vzdrževati, da bi tehnike omogočile dobro ponovljiv in pravilno interpretiran rezultat. Ti vključujejo sposobnost preživetja kulture mikobakterijske tuberkuloze, pravila za pridobitev homogene suspenzije in suspenzijo, pravila za izbiro kultur mikobakterij tuberkuloze, reprezentativnost izbrane bakterijske mase. Zanesljivost določanja odpornosti na zdravila se zmanjša z izredno malo bakterijskim sproščanjem.

V zadnjem času je bila obetavna metoda za določanje občutljivosti na zdravila z uporabo avtomatiziranih sistemov. Najbolj popoln na tem področju so razvoj, ki temelji na VASTES MGIT-960. V tem primeru se občutljivost za zdravljenje mikobakterije tuberkuloze določi na podlagi spremenjene metode sorazmernosti. V postopku določanja se primerja stopnja rasti mikobakterijske tuberkuloze v kontrolni cevi in epruvetah z zdravili. Za določitev občutljivosti za streptomicin, izoniazid, greben-pitsinu in ethambutola uporabljamo obogatijo dodatke in antibiotikov v kompletu nastavljeno SIRE. Za določanje občutljivosti na pirazinamid uporabite komplet PZA. V teku vzmetenja preskus Mycobacterium tuberculosis inokulirali epruvete z drogami, kot tudi kontrolni epruveti z rekonstituirano suspenzijo 100-krat za vse droge razen pirazinamida, kjer je suspenzija razredčitve 10-krat. Kriterij stabilnosti je indikator rasti mikobakterij 100 GU, če se doseže rast v kontrolni cevi 400 GU (glej "Kulturne metode za izolacijo mikobakterij"). Računanje in interpretacija rezultatov se izvedeta samodejno in jih določi vhodni ali izbrani program.

Kot kritične koncentracije se končne koncentracije uporabljajo v epruveti s tekočim hranilnim medijem. Trenutno so bile razvite kritične koncentracije za zdravila na prvi in drugi liniji. Opozoriti je treba, da se občutljivost tuberkuloze mikobakterij na cikloserin in aminosalicilno kislino določi le na hranilnih hranilih.

Izdelati dela protokol opisani sistem omogoča, da preuči občutljivost drog kot namenjenega kulturi (gosto hranilni medij), in s primarnim Mycobacterium MGIT-rasti in vitro. Slednja možnost občutno zmanjša čas za kulturo, ki vam omogoča, da bi dobili polno rezultate kulture Mycobacterium tuberculosis (vključno z informacijami o občutljivosti drog) po 3 tednih od datuma zbiranja gradiva, medtem ko tradicionalni način je mogoče pridobiti samo 3. Mesec. Sčasoma dobljeni rezultati, ko je pacient v intenzivni fazi zdravljenja, lahko nadomestijo relativno visoke stroške raziskav.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Diferenciacija mikobakterij

Upoštevajoč, da uporabljeni hranilni mediji niso strogo selektivni. Je poznejša diferenciacija izoliranih mikobakterij priznana kot obvezna. Potreba po diferenciaciji mikobakterij je zaradi številnih značilnosti patoloških procesov rodu povzročajo: drugačnem poteku in izidu tuberkuloze in mycobacteriosis, prisotnost odpornosti naravnih drog nekaterih anti-TB drog.

Znano je, da je primarna identifikacija kompleksa Mycobacterium tuberculosis M. Nontubercular mikobakterij izvedemo z naslednjimi značilnostmi: stopnja rasti na trdnih hranilnem gojišču, potemnitev morfologije kolonij, prisotnost odpornost kisline in temperature optimalno rast.

Na žalost ni nobena laboratorijska metoda za zanesljivo razlikovanje kompleksa M. Tuberculosis mikobakterije iz drugih acido-bacile, vseeno kombinacija zgoraj opisane funkcije z rezultati navedenih spodaj številnih biokemičnih testih omogoča ugotavljanje kompleksa Mycobacterium tuberculosis z M. Verjetno, da bi 95%.

Za razlikovanje Mycobacterium kompleksa M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Mikrotitrsko, M. Canettii in drugi), ki ga počasi rastočega mikobakterije znamke nontubercular osnovne biokemijske teste, ki zaznavajo prisotnosti naslednjih težav:

• sposobnost proizvodnje nikotinske kisline (preskus niacina):
• aktivnost nitratne reduktaze;
• termostabilna katalaza;
• rast medija z natrijevim salicilatom (1 mg / ml).

Kot dodatni testi lahko uporabimo tudi rast na mediju, ki vsebuje 500 μg / ml paranitrobenzojske kisline ali 5% natrijevega klorida.

Številni bakteriološki laboratoriji identificirajo mikroorganizme samo na ravni kompleksa, kar je posledica omejenih zmogljivosti laboratorijev in metodoloških sposobnosti strokovnjakov.

V večini primerov pa v praksi za razlikovanje M. Tuberculosis M. Bovis zadošča naslednji testi: niacin, prisotnosti nitrata, registracijo prisotnosti in pirazinamidazy rastjo v mediju, ki vsebuje 2 ug / ml hidrazidom tiofen-2-karboksilne kisline. Upošteva se, da so mikobakterije kompleksa M. Tuberculosis značilne naslednje vrste znakov:

• počasna rast (več kot 3 tedne);
• temperatura rasti v območju 35-37 ^° C;
• odsotnost pigmentacije (slonovine);
• označena kislina-hitra barva;
• pozitiven test niacina;
• pozitivni test nitratne reduktaze;
• odsotnost termostabilne katalaze (68 ^° C).
• Odsotnost rasti na mediju Levenstein-Jensen, ki vsebuje:
  • 1000 μg / ml natrijevega salicilata,
  • 500 μg / ml paranitrobenzojske kisline,
  • 5% natrijev klorid:
• rast v prisotnosti 1-5 μg / ml tiofen-2-karboksilne kisline.

Pomembnost diferenciacije izoliranih mikobakterij se bo občutno povečala s povečanjem pogostnosti beleženja primerov HIV / AIDS, povezanih s tuberkulozo ali mikobakteriozo. Trenutno ni nobene absolutne gotovosti o pripravljenosti praktičnih regionalnih laboratorijev za pravilno izvajanje tega obsega dela.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Imunološka diagnoza tuberkuloze

Obstajajo številni univerzalni pojavi, zdravila in imunološki testi, ki so bili prvotno ugotovljeni s tuberkulozo ali modelom imunskega odziva na mikobakterije. Ti vključujejo BCG tuberkulina, tako fenomena kožnega DTH (tuberkulina - Pirquet in Mantoux reakcije), pri čemer reakcijo na podkožnem tuberkulinski občutljivi na živalih (Koch pojav). Eno od prvih protiteles proti nalezljivim boleznim je bilo odkrito tudi pri tuberkulozi. Seveda, globlje razumevanje dobrih mehanizmov za tuberkulozo na odpornost in njihov genski nadzor, večja je lahko uporaba imunoloških metod in zdravil, ki vplivajo na imunski sistem, za reševanje praktičnih problemov TB.

Najpomembnejša in težavna praktična težava se trenutno obravnava kot odkrivanje tuberkuloze v procesu množičnega pregleda populacije. Kljub številnim poročilom o "uspehih" (na omejenem materialu) ni primerne imunološke metode (ponovljive v "orožju") in zdravila, ki je primerna za ta namen.

V klinični praksi se zelo pogosto uporabljajo imunološke metode, zlasti serološke študije (določanje antigenov, protiteles) in testiranj, ki spodbujajo tuberkulin.

Najprej med imunološkimi študijami, ki se uporabljajo pri diferencialni diagnozi, obstajajo serološke metode - določanje antigenov in protiteles v različnih okoljih telesa.

Specifičnost protiteles proti tuberkulozi mikobakterij je odvisna od antigenov, uporabljenih pri imunskem testu. Predlaga se precejšnja količina antigenov, od katerih je najprej tuberkulin PPD:

• PAP in drugi kompleksni preparati iz tekočine za kulturo;
• ultrazvočni razkroj;
• Ekstrakt Triton in drugi zapleteni pripravki celičnih sten;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomanan;
• kord-faktor (trehaloza-6,6-di-mikolat);
• fenolni in drugi glikolipidi;
• lipopolisaharidi;
• fibronektin vezavni antigen;
• beljakovine (najpogosteje rekombinantne); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA itd.

Kot rezultat večletnih raziskav ruskih in tujih znanstvenikov so pokazale, osnovne zakonitosti in učinkovitosti protitelesa serološko diagnozo tuberkuloze: bolj kompleksno antigen, višjo občutljivost in nižjo specifičnost testa. Posebnosti v različnih državah razlikuje glede na populacijo tuberkulozo, M. In nontubercular mikobakterije iz izvajanje cepljenja BCG in druge. Pri otrocih, vsebina informacij serodiagnosis je nižja kot pri odraslih. Pri primarni tuberkulozi (pogostejši otroci) je definicija IgM bolj informativna. S sekundarnim IgG. Pri bolnikih, okuženih s HIV, se zmanjša informativna vrednost serodiagnoze pri določanju protiteles. Določanje učinkovitosti protiteles odvisna od števila "kliničnih vidikov": Postopek aktivnost (prisotnost ali odsotnost "izolacija" mikobakterije prisotnosti razpadom votlin, stopnja infiltracije), razširjenost postopka, trajanje delovanja toka.

Občutljivost metode encimskega imunološkega testa (ELISA) je približno 70%. Nezadostna učinkovitost študije je posledica nizke specifičnosti. Prej smo razmislili o možnosti uporabe serološkega pregleda v skupinah z visokim tveganjem, zlasti pri osebah s post-tuberkuloznimi spremembami v pljučih.

Za povečanje specifičnosti ELISA se nadaljujejo iskanja specifičnih antigenov, vključno s tistimi, pridobljenimi z genskim inženiringom: ESAT-6 itd. (Glej zgoraj). Uporaba strogo specifičnih antigenov (38 kDa, ESAT) poveča specifičnost. Vendar občutno zmanjša občutljivost analize. Poleg IFA (preskusnih sistemov eksperimentalni laboratorij. Npr Pathozyme ELISA kit) vsebuje tudi komplete s stransko imunokromatografski filtracijo (Mycodot), kot tudi v drugih podobnih testov (dot-analize na membrani) z vizuelno oceno rezultata testa. Med temi preskusi se analiza opravi 10-30 minut; ne potrebujejo posebne opreme, zahtevajo vizualno oceno rezultatov, ki je povezan z določeno subjektivnostjo. Te metode imajo približno enake občutljivosti in značilnosti specifičnosti (70% in 90-93%) kot tradicionalno ELISA.

Uporaba metod imunske analize ima dodatno vrednost, kot dodatno, upoštevano v kompleksu uporabljenih metod pri diferencialni diagnostiki tuberkuloze, zlasti pri diagnostiki njenih zunajplužnih oblik. Najbolj učinkovita metoda ELISA je v diagnostiki meningitisa tuberkuloze pri študiji cerebrospinalne tekočine. V tem primeru je občutljivost analize 80-85%, specifičnost pa 97-98%. Obstajajo podatki o učinkovitosti odkrivanja protiteles proti tuberkulozi mikobakterij v solzni tekočini pri diagnozi tuberkuloznega uveitisa.

Indukcija sinteze gama interferona in vitro

Gamma interferon (IFN-γ) je specifičen imunski obrambni faktor, ki ga uresničimo z aktiviranjem encimskih sistemov makrofagov. Indukcija sinteze IFN-γ s senzibiliziranimi T-limfociti povzroča njihovo interakcijo z antigeni mikobakterij.

Kot antigeni se uporabljajo kot tuberkulin PPD. In specifične antigene, pridobljeni z genskim inženiringom, zlasti antigene ESAT-6 (zgodnje izločajo antigena, ki ima molekulsko maso 6 kDa) in SRP-10 (filtrat kulture protein 10 kDa). Gensko inženirstvo ali rekombinantni antigeni niso prisotni v celicah cepiva BCG in drugih mikobakterij. Pri uporabi tuberkulina so rezultati indukcijskega testa IFN-γ primerljivi z rezultati tuberkulinskega testa kože (neposredna korelacija). Pri uporabi gensko spremenjenih antigenov so rezultati testa bolj specifični in niso odvisni od predhodnega cepljenja BCG. Pri testiranju cepljenih oseb, ki niso imele stika z okužbo s tuberkulozo, je specifičnost testa 99%. Občutljivost testa pri bolnikih s tuberkulozo se giblje med 81 in 89%.

Testi in diagnostična orodja so bili razviti na osnovi kratkoročno gojenje celic ali mononuklearnih celic celotne krvi, izoliranih iz krvi z antigeni Mycobacterium tuberculosis vitro z naknadnim določanje koncentracije IFN-y ali s štetjem števila limfocitov T, ki sintetizirali IFN-y. Koncentracija interferona sintetiziranega in vitro je bila določena z ELISA z uporabo monoklonskih protiteles vezava IFN-y. Nato s kalibriranjem standardnega IFN-γ določimo njegovo koncentracijo v epruveti ali vdolbinicah plošče.

Pri izvajanju testa Elispot je število T-limocitov, ki sintetizirajo IFN-γ. Se štejejo na površino plošče, obložene s protitelesi proti IFN-γ.

Razvijalci Diagnosticum na IFN-γ vitro z indukcijo, ki se odobri agencija za zdravila in ameriških proizvodov, trdijo, da je test mogoče razlikovati med latentno okužbo TB iz aktivno tuberkulozo. Zato v regijah z visoko stopnjo okužbe test ni neposredno diagnosticiran. Vendar pa se v naši državi lahko uporablja za razlikovanje okužbe s tuberkulozo pri otrocih po alergiji po cepljenju in za oceno stopnje specifične imunosti v postopku zdravljenja.

Trenutno se proučuje domači testni sistem za določanje indukcije sinteze IFN-γ s specifičnimi tuberkuloznimi antigeni in vitro.

Imunski status in potek tuberkuloze, imunokorekcija

V procesu zdravljenja tuberkuloze pri ljudeh pride do sprememb v antigenemiji in stanju imunskega sistema.

Podatki o spremembah eksudatov in tkiv so v veliki meri kontradiktorni. Edina stvar, ki jo je mogoče dobro opozoriti, je, da se pri tuberkuliranih granuloma praviloma odkrije veliko število aktiviranih T-limfocitov.

Smiselno je, da se obdržimo na dveh dodatnih določbah, ki so potrebne za razumevanje vloge imunoloških mehanizmov pri zdravljenju tuberkuloze pri ljudeh:

• Bolniki s aidsom imajo posebno visoko pogostnost odpornosti na več zdravil;
• z večkratno odpornostjo na zdravila (in brez okužbe z virusom HIV) so še posebej pomembne motnje imunosti (zlasti povezava T-celice).

Ko tuberkuloze pogosto uporabljajo različne metode imunomodulacijo: gre predvsem zdravili, ki delujejo predvsem na T-celične imunosti v in sistem mononuklearnih fagocitov (timusa hormonov, izoforon, likopid, polioksidony et al.). Kot tudi cele (oslabljene) mikobakterije in njihove sestavine.

Molekularno-biološka diagnoza tuberkuloze

Za metode molekularne biologije v diagnostiki nalezljivih bolezni vključujejo, v glavnem, metode na osnovi manipulacijo z genomsko materialom bakterijskih in virusnih patogenov za identifikacijo določenega genskega materiala - DNK segmenta, ki imata nukleotidno sekvenco, specifično za določeno vrsto ali patogenih sevov analizirati specifične DNA sekvence genov, ki določajo občutljivost patogena v posebnih zdravilnih snovi, temveč tudi za analizo funkcionalna aktivnost določenih genov patogena. Molekularnih bioloških tehnik splošno so v znanstvenih raziskav in praktično uporabo v diagnostiki in spremljanju različnih bakterijskih in virusnih infekcij po odprtju leta 1985, Carrie Myullisom (dobitnik Nobelove nagrade. 1989) verižni reakciji s polimerazo.

Načela in možnosti metode verižne reakcije polimeraze

PCR omogoča večplastno (množenje) in vitro nukleotidno zaporedje (fragment DNA patogena) več ur v milijonih krat. Reakcija v prisotnosti posameznih verig DNK določa izjemno visoko občutljivost testa.

Nukleotidno zaporedje nekaterih regij v verigi DNA določa genetsko identiteto mikroorganizma, kar pojasnjuje visoko specifičnost PCR.

Vrednost te tehnike za odkrivanje in preiskovanje karakteristik z Mycobacterium tuberculosis bioloških lastnosti mikroorganizma, ki imajo zelo počasno rast povzroča: čas Mycobacterium tuberculosis DNA podvojitvenega ko je gojenje 12-24 ur.

Načelo metode PCR je ojačanje - večkrat, milijonkrat. Množenjem odsekov specifične sekvence DNA v microvolume cevi med cikličnim ponovnim pojavom naslednjih treh reakcijskih stopenj, od katerih vsaka prehaja v drugačni temperaturni režim:

• Stopnja I - denaturacija dvokovske DNA ob segrevanju z razhajanjem njenih verig;
• II. Stopnja - komplementarno vezavo (hibridizacija) primerjev (primarni oligonukleotidi) s končnimi odseki verig strogo specifičnih, izbranih za množenje fragmenta DNA;
• Stopnja III - dokončanje verige DNA fragmentov s pomočjo termostabilne DNA polimeraze.

Za povečanje in vitro moramo imeti molekule matriksne DNA. Štiri vrste deoksinukleozid trifosfati (nukleotidov) vsebuje primerne dušikovih baz: adenin (A), timin (T), gvanina (G), citozin (C); umetno sintetizirani primarni oligonukleotidi (primerki), sestavljeni iz 18-20 baznih parov; termostabilno DNA-polimerazo encim, ki ima temperaturo optimum 68-72 ^o C, in magnezijevih ionov.

Specifičnost PCR je odvisna od izbire DNA fragmenta. V skladu s tem se sintetizirajo bočni semenski oligonukleotidi. Specifičnost hibridizacije in dokončanja verige DNA je posledica načela komplementarnosti naslednjih parov dušikovih baz: adenin-timin, gvanin-citozin.

Za določitev genomske tuberkulozne mikobakterije kompleks najučinkovitejši ciljna ojačevanja pri večini preskusnih sistemov izbranih DNA fragment IS6110, ki je v večini sevov Mycobacterium tuberculosis genoma ima veliko število (10-20) ponovitev, ki omogoča, skupaj s specifičnostjo, visoka občutljivost testa. Istočasno, Mycobacterium sevi tuberkuloze opisan z majhnim številom ponovitev ali brez IS6110 fragmenta.

Izolacija molekul DNA iz biološkega vzorca

Za izvajanje PCR je treba DNA molekule patogena izolirati iz biološkega materiala v minimalnem volumnu z najmanjšo količino nespecifične DNA in različnimi inhibitorji encimske DNA polimeraze.

Priprava vzorcev je treba izvajati pod pogoji, ki preprečujejo navzkrižno kontaminacijo vzorcev s posameznimi molekulami DNA. Za to je potrebna predhodna obdelava prostora z ultravijoličnimi, tlemi in delovnimi površinami miz in aparatov z raztopinami, ki vsebujejo klor. Tudi obvezna uporaba čistih rokavic, epruvete za enkratno uporabo in nasveti za avtomatske pipete.

Za izolacijo DNA Mycobacterium tuberculosis iz kliničnih primerkov (likvor, bronhialna pranje) ne vsebuje veliko število celic, celičnih ostankov, ali njene soli, ki zadostuje, da centrifugira vzorec 3-4 tisoč. RPM, dodajanje raztopini blata 20-30 ul 2% Triton X-100 in segrejemo na 90 ^o C 30 min.

Za mora priprava vzorcih sputuma biti učinkovite utekočinjenje, ki se običajno uporabljajo za 4% raztopine natrijevega hidroksida in N-acetil-L-cisteina (NALC) v količini 50-80 mg na vzorcu - odvisno od viskoznosti vzorca. Raztopino NALC je treba pripraviti ex tempore ali prašek NALC, ki se lahko direktno doda v suhi vzorec. Po utekočinjenju je treba vzorce centrifugirati 15 minut pri 3,5-4,000 obr./min. (3000 g) v 50 ml vialah z vijačnimi kapicami, npr. Pod enakimi pogoji, ki so priporočljivi za pripravo flegmov za predsodke.

Za ekstrakcijo DNA iz metode pelete uporabimo najpogosteje temelji na uporabi raztopine 5-6-molarne gvanidin izotiocianata lize reagentom kot mikropore delcev in silicijevega oksida ( "diatomejska zemlja") absorbenti DNA molekulo. Nespecifično snovi, vključno z morebitnimi inhibitorjev, nato speremo z raztopino 2,5 molarne gvanidinijevega izotiocianata in etanolni raztopini, nakar se DNA molekula desorbirane v vodi, in ti vzorci so bili uporabljeni za izvedbo PCR. Za poenostavitev tehnologije ekstrakcije DNK se "diatomejska zemlja" pogosto nadomesti z magnetnimi mikrodelci, prevlečenimi s silicijevim oksidom. V tem primeru namesto centrifugiranja uporabimo posebno magnetno stojalo za mikrotruge, da se delci obori.

V Rusiji je bila razvita izvirna metoda imunomagnetne ločitve mikobakterij z naknadno ekstrakcijo DNA patogena. Za Mycobacterium tuberculosis imunomagnetno separacijo z uporabo ferroparticles velikost 3-5 mikronov, prevlečen s silicijevim dioksidom, na katerega sta vezana, s kemično veznega poliklonalna (zajec) protiteles proti Mycobacterium tuberculosis. Vzorci izpljunka po alkalni lizi se nevtralizirajo s kislinsko raztopino tris-HCl in inkubirajo z imunomagnetnim sorbentom. Nato se imunoferocelice zbirajo z magnetno palico z zamenljivim vrhom, prenesejo v mikrotabo in precipitirajo. Dodamo 20-30 μl 2% raztopine Triton X-100 in segrevamo 30 minut pri 90 ^° C. Supernatant se uporablja kot vzorčna DNA za PCR analizo.

Težavna težava je izolacija DNA mikobakterije tuberkuloze iz vzorcev biopsije. Za encimsko biopsijo se encimska proteinaza K uporablja pri končni koncentraciji 200-500 mg / l pri temperaturi 56 ^° C čez noč. Nadalje se uporablja ena od znanih metod. Presežna nespecifična DNA v PCR analizi biopsij pogosto povzroči zaviranje reakcije, ki zahteva ponavljajočo se ekstrakcijo DNK.

Metode za odkrivanje rezultatov

Po zaključku reakcije so ojačani fragmenti DNA patogena identificirani z različnimi metodami.

Metoda gelne elektroforeze je dobro znana. Nastali fragment DNA se identificira s pozitivnim nadzorom, ki vsebuje želeni specifični fragment DNA, ali glede na znano velikost (število nukleotidnih parov) fragmenta, ki se določi z uporabo standardnega molekularnega markerja.

V prisotnosti specifičnega barvila je etidijev bromid vključen v dvojno verižno DNA. Sintetiziran DNA fragment je zaznan kot svetlobni trak pod vplivom ultravijoličnega.

Velikost fragmenta DNA, določena z elektroforezo, oddaljeno od začetka, mora ustrezati znanim označevalcem molekulske mase ali pozitivnemu nadzoru.

Druge metode za določitev Rezultati PCR na osnovi hibridizacije ene same verige PCR produkti z oligonukleotida komplementarni z njo - DNA sonda označena z biotinom, čemur sledi zaznavanje preko encimskih reakcij, na primer z vezavo na streptavidinom-biotin alkalne fosfataze.

Na podlagi te vrste detekcije so bili ustvarjeni analizatorji PCR, pri katerih se detekcija rezultatov PCR izvede samodejno kot posledica branja optične gostote vzorcev po pojavu encimske reakcije.

Pomanjkljivosti teh metod so možnosti intralaboratorne kontaminacije s precej kratkimi fragmenti molekul DNA. Ko molekule vstopijo v nove vzorce, postanejo matriks za PCR in vodijo do lažnih pozitivnih rezultatov.

V zvezi s tem se za preprečevanje lažno pozitivnih rezultatov uvedejo stroga pravila za ločevanje in izolacijo prostorov: ekstrahiranje DNA iz bioloških vzorcev; prostori za odkrivanje rezultatov (elektroforeze) iz čiste cone. Ti prostori so območje verjetne kontaminacije. Drugo izolirano območje je čista soba za uvajanje vzorcev DNK, ki jih je treba preskusiti v epruvah z reakcijsko zmesjo za PCR. Nazadnje se domneva, da bi morala biti glavna naprava - ojačevalnik DNA - v ločeni, po možnosti pisarniški prostor.

Da bi preprečili kontaminacijo proizvodov predhodnih reakcije - nekatere Testni sistem Likon-amp PCR namesto dezoksinukleozidtimidina vsebujejo dezoksinukleoziduridin, ki pri in vitro sintezo vezje namesto vključena v pravilnem položaju, t.j. Dušikovo bazo timina, ki je prisotna v izvorni DNA, se nadomesti z uracilom. Uracil DNA glikozilazo dodamo k reakcijski zmesi na analit, uniči Samo kontaminirajo fragmenti uridin, vendar ne DNK nativne analizirati. Ki obsega: Naknadno segrevanje pri 94 ^° C inaktivira ta encim in ne ovira ojačanja pri PCR.

Obstaja preskusni sistem, ki temelji na izotermalni ojačitvi rRNK, za katero se najprej izvede reverzna transkripcija in sinteza molekul DNA. Ki je nato matrika za naknadno sintezo molekul RNK. RPL amplikone se odkrijejo z akrilinom obarvano DNA sondo, ko se hibridizira v raztopini reakcijske cevi. Ta metoda poleg visoke občutljivosti ima prednost analizo v eni cevi, ki preprečuje kontaminacijo. Po mnenju avtorjev občutljivost te metode pri dihalnih vzorcih doseže 90% s specifičnostjo 99-100%.

Nove metode odkrivanja se izvajajo v realnem času PCR. Te metode se razlikujejo predvsem v tem, da se PCR in odkrivanje njegovih rezultatov izvajajo istočasno v eni zaprti cevi. To ne samo tehnološko poenostavlja tehniko analize, temveč tudi preprečuje kontaminacijo laboratorijskih sob in preskusnih vzorcev s produkti iz prejšnjega PCR.

V realnem času rezultati detekcijskih PCR je posledica fluorescenco pojavi med fluorogene DNA hibridizacija sondo s amplifitsi Rui-PCR v določenem DNA fragmenta. Struktura fluorogena DNA sonde izdelani tako, da je fluorescentni marker sprosti kot posledica encimske reakcije ali oddaljila od dušilne molekule fluorescence samo pod posebnim hibridizacijo z želenim molekulo DNA, ki se ojača v PCR. Ker je število molekul sonda hibridizirana s povečanjem fluorescence je proporcionalna zaznano raven števila molekul pomnoženega produkta. Ker pri vsakem številu cikla PCR molekule DNA fragmenta se pomnoži s polovico, število ciklov, pri kateri se fluorescenca določi in poveča obratno sorazmerna s številom molekul DNA v začetni vzorec. Če je reakcija kot kalibratorju uvesti več različnih znane koncentracije molekul ustreznih DNA fragment Mycobacterium tuberculosis, uporabi se lahko izračuna računalniški program in količine genomske DNA iz testnega materiala.

Vsak standardni vzorec se podvoji. Kvantitativno merilo je najmanjše število PCR ciklov, potrebnih za začetek in rast določene fluorescence. Na abscisi - število ciklov; ordinata je fluorescenčna vrednost. Koncentracije DNA so obratno sorazmerne s številom ciklov, potrebnih za pojav fluorescence. V desnem stolpcu (21-32) so označene številke ciklov za ustrezne koncentracije. Razlike med 10-kratnimi koncentracijami fragmentov DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cikla. Pri dveh bolnikih so bile koncentracije IS6110 fragmentov približno 10 ³ / ml in 10 ⁴ / ml. Ob upoštevanju števila ponovitev (6-20) fragmentov, analiziranih v genomu Mycobacterium tuberculosis, je število mikobakterij v kliničnih vzorcih približno 100 in 1000 celic.

Uporaba PCR pri diagnozi tuberkuloze

Metoda PCR se najbolj uporablja za pospešeno diagnozo tuberkuloze - odkrivanje mikobakterijske tuberkuloze v kliničnih vzorcih: sputum. Bronhialni zardevanje, plevralni eksudat, urin, cerebrospinalna tekočina, osteolizni punktat, aspiraci žilnega trakta in različni primerki biopsije. V študiji na Nizozemskem so raziskovali okoli 500 izpljunku in bronhialna želodčnega soka vzorci iz 340 bolnikih s potrjeno diagnozo pljučne tuberkuloze primerjati občutljivost metode PCR, mikroskopija in študij kulture madežev. Občutljivost analize je bila 92,6,88,9 oziroma 52,4%. Specifičnost vseh metod je bila približno 99%.

Primerjali smo učinkovitost odkrivanja mikobakterije tuberkuloze z mikroskopijo s posipom, sejanje na medij Levenstein-Jensen, testni sistem VASTES in analizo PCR. PCR je pokazal občutljivost 74,4%, mikroskopijo - 33,8%, sejanje na gosto medij - 48,9% in VASTE - 55,8%. Povprečni čas detekcije za sejanje na mediju Levenstein-Jensen je 24 dni. VASTES - 13 dni, PCR - 1 dan.

Obravnavane so tudi možnosti uporabe PCR kot občutljive in hitre metode za spremljanje učinkovitosti zdravljenja tuberkuloze.

Dokaz Mycobacterium tuberculosis DNA s PCR z učinkovitim kemoterapijo določena v daljšem času - v povprečju 1,7 meseca v primerjavi s brisa opredeljenega pod fluorescenčnim mikroskopom in z 2,5 meseca v primerjavi z bakteriološko preiskavo.

Diagnoza ekstrapulmonalnih oblik tuberkuloze

Vrednost za občutljivo metodo PCR je posebno velika za Zunajpljučna oblike, saj tvori pod temi klinične in rentgensko metode konvencionalnih bakterioloških metod za določanje Mycobacterium tuberculosis v diagnostičnih materialov neučinkoviti.

V preiskavi vzorcev urina bili rezultati PCR pozitiven v 16 od 17 bolnikih z aktivnim TB in negativno urinske 4 bolniki neaktivnega ledvic tuberkulozo in 39 bolnikov z urinsko nontubercular bolezni sistem.

Učinkovitost PCR analize pri proučevanju aspiracij kostnega mozga pri bolnikih s povišano telesno temperaturo neznanega izvora je bila dokazana v primerih domnevne tuberkuloze. Za diagnosticiranje tuberkuloznega limfadenitisa je bilo pri otrocih preučenih 102 punkcijskih aspiraatov in vzorca biopsije 67 otrok s sumom tuberkuloznega limfadenitisa. Dobljeni so bili pozitivni rezultati: 71,6% PCR v realnem času. Fluorescenčna mikroskopija - 46,3%. Raziskovanje kulture - 41,8%. V študiji 50 biopsij limfnih vozlov pri bolnikih z boleznimi "cat cat scratch" so bili vsi rezultati negativni. Tako je bila dokazana 100-odstotna specifičnost PCR analize. V istem delu, s punkcijsko biopsijo bezgavk, je bila dokazana možnost detekcije M. Avium.

Diagnoza tuberkuloze neplodnosti ženskega spolovila, kot je znano, je ena od najtežjih problemov diagnoze. Ko pregledal PCR biopsij endometrija, pregledanih endometrija posrka tekoči vzorci Douglas prostoru 14 (56%) od 25 bolnikov laparoskopsko sum tuberkuloze, dobimo dobre rezultate. Z uporabo mikroboskopa in kulture smo dobili rezultate 1 in 2. Ti primeri so bili tudi PCR-pozitivni. Večina PCR-pozitivnih rezultatov je bila povezana s primeri z značilnimi znaki tuberkuloze glede na histološko študijo; manjše število - s sumom tuberkuloze po podatkih laparoskopije. Samo en pozitiven rezultat analize PCR je bil pridobljen v odsotnosti laparoskopskih podatkov za tuberkulozo.

Pri diagnosticiranju zunajpljušnih oblik tuberkuloze imajo kliniki pogosto vprašanja o možnosti odkrivanja patogena pri testiranju krvnih vzorcev z metodo PCR. Literarni podatki kažejo, da je odkrivanje DNA iz mikobakterije tuberkuloze iz vzorcev krvi mogoče z daljnosežnimi oblikami okužbe z virusom HIV. DNK mycobacterium tuberculosis je bila odkrita le s generalizirano tuberkulozo različnih organov pri bolnikih s presajenimi ledvicami in imunosupresijo.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Identifikacija vrst mikobakterij

Metoda PCR lahko zelo učinkovit za hitro identifikacijo mikobakterij tuberkulozi kompleksa in nekaterih vrst mikobakterije nontubercular po prejemu začetno rast. V tem primeru lahko uporaba PCR prihranek 7-10 dni, potrebnih za pozitivno identifikacijo poznejše kulture. Test PCR je tehnično zelo enostaven, ker za doseganje visoke občutljivosti ne zahteva zapletene priprave vzorca kliničnega materiala. V študiji 80 pozitivno v tem testnem sistemu (MB Vasto. Organon podjetja) so bili vsi pozitivni kulture PCR strogo specifična in se hrani za 1 dan. Za identifikacijo druge vrste mikobakterij pri pripravi DNA kulture patogenov hibridizira s specifičnimi DNA sondami, označene z akridin in sevi s pojavljanjem kemiluminescence preko chemiluminometer ali nitroceluloznih trakov z vizuelno oceno po hibridizacijo odkrite. S pomočjo takšnega sklopa je opredeljeno omejeno število vrst: kompleks mikobakterije tuberkuloze. M. Avium, M. Avium kompleks, M. Kansasii in M. Gordonae.

A.Telenti et al. Razvili tudi razmeroma enostaven in poceni način identifikacije vrst klinično pomembnih vrst mikobakterij s PCR in kasnejšo obdelavo z dvema restrikcijskih encimov (encimi imajo lastnosti reši molekulo DNA na specifičnih mestih). Drobec DNA se pomnoži. Ki kodira protein toplotnega šoka (65 kDa), nato pa obdelamo v dobljeni fragment PCR DNA 439 nukleotidnih parov ločeno dveh encimov - Bste II in Hae III. Nato analizirali z elektroforezo na agaroznem gelu pridobljeni dva proizvoda, ki določajo njihovo velikost (število baznih parov) z uporabo standardnega nabor fragmentov DNA (molekulsko DNA oznakama) v dolžino od 100 do 1000 baznih parov. V vsakem od posebnih vrst (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasil, M.fortuitum) zazna dva ali tri DNA fragmente različnih velikosti za vsako restrikcijskim encimom. Kombinacija različnih velikosti fragmentov DNK omogoča razlikovanje teh vrst med seboj.

Razvija se tehnologija bioloških DNA mikroorganizmov. Ki bo v eni študiji pripomogla k identifikaciji več kot 100 vrst mikobakterij.

V primerjavi z ustreznim primarno strukturo, ki omogoča identifikacijo več kot 40 vrst mikobakterij Identifikacijsko vrsta se lahko izvede tudi s PCR pomnoževanje 16S rRNA variabilne regije, ki mu sledi sekvenciranje z amplikonov.

S pomočjo PCR lahko opravimo tudi identifikacijo vrste znotraj kompleksa mycobacterium tuberculosis, vključno z diferenciacijo M. Bovis in M. Bovis BCG. Da bi to naredili, analiziramo prisotnost ali odsotnost nekaterih genov v genomskih regijah RD1. RD9 in RD10. RD1 je odsoten v M. Bovis BCG, vendar je prisoten v virusnih vrstah, vključno z M. Bovisom.

Določanje občutljivosti zdravila Mycobacterium tuberculosis s PCR

Cilji molekularno genetskih metod za dovzetnost drog ali odpornost Mycobacterium tuberculosis zmanjša za identifikacijo mutacije v specifičnih nukleotidnih zaporedij znanih genov. Osnovne metode temeljijo na neposrednem prochityvanii (sekvenciranje) teh zaporedij po pomnoževanju ali hibridizacijo DNA fragmentov-biotin označeni pomnoženih med sondami PCR DNA. Oba alternative vključuje ugotavljanje nukleotidne substitucije sekvenc, ki uporabljajo DNA sonde vodijo k odsotnosti ali nepopolne hibridizacijo na nitrocelulozno membrano s pomočjo encimskega konjugata (streptavidina-alkalna fosfataza) - Postopek lipa-Rif-TB.

Metoda za merjenje fluorescence v krajevno fiksno na microsections DNA sonde komplementarno znanih mutacij v PCR pomnoženih genskih regij odgovornih za odpornost ali občutljivost drog, imenovanih mikrobiochipov metoda. Osnovni algoritem te študije je, kot sledi. Po izoliranje DNA iz kliničnega vzorca ali kulture mikobakterij je treba izvesti PCR pomnoževanja ustreznih fragmentov rpoB gena, odgovornega za občutljivost drog v rifampicina ali katG in inhA genov, ki kodirajo proteine Mycobacterium so odgovorni za občutljivost na isoniazida. Rezultati PCR smo ovrednotili z agarozno gelsko elektroforezo, v katerem potrdi prejem ustreznih fragmentov DNA z želeno dolžino. Nato izvaja v 2. Krog PCR uvesti fluorescentni marker v DNK. Rezultati PCR potrjujeta med gelsko elektroforezo. Nato smo hibridizacija izvedena (inkubaciji preko noči), čemur sledi spiranje pridobljene snovi na biochip, kar je veliko število določen v majhno stekleno ploščo kratke verige DNA (sonde), ki dopolnjujejo nukleotidnih zaporedij z drogami občutljivih tipa Mycobacterium tuberculosis na mestih možnih mutacij. Kakor tudi mutiranih sekvenc, ki so odgovorni za odpornost drog. Lokacija sondami DNK na plošči - strogo opredeljene, in raven fluorescence opazili na hibridizacijo da se določi rezultat s posebno napravo za branje je nameščen. V zvezi s tem, so rezultati analize določijo s posebnim računalniškim programom.

V zadnjih letih so razvili alternativne metode za določanje občutljivosti na zdravilo mikobakterij tuberkuloze na podlagi tehnologije PCR v realnem času, ki omogočajo izvedbo teh študij v preskusu z zaprtimi cevmi.

Na sl. 13-13 prikazuje rezultat analize kliničnih izolatov Mycobacterium tuberculosis pri določanju odpornosti na rifampicina s PCR v realnem času: 218 - kontrolni vzorec (občutljive na rifampicin); 93 - pozitiven nadzor za mutacijo Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitivni nadzor za mutacijo Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - eksperimentalni vzorci. Rezultat izračunavanja kinetičnih krivulj ojačanja na 4 kanala: kanal 1: 393 - pozitiven nadzor za mutacijo Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - pozitiven nadzor za mutacijo Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - eksperimentalni vzorci; kanal 4: kinetične krivulje ojačanja vseh vzorcev, ki sodelujejo v poskusu. Pozitiven nadzor nad reakcijo ojačanja. Zaključki: Rezultati analize pokazale naslednje mutacije, ki določajo odpornost proti rifampicina: v vzorcih 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Isto načelo smo uporabili za določanje odpornosti zdravila na izoniazid za gene katG in inhA, ki določa najpogostejše mutacije.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Identifikacija tkiva mikobakterijske tuberkuloze

Najbolj temeljito raziskano Postopek identifikacije vrstami Mycobacterium tuberculosis je tehniko, imenovano polimorfizmom dolžin restrikcijskih fragmentov a (RFLP RFLP. Ali v angleški različici), ki temelji na fragmentirovanin (omejevanje) z Mycobacterium tuberculosis DNK encimskega PVU II in fragmente pridobljeni naknadno hibridizacije nekaterih specifičnih sekvenc DNA njegov ponovljeni element IS6110. Intraspecifična variabilnost spoznal skozi različno število ponovitev IS6110 in njihovo lokacijo na DNK. Kot tudi različne razdalje med posameznimi točkami napad restrikcijskim encimom (restrikcijskih mest) in IS6110 elementa. Ta tehnologija je zelo zapletena in dolgotrajna. Po obdelavi z DNA ekstrahiramo iz kulture Mycobacterium tuberculosis, gelsko elektroforezo izvedemo z restrikcijskim encimom in nato prenesli DNA fragmente različnih dolžin na nitrocelulozno membrano smo hibridizacija izvedena s fragmenti IS6110-element in zazna s pomočjo encimskih reakcij. Posebne DNA pasovih Nastalo vzorec označuje posebno sev Mycobacterium tuberculosis. Z uporabo računalniškega analiznem enaki ali sorodnih sevov. Kljub temu, da je metoda RFLP najbolj diskriminacijska, tj določa največje število razlik v sevih analiziranih je neučinkovita pri majhnem številu (manj kot 5) IS6110-ponovi opazili v nekaterih sevov. Na sl. 13-14 so prikazani rezultati sevov RFLP tipkanje.

Alternativa je lahko metoda spoligotipizacije - analiza polimorfizma zaporedij spacer DNA - intermediat med neposrednimi ponovitvami regije DR. Pri izvajanju spoligotipizacije sevov se PCR izvede s primerji, ki mejijo na regijo DR, po katerem se oblikujejo fragmenti različnih dolžin, ki se hibridizirajo s spremenljivimi vmesnimi področji DNA. Predstavljena je analiza distančnih sekvenc regije DR. Po mnenju raziskovalcev, preprostejša, produktivna in primerna za primarno presejanje sevov in predhodno epidemiološko analizo ter raziskavo neposredno kliničnega gradiva.

Očitno je, da je bolj učinkovita in tehnološko dostopna metoda VNTR (okrajšava angleških besed) ali metoda določanja spremenljivega števila natančnih tandemskih ponov v DNK mycobacterium tuberculosis. Ta metoda temelji samo na uporabi PCR in ne zahteva dodatne manipulacije. Ker je število tandemskih ponov v različnih sevih in v različnih lokih drugačno, se določijo in analizirajo fragmenti različnih velikosti na nastali elektroforezi izdelkov PCR. Po mnenju raziskovalcev uporaba VNTR doseže večjo stopnjo diskriminacije sevov kot z metodo RFLP.

V zadnjih letih je bila v zadnjih letih veliko pozornosti namenjena porazdelitvi sevov Mycobacterium tuberculosis v družino W-Peking (včasih imenovana sev Peking), ki so v veliki meri odporni proti drogam.

Osnovne zahteve za kakovost molekularnih bioloških raziskav

[72], [73], [74], [75],

Osnovni regulativni dokumenti za PCR

Naročila Rusko ministrstvo za zdravje: №45 od 02.07.2000 g .. številko 109 od 21.03.2003 g .. Številka 64 od 21.02.2000, Smernic: 1.3.1888-04 "Organizacija dela v študij z uporabo PCR materiala okuženi s patogenimi biološko povzročiteljev skupin III-IV patogenosti "; 1.3.1794-03 "Organizacija dela pri študiji PCR materiala, okuženih z mikroorganizmi skupin I-II patogenosti". 2003; 3.5.5.1034-01 "za dekontaminacijo materiala, okuženih bakterije I-IV patogenosti skupine pri uporabi PCR," 2001 dodatku 11 do enotnih navodil za mikrobioloških metod za preskušanje v identifikacijo, diagnosticiranje in zdravljenje tuberkuloze v.

[76], [77], [78]

Osebje

Izvedba molekularne biološke raziskave imajo lahko zdravniki kliničnih laboratorijske diagnostike, zdravniki bacteriologists, virologi, zdravniki, biologi, klinični diagnostični laboratorij, kot tudi strokovnjaki s srednjo medicinsko izobrazbo, opravil specializacijo in izpopolnjevanja na predpisan način.

Ureditev laboratorijskih prostorov

Potrebne so naslednje laboratorijske sobe:

• Območje za vzorčenje je laboratorij, prilagojen za delo z infekcijskimi sredstvi skupin III-IV za patogenost, v skladu z Metodološkim navodilom 13.1888-04.
• Območje za pripravo reakcijskih mešanic PCR - laboratorijska soba, ki zagotavlja zaščito pred notranjo laboratorijsko kontaminacijo - "čisto" območje.
• • Če se za analizo produktov PCR uporablja elektroforeza ali hibridizacija. Laboratorijski prostor, v katerem se pomnožijo DNA fragmente ekstrahiramo iz cevi in pomnoževanje, v tem zaporedju, lahko pride v okolje, v skladu z zahtevami za PCR laboratorijev (1.3.1794-03 smernice, usmerjanje 1.3.1888-04) mora biti popolnoma je izoliran iz prostorov, navedenih v prejšnjih odstavkih. To bi bilo treba izvzeti iz območja gibanja v cono elektroforeza za ravnanje z vzorcem in "čisto" območje vseh kadrov, opreme, uporabljenih materialov in predmetov, kot tudi prenos zraka skozi prezračevalni sistem, ali zaradi prepiha. To območje ni potrebno za fluorimetrično detekcijo produktov PCR.
• Prostor za dokumentacijo in obdelavo rezultatov je opremljen z računalniki in potrebno pisarniško opremo. Ta soba lahko vsebuje opremo, ki omogoča odkrivanje izdelkov PCR brez odpiranja cevi. - fluorescentni detektorji PCR in termični cikli za PCR v realnem času.

Sanitarne in epidemiološke zahteve za primarno zdravljenje sputuma so podobne standardnim mikrobiološkim zahtevam za zdravljenje tuberkuloze z mikobakterijami.

[79], [80], [81], [82],

Zaključek laboratorijske opreme za diagnostiko PCR

Laboratorij vključuje opremo za naslednje prostore.

• prostor za pripravo vzorcev vsebuje naslednjo opremo: laminar II razreda zaščite "SP-1.2": polprevodniški termostat z ogrevalnim pokrovom za epruvete tipa "Eppendorf"; mikrocentrifuga pri 13.000 vrt / min; centrifuga (Vortex); hladilnik s temperaturnem območju od -20 ^do C10 do ^okoli C; pipete spremenljivega volumna serije "Rroline"; črpalka z loputo OM-1; stojalo za pipete; delovna postaja stativa 200x0,5 ml; delovna postaja stativa 50x1,5 ml; Stojala za shranjevanje epruvet 80x1,5 ml;
• Prostor za pripravo reakcijske zmesi: zaščitna komora PCR-box ("Laminar-C 110 cm); centrifuga - Vortex; Pipetne spremenljivke serije Proline; stojalo za pipete; delovna postaja stativa 200x0,2 ml; Stojala za shranjevanje epruvet 80x1,5 ml; hladilnik s temperaturnem območju od -20 ^do C do +10 ^o C;
• prostor za elektroforezo: kamera za vodoravno elektroforezo; napajanje; transiluminator;
• Ojačevalniki DNA ali analizator nukleinske kisline (PCR v realnem času) z računalnikom in programsko opremo; lahko postavite v katero koli rezervno sobo. Če se uporablja PCR tehnologija v realnem času. Prostor za elektroforezo ni potreben.

[83], [84], [85], [86]

Zunanje kontrolo kakovosti

Da bi bili prepričani v pridobivanje objektivno zanesljivih rezultatov, morajo laboratoriji sodelovati v sistemu zunanjega ocenjevanja kakovosti laboratorijskih raziskav.

Udeleženci v sistemu kontrole kakovosti prejmejo; 12 vial liofilizirane suspenzij bakterijskih celic, od katerih sta dva vsebujejo E. Coli E. Kokosovega, 3 viale z Mycobacterium tuberculosis (avirulentni sev) pri 10 ² / ml; 3 ampule s celicami podobnega seva v koncentraciji 10 ⁴ / ml; 2 ampule z mikobakterijami, ki niso tuberkuloze M. Avium-intracellulare in M. Kansasii, v koncentraciji 10 ⁵ / ml.

Razdeljeni testi za zunanjo oceno kakovosti se predhodno testirajo v dveh neodvisnih laboratorijih z bogatimi izkušnjami na tem področju.

[87], [88]