Laboratorijska diagnoza tuberkuloze

Tuberkuloza je bolezen, ki jo je v sodobnih razmerah in znanstvenih dosežkih enostavno diagnosticirati. Laboratorijska diagnostika tuberkuloze zavzema osrednje mesto med drugimi diagnostičnimi metodami, takoj za rentgenskimi metodami.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinični krvni test

Pri bolnikih s tuberkulozo spremembe v splošni krvni preiskavi niso patognomonične. Pri omejenih in nizko aktivnih oblikah tuberkuloze je značilna hipokromija eritrocitov z normalnim številom. Pri masivnih infiltratih ali kazeozni pljučnici, z razširjenim kazeoznim limfadenitisom, specifično črevesno poškodbo, pa tudi pri velikih pljučnih ali pooperativnih krvavitvah, eritropeniji in mikrocitozi opazimo oligokromazijo, polikromazijo. Makrocitoza in zlasti poikilocitoza se pojavljata veliko manj pogosto, običajno pri hudi anemiji. Število retikulocitov v kompenzirani fazi tuberkuloze se giblje od 0,1 do 0,6 %, v subkompenzirani fazi - od 0,6 do 1,0 %, za dekompenzirano fazo pa je značilen 1 % retikulocitov.

V nekaterih primerih tuberkuloze lahko opazimo zmerno levkocitozo (do 15 tisoč levkocitov), redkeje levkopenijo, ki se pojavi v 2–7 % primerov pri bolnikih z omejenimi in blagimi oblikami procesa ter v 12,5 % pri destruktivni in progresivni pljučni tuberkulozi.

Najpogosteje se pojavijo premiki v levkocitni formuli. Opažena je tako relativna kot absolutna nevtrofilija, zmeren premik levkocitne formule v levo proti promielocitom. Mielociti se zelo redko pojavljajo v primerih nezapletene tuberkuloze. Povečanje števila nevtrofilcev s patološko granularnostjo v hemogramu bolnika s tuberkulozo vedno kaže na trajanje procesa: pri bolnikih s hudo tuberkulozo skoraj vsi nevtrofilci vsebujejo patološko granularnost. Ko se izbruh tuberkuloze umiri, se jedrni premik relativno hitro vrne v normalno stanje. Patološka granularnost nevtrofilcev običajno traja dlje kot druge spremembe v hemogramu.

Vsebnost eozinofilcev v periferni krvi niha tudi glede na fazo procesa in alergijsko stanje organizma. Njihovo število se zmanjša do aneozinofilije pri hudih in dolgotrajnih izbruhih bolezni in obratno se poveča med resorpcijo infiltratov in plevralnega izliva, pa tudi pri zgodnjih oblikah primarne tuberkuloze.

Večino oblik primarne tuberkuloze spremlja limfopenija, ki jo včasih opazimo še več let tudi po brazgotinjenju specifičnih sprememb. Sekundarno tuberkulozo v akutni fazi lahko, odvisno od resnosti procesa, spremlja bodisi normalno število limfocitov bodisi limfopenija.

Med testi za oceno tuberkuloznega procesa ima posebno mesto določanje hitrosti sedimentacije eritrocitov (ESR), ki je pomembna pri ocenjevanju poteka tuberkuloznega procesa in prepoznavanju njegovih aktivnih oblik. Povečanje ESR kaže na prisotnost patološkega procesa (infekcijsko-vnetni, gnojni, septični, hemoblastoza, limfogranulomatoza itd.) in služi kot pokazatelj njegove resnosti, vendar normalne vrednosti ESR ne kažejo vedno na odsotnost patologije. Pospešitev sedimentacije eritrocitov olajša povečanje vsebnosti globulinov, fibrinogena, holesterola v krvi in zmanjšanje viskoznosti krvi. Upočasnitev sedimentacije eritrocitov je značilna za stanja, ki jih spremlja hemokoncentracija, povečanje vsebnosti albuminov in žolčnih kislin.

Hemogram bolnikov s tuberkulozo se med zdravljenjem spreminja. Bolj ko je terapevtski poseg uspešnejši, hitreje izginejo hematološke spremembe. Hkrati je treba upoštevati vpliv različnih antibakterijskih zdravil na hematopoezo. Pogosto povzročajo eozinofilijo, v nekaterih primerih levkocitozo, pogosteje pa levkopenijo do agranulocitoze in limfoidno-retikularne reakcije. Sistematično hematološko spremljanje in pravilna analiza pridobljenih podatkov sta bistvena za oceno kliničnega stanja bolnika, dinamike procesa in učinkovitosti zdravljenja.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinična analiza urina

Pri tuberkulozi sečil je glavna laboratorijska diagnostična metoda analiza urina. Opazimo lahko levkociturijo, eritrociturijo, proteinurijo, hipoizostenurijo, tuberkulozno mikobakteriurijo in nespecifično bakteriurijo.

Levkociturija je najpogostejši simptom tuberkuloze sečil pred specifično kemoterapijo in je odsotna le v izjemnih primerih, kot je popolna obliteracija lumna sečevoda. Nechiporenkov test (določanje števila levkocitov v 1 ml urina) pomaga objektivneje oceniti stopnjo levkociturije pri nefrotuberkulozi in jo v nekaterih primerih odkriti z normalno splošno analizo urina. Vendar je treba upoštevati, da se levkociturija lahko pojavi pri akutnem in kroničnem pielonefritisu, cistitisu, uretritisu, ledvičnih kamnih in sečevodah.

Eritrociturija, tako kot levkociturija, velja za enega najpogostejših laboratorijskih znakov genitourinarne tuberkuloze. Pogostost hematurije je odvisna od razširjenosti procesa; povečuje se z razvojem destruktivnega tuberkuloznega procesa v ledvicah. Eritrociturija brez levkociturije je bolj značilna za zgodnje faze ledvične tuberkuloze. Hematurija, ki prevladuje nad levkociturijo, je pomemben argument v prid ledvične tuberkuloze pri razlikovanju od nespecifičnega pielonefritisa.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokemični krvni test

Pri tuberkulozi so spremembe nekaterih biokemijskih kazalnikov odvisne predvsem od faze procesa, zapletov in različnih sočasnih bolezni. Pri bolnikih z neaktivno tuberkulozo pljuč in drugih organov se skupne beljakovine in beljakovinske frakcije v krvnem serumu ne spremenijo in določajo njihovo normalno vsebnost.

Pri akutnih oblikah bolezni, pa tudi pri poslabšanju in napredovanju kroničnih oblik tuberkuloze, se albumin-globulinski koeficient zmanjša.

Pomemben pomen pri ocenjevanju funkcionalnega stanja in organske poškodbe jeter pri tuberkulozi in njenih zapletih ima določanje direktnega in skupnega bilirubina, aspartat aminotransferaze (AST) in alanin aminotransferaze (ALT) v krvnem serumu. Dinamično določanje ravni aminotransferaz. bilirubin pri zdravljenju bolnikov s tuberkulozo, zlasti v hudih oblikah, je obvezen sestavni del biokemijskega pregleda bolnikov s tuberkulozo in se izvaja mesečno.

Ocena funkcionalnega stanja ledvic vključuje določanje serumskega kreatinina in izračun hitrosti glomerularne filtracije z uporabo Cockcroft-Gaultove formule. Izračun hitrosti glomerularne filtracije z uporabo Rebergovega testa daje manj natančne rezultate.

Glavni cilj dinamičnih biokemijskih študij bolnikov s tuberkulozo je spremljanje poteka procesa, pravočasno odkrivanje stranskih učinkov zdravil in ustrezna korekcija nastalih motenj homeostaze.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Uporaba biokemijskih raziskovalnih metod pri zunajpljučni tuberkulozi

Najbolj informativen kazalnik velja za vsebnost tuberkulostearinske kisline v bioloških tekočinah, vendar je njena določitev povezana s tehničnimi težavami (potreba po uporabi plinske kromatografije in masne spektrometrije).

Obetavno je merjenje aktivnosti adenozin deaminaze - encima, ki se določa v tekočinah: sinovialni, perikardialni, ascitni ali cerebrospinalni. Glavni proizvajalci adenozin deaminaze so limfociti in monociti. Določanje aktivnosti adenozin deaminaze v bioloških tekočinah olajša diagnozo tuberkuloznega sinovitisa, tuberkuloze bezgavk, tuberkuloznega meningitisa, tuberkuloznega serozitisa.

Nekateri biokemični kazalniki se zaradi svoje nespecifičnosti določajo le v bioloških tekočinah blizu lezije. Raven kazalnikov se meri kot odziv na subkutano ali intradermalno dajanje tuberkulina (običajno pred dajanjem ter 48 in 72 ur po njem). Po tem se izračuna stopnja povečanja ravni markerja (v %) glede na začetno raven.

Optimalno je, da se aktivnost organsko specifičnega encima transamidinaze določi v urinu; njen pojav opazimo pri poškodbah ledvic različnega izvora. Študija transamidinaze je upravičena le v pogojih subkutane aplikacije tuberkulina za poslabšanje lokalnega vnetnega procesa. Aktivnost transamidinaze se določi v urinu sprva in 24–72 ur po aplikaciji 50 TE tuberkulina. Povečanje fermenturije za 2-krat ali več omogoča v 82 % primerov razlikovanje med aktivno tuberkulozo ledvic in poslabšanjem kroničnega pielonefritisa.

Pri tuberkulozi ženskih spolnih organov se koncentracije haptoglobina in malondialdehida v krvi določajo pod pogoji provokativnega tuberkulinskega testa. Tuberkulin se daje subkutano v odmerku 50 TE in po 72 urah se opravi ponovna biokemijska preiskava. Pri tuberkulozni etiologiji je stopnja povečanja ravni haptoglobina vsaj 28 %, raven malondialdehida pa 39 % ali več. Uporablja se tudi določanje aktivnosti adenozin deaminaze v peritonealni tekočini, pridobljeni iz Douglasovega žepa. Punkcijo ponovno pregledamo 72 ur po intradermalni aplikaciji tuberkulina v odmerkih 0,1 TE in 0,01 TE na območju projekcije notranjih spolnih organov na sprednjo trebušno steno. Povečanje aktivnosti adenozin deaminaze za 10 % ali več v primerjavi z začetno vrednostjo kaže na tuberkulozni proces.

V primeru poškodbe oči se preuči fokalna reakcija, ki se pojavi v očesu kot odziv na stimulacijo z antigenom. V tem primeru je razvoj ostro izraženega odziva, ki ga spremlja zmanjšanje vidnih funkcij, nezaželen. Ker je ocena minimalnih fokalnih reakcij pogosto težavna, je za objektivizacijo zaključka priporočljivo vzporedno osredotočiti na stopnjo povečanja haptoglobina ali adenozin deaminaze v krvnem serumu.

Vse biokemijske študije je treba izvajati v kombinaciji z drugimi metodami.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Študija sistema strjevanja krvi

Pomen preučevanja stanja sistema strjevanja krvi v ftiziologiji je posledica prisotnosti hemoptize ali pljučnih krvavitev pri številnih bolnikih s tuberkulozo pljuč, pa tudi zapletov hemokoagulacije pri kirurškem zdravljenju tuberkuloze. Poleg tega naravno spremljajoča latentna intravaskularna hemokoagulacija vpliva na potek bolezni in učinkovitost kemoterapije.

Pri bolnikih s pljučno tuberkulozo s prevladujočo eksudativno komponento vnetja opazimo zmanjšanje antikoagulantne aktivnosti krvi. Pri bolnikih z nizko prevalenco specifične pljučne poškodbe s prevladujočo produktivno komponento vnetja je intravaskularna hemokoagulacija neznatno izražena. Pri bolnikih s pljučno tuberkulozo s hemoptizo in pljučnimi krvavitvami je stanje sistema strjevanja krvi drugačno: pri bolnikih z manjšo izgubo krvi na vrhuncu hemopteje ali takoj po njenem prenehanju opazimo močno povečanje koagulacijske sposobnosti krvi zaradi izrazite intenzifikacije procesov tvorbe trombina ob hkratnem ohranjanju povečane "strukturne" koagulabilnosti. Pri bolnikih z obsežno izgubo krvi opazimo zmanjšanje koagulacijskega potenciala zaradi zmanjšanja koncentracije fibrinogena, aktivnosti faktorja XIII in števila trombocitov. V fazi kirurškega zdravljenja pri bolnikih z omejenimi oblikami pljučne tuberkuloze ne pride do pomembnih motenj v sistemu homeostaze. Pri bolnikih z razširjenimi procesi se med pnevmonektomijo ali plevropnevmonektomijo pogosto razvije DIC sindrom, ki se lahko pojavi v obliki "druge bolezni".

Za spremljanje stanja sistema strjevanja krvi pri bolnikih s pljučno tuberkulozo je potrebno določiti aktivirani parcialni tromboplastinski čas (APTT), fibrinogen, trombinski čas, protrombinski indeks ter čas krvavitve in čas strjevanja krvi.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonske študije

Sodobna eksperimentalna in klinična opazovanja kažejo na prisotnost sprememb v hormonskem statusu pri specifičnem tuberkuloznem vnetju pljuč. Dokazano je, da korekcija disfunkcije hipofizno-nadledvičnega, hipofizno-ščitničnega sistema in delovanja trebušne slinavke v kombinaciji s protituberkuloznim zdravljenjem prispeva k aktivaciji fibrogeneze in reparacijskih procesov v žarišču specifičnega vnetja.

Funkcionalno stanje hipofizno-ščitničnega sistema se ocenjuje po vsebnosti trijodotironina (T3), tiroksina (T4) in hipofiznega tirotropina (TSH) v krvnem serumu _. Ugotovljeno je _bilo, da se subklinični hipotiroidizem odkrije pri 38–45 % bolnikov s pljučno tuberkulozo, najpogosteje pa se diagnosticira pri diseminirani in fibrozno-kavernozni obliki procesa. Pri teh oblikah so ravni T3 in T4 najbolj znižane _{,neravnovesje} teh hormonov pa se pojavi v obliki povečanega _{razmerja T4/} T3.

Delovanje nadledvične skorje se ocenjuje z ravnjo kortizola v serumu, endokrino delovanje trebušne slinavke pa s koncentracijo imunoreaktivnega insulina. V akutni fazi nalezljive bolezni se potreba po endogenem kortizolu in insulinu poveča. Hiperinzulinemija kaže tudi na inzulinsko rezistenco telesnih tkiv, kar je značilno za vsak aktivni vnetni proces, zlasti za specifičnega. Določanje glukokortikoidne funkcije nadledvičnih žlez pri aktivni pljučni tuberkulozi nam omogoča, da pri večini bolnikov odkrijemo prisotnost hiperkorticizma. Normalne koncentracije kortizola v krvi pri bolniku z infekcijskim vnetjem v akutnem obdobju je treba obravnavati kot relativno insuficienco glukokortikoidne funkcije nadledvične skorje, kar lahko služi kot osnova za nadomestno zdravljenje z ustreznimi odmerki glukokortikoidov.

Skoraj tretjina bolnikov s pljučno tuberkulozo ima nizko raven insulinemije, ki se približuje spodnji meji norme, medtem ko ima 13–20 % pomemben hiperinzulinizem. Tako relativni hipo- kot hiperinzulinizem sta dejavnika visokega tveganja za razvoj motenj presnove ogljikovih hidratov različne resnosti. Te spremembe v funkcionalni aktivnosti B-celic trebušne slinavke zahtevajo redno spremljanje glikemije pri bolnikih s tuberkulozo in pravočasno preprečevanje sladkorne bolezni. Poleg tega to služi kot dodatna utemeljitev za ustreznost uporabe fizioloških odmerkov insulina v kompleksnem zdravljenju tuberkuloze.

Na splošno so znižanje ravni ščitničnih hormonov, njihovo neravnovesje, hiperkortizolemija in hiperinzulinizem najbolj izraziti pri bolnikih s hudim potekom tuberkuloznega procesa, z obsežnimi pljučnimi lezijami in izrazitimi simptomi tuberkulozne zastrupitve.

Mikrobiološka diagnostika tuberkuloze

Mikrobiološke študije so potrebne za identifikacijo bolnikov s tuberkulozo, potrditev diagnoze, spremljanje in popravljanje kemoterapije, oceno izidov zdravljenja, z drugimi besedami, od trenutka, ko je bolnik s tuberkulozo registriran, do njegovega odvzema iz registra.

Vsi epidemiološki programi in projekti temeljijo na oceni števila izločalcev bakterij, kar je nemogoče brez uporabe laboratorijskih metod za odkrivanje mikobakterij tuberkuloze. Pri pregledu privlačnosti tako imenovane neorganizirane populacije odstotek izločalcev bakterij doseže 70 ali več, zaradi česar so laboratorijske metode dokaj učinkovito sredstvo za odkrivanje bolnikov s tuberkulozo v tej populacijski skupini.

Tradicionalne mikrobiološke metode diagnosticiranja tuberkuloze so bakterioskopske in kulturne študije. Sodobne metode vključujejo gojenje tuberkuloznih mikobakterij v avtomatiziranih sistemih in PCR. Vendar pa so vse te metode nujno kombinirane s klasičnimi bakteriološkimi metodami.

Zbiranje diagnostičnega materiala

Učinkovitost laboratorijskih preiskav je v veliki meri odvisna od kakovosti diagnostičnega materiala. Skladnost s pravili za zbiranje, shranjevanje in transport diagnostičnega materiala ter natančno izvajanje algoritma pregleda pacienta neposredno vplivata na rezultat in zagotavljata biološko varnost.

Za testiranje na tuberkulozo se uporablja vrsta materialov. Ker je pljučna tuberkuloza najpogostejša oblika tuberkulozne okužbe, se glavni material za testiranje šteje za sputum in druge vrste izločkov traheobronhialnega drevesa: izloček zgornjih dihal, pridobljen po vdihavanju aerosolov: bronhialne izpiralne vode; bronhoalveolarne izpirke; material, pridobljen med bronhoskopijo, transtrahealno in intrapulmonalno biopsijo: bronhialni aspirat, brisi grla, eksudati, brisi ran itd.

Učinkovitost raziskave se poveča, če se izvaja nadzorovan odvzem materiala od pacienta. V ta namen se dodeli posebej opremljen prostor ali pa se kupijo posebne kabine. Odvzem materiala je nevaren postopek, zato je treba material za raziskave odvzeti v skladu s pravili o varnosti pred okužbami.

Material za testiranje na Mycobacterium tuberculosis se zbere v sterilne vialice s tesno privitimi pokrovčki, da se prepreči kontaminacija okolja in zaščiti zbrani material pred kontaminacijo.

Viale za odvzem diagnostičnega materiala morajo izpolnjevati naslednje zahteve:

• mora biti izdelan iz materiala, odpornega proti udarcem;
• se mora pri avtoklaviranju zlahka stopiti;
• imeti zadostno prostornino (40–50 ml):
• imeti široko odprtino za zbiranje sputuma (premer najmanj 30 mm);
• biti enostaven za uporabo, prozoren ali prosojen, tako da je mogoče oceniti količino in kakovost zbranega vzorca brez odpiranja pokrova.

Za doseganje optimalnih rezultatov raziskav morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji:

• odvzem materiala je treba opraviti pred začetkom kemoterapije;
• material za študijo je treba zbrati pred jedjo ali jemanjem zdravil zjutraj;
• Za študijo je priporočljivo zbrati vsaj 3 jutranje vzorce sputuma. Sputum se zbira 3 zaporedne dni;
• Zbrani material je treba čim prej dostaviti v laboratorij:
• v primerih, ko materiala ni mogoče takoj dostaviti v laboratorij, ga shranimo v hladilniku pri temperaturi zraka 4 °C največ 48 ur;
• Pri prevozu materiala je treba posebno pozornost nameniti celovitosti steklenic.

Pravilno zbrani sputum ima sluzast ali mukopurulenten značaj. Optimalna količina pregledanega dela sputuma je 3-5 ml.

Sputum se odvzame pod nadzorom zdravstvenega delavca. Osebe, odgovorne za odvzem sputuma, morajo zagotoviti, da se upoštevajo določena pravila:

• Pacientu je treba razložiti namen pregleda in potrebo po izkašljevanju ne sline ali nazofaringealne sluzi, temveč vsebine globokih delov dihalnih poti. To je mogoče doseči z produktivnim kašljem, ki se pojavi po več (2-3) globokih vdihih. Pacienta je treba opozoriti tudi, da si mora najprej usta sprati s prekuhano vodo, da odstrani glavni del mikroflore, ki vegetira v ustni votlini, in ostanke hrane, ki otežujejo pregled sputuma;
• Zdravstveni delavec, ki sodeluje pri zbiranju sputuma, mora poleg halje in kape nositi tudi masko, gumijaste rokavice in gumijast predpasnik;
• Če pacient stoji za njim, mu svetujemo, naj stekleničko drži čim bližje ustnicam in vanjo takoj loči izpljunek, ko ga izkašlja, pri čemer je treba zagotoviti, da je pretok zraka usmerjen stran od zdravstvenega delavca:
• Ko je odvzem sputuma končan, mora zdravstveni delavec stekleničko skrbno zapreti s pokrovčkom in oceniti količino in kakovost zbranega sputuma. Stekleničko nato označi in jo shrani v posebno škatlo za prevoz v laboratorij.

Če bolnik ne izloča sputuma, mu je treba večer pred odvzemom in zgodaj zjutraj na dan odvzema materiala dati ekspektorans: izvleček korenin močvirja (mukaltin), bromheksin, ambroksol itd. - ali pa uporabiti dražilno inhalacijo z uporabo opreme, nameščene v prostoru za odvzem sputuma. Tako odvzet material ni predmet konzerviranja in ga je treba pregledati na dan odvzema. Da bi se izognili njegovi "zavrnitveni" reakciji v laboratoriju, je treba v napotnico napisati posebno opombo.

Če se mikrobiološke študije v določeni ustanovi ne izvajajo, je treba zbrani diagnostični material centralno dostaviti v laboratorij, pod pogojem, da se material med dobavami hrani v hladilniku ali s konzervansi. Material se v laboratorij dostavi v transportnih škatlah, ki jih je mogoče enostavno razkužiti. Vsak vzorec mora biti opremljen z ustrezno etiketo, celotna serija pa mora imeti izpolnjen spremni obrazec.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Načini in pogostost pregledov bolnikov

Med začetnim, tako imenovanim diagnostičnim pregledom bolnika za tuberkulozo je treba pregledati vsaj 3 dele sputuma, zbranega pod nadzorom zdravstvenega osebja v 2 ali 3 dneh, kar poveča učinkovitost mikroskopije.

Primarno presejanje za tuberkulozo bi morale izvajati vse zdravstvene in diagnostične ustanove zdravstvenega sistema. V zadnjem času so bili za povečanje učinkovitosti primarnega pregleda na podlagi kliničnih diagnostičnih laboratorijev organizirani tako imenovani centri za mikroskopijo, opremljeni s sodobnimi mikroskopi in opremo za zagotavljanje epidemične varnosti.

Protituberkulozne ustanove uporabljajo shemo anketiranja, ki predvideva vsaj 3-kratni pregled sputuma ali drugega diagnostičnega materiala v 3 dneh. Med zdravljenjem se mikrobiološke študije izvajajo redno, vsaj enkrat na mesec v fazi intenzivne kemoterapije. Pri prehodu v fazo spremljanja se študije izvajajo manj pogosto - v intervalih 2-3 mesece, pogostost študij pa se zmanjša na dve.

Značilnosti zbiranja diagnostičnega materiala za zunajpljučno tuberkulozo

Značilnost patološkega materiala pri zunajpljučnih oblikah tuberkuloze je nizka koncentracija mikobakterij tuberkuloze v njem, kar zahteva občutljivejše metode mikrobioloških raziskav, predvsem metode setve na hranilnem mediju.

V primeru genitourinarne tuberkuloze je urin najdostopnejši material za preiskavo. Zbiranje urina mora opraviti posebej usposobljena medicinska sestra.

Zunanji spolni organi se operejo z vodo in milom ali s šibko raztopino kalijevega permanganata. Zunanja odprtina sečnice se skrbno obdela. Srednji del jutranjega urina se zbere v sterilno stekleničko: pri moških - naravno, pri ženskah - s katetrom. Urin iz ledvične medenice se zbere v sterilne epruvete med kateterizacijo ene ali dveh ledvic, v slednjem primeru - nujno ločeno iz vsake ledvice. Majhna količina tega urina se centrifugira, usedlina se pregleda.

Pri moških se sperma, vzorci testisov in izločki prostate centrifugirajo, da se dobi usedlina. Pri kateri koli lokalizaciji določenega procesa v genitalnem področju pri moških lahko masaža prostate spodbudi sproščanje izločkov, ki vsebujejo mikobakterije tuberkuloze.

Menstrualno kri se pri ženskah odvzame z odsesavanjem ali s Kafkovo kapico. Nastali material se eritrocitov odstrani z izpiranjem z destilirano vodo in nato centrifugiranjem. Usedlina se pregleda.

Izcedek iz materničnega vratu maternice se zbira v posodi ali Kafkini kapici, torej je zaželeno, da se nabere 1-2 ml patološkega materiala.

Material, pridobljen med kirurškimi posegi na ledvicah, genitalijah, biopsijami, endometrijskimi strganji, se homogenizira. V ta namen se da v sterilno terilnico in temeljito zdrobi s sterilnimi škarjami. Nastali suspenziji se doda sterilni rečni pesek v količini, ki je enaka njeni masi, nato se doda 0,5–1,0 ml izotonične raztopine natrijevega klorida in vse skupaj se zmelje, dokler ne nastane kašasta masa z dodatkom izotonične raztopine natrijevega klorida (4–5 ml). Nato se masa pusti usedati 1–1,5 minute, supernatant pa se pregleda.

Tuberkuloza kosti in sklepov. Punkcijski material (gnoj iz abscesov), odvzet s sterilno brizgo, se da v sterilno posodo in takoj dostavi v laboratorij. S sterilno pipeto, predhodno navlaženo s sterilno izotonično raztopino natrijevega klorida, se odvzame 2–5 ml gnoja, prenese v stekleničko s kroglicami in doda še 2–3 ml izotonične raztopine natrijevega klorida. Stekleničko zapremo z zamaškom in stresamo v stresalniku 8–10 minut. Homogenizirana suspenzija se pregleda.

Pri fistuloznih oblikah osteoartikularne tuberkuloze se gnoj odvzame iz fistule. Obilen izcedek se zbere neposredno v epruveto. V primerih redkega gnojnega izcedka se fistulni trakt izpere s sterilno izotonično raztopino natrijevega klorida, izpirek, zbran v epruveto ali košček tampona, namočenega v gnoj, pa se pošlje na preiskavo.

Kirurški material, pridobljen med kirurškimi posegi na kosteh in sklepih, je lahko sestavljen iz gnojno-nekrotičnih mas, granulacij, brazgotin, kostnega tkiva, tkiva sinovialne membrane in drugih substratov. Njegova obdelava se izvaja kot v primeru ledvične tuberkuloze.

Mikrobiološki pregled sinovialne tekočine v 3 % raztopini natrijevega citrata (v razmerju 1:1) za preprečevanje strjevanja se opravi takoj po punkciji.

Tuberkuloza bezgavk. Gnoj, pridobljen med punkcijo bezgavk, se pregleda na enak način kot gnoj iz abscesov. Tkivo bezgavk, pridobljeno med kirurškimi posegi in biopsijami, se pregleda kot pri drugih oblikah tuberkuloze.

Študija blata za Mycobacterium tuberculosis se izvaja izjemno redko zaradi skoraj popolne odsotnosti pozitivnih rezultatov.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopija mikobakterij

Mikroskopija sputuma je relativno hitra, preprosta in poceni metoda, ki jo je treba uporabiti v vseh primerih suma na tuberkulozo. Poleg tega se ta študija izvaja za oceno učinkovitosti kemoterapije in za potrditev okrevanja ali neuspeha zdravljenja v odsotnosti rezultatov kulture.

Uporabljata se dve metodi mikroskopskega pregleda:

• metoda neposredne mikroskopije, ko se razmaz pripravi neposredno iz diagnostičnega materiala;
• metoda mikroskopije usedlin, pripravljenih iz materiala, obdelanega z dekontaminanti, za kulturne raziskave.

Prva metoda se uporablja v tistih laboratorijih, kjer se izvajajo le mikroskopske študije (klinični diagnostični laboratoriji splošne medicinske mreže).

Najboljše rezultate mikroskopskega pregleda dobimo s koncentriranjem diagnostičnega materiala (na primer s centrifugiranjem).

Da bi z mikroskopijo s 50-odstotno verjetnostjo odkrili Mycobacterium tuberculosis, mora 1 ml sputuma vsebovati več kot 5000 mikrobnih celic. Sputum bolnikov s pljučnimi oblikami tuberkuloze običajno vsebuje znatno število kislinsko odpornih bakterij, kar omogoča njihovo zanesljivo odkrivanje z bakterioskopijo. Diagnostično občutljivost te metode je mogoče povečati s pregledom več vzorcev sputuma enega bolnika. Negativen bakterioskopski izvid ne izključuje diagnoze tuberkuloze, saj sputum nekaterih bolnikov vsebuje manj Mycobacterium, kot jih je mogoče odkriti z mikroskopijo. Vzrok za negativen bakterioskopski izvid je lahko tudi slaba priprava razmazov sputuma.

Najpogostejša metoda za odkrivanje kislinsko odpornih mikobakterij v razmazu je barvanje po Ziehl-Neelsenu. Metoda temelji na prodiranju karbol fuksina v mikrobno celico skozi membrano, ki vključuje voskasto-lipidno plast, s hkratnim učinkom segrevanja in močnim jedkalnim delovanjem fenola. Naknadno razbarvanje razmaza z 25 % raztopino žveplove kisline ali 3 % klorovodikovega alkohola povzroči razbarvanje vseh kislinsko odpornih struktur. Razbarvani elementi razmaza se obarvajo z 0,3 % raztopino metilenskega modrega. Mikobakterije ne zaznavajo običajnih anilinskih barvil, zaradi česar se kislinsko odporne mikobakterije obarvajo malinovo rdeče, drugi mikrobi in celični elementi pa modro.

Za pregled razmazov, obarvanih po Ziehl-Neelsenu, uporabimo svetlobni binokularni mikroskop z imerzijskim objektivom (90- ali 100-kratna povečava) in okularjem s 7- ali 10-kratno povečavo. Pregledamo 100 vidnih polj, kar zadostuje za odkrivanje posameznih mikobakterij v razmazu. Če je rezultat takšne preiskave negativen, je za potrditev priporočljivo pregledati še 200 vidnih polj. Rezultati se zabeležijo in navedejo število odkritih kislinsko odpornih mikobakterij (AFB).

Poleg te metode se za luminiscenčno mikroskopijo uporablja tudi fluorokromsko barvanje, ki omogoča doseganje najboljših rezultatov. Uporaba te metode poveča učinkovitost mikroskopije za 10–15 %. Ko mikobakterije obdelamo z luminiscentnimi barvili (auramin, rodamin itd.), se te snovi vežejo tudi na voskaste strukture mikrobne celice. Ko obarvane celice obsevamo z vznemirljivim svetlobnim virom (določen spekter ultravijoličnega sevanja), začnejo svetiti oranžno ali svetlo rdeče na črnem ali temno zelenem ozadju. Zaradi visoke svetlosti in kontrasta vidne slike se lahko skupna povečava mikroskopa zmanjša za 4–10-krat, kar razširi vidno polje in skrajša čas opazovanja preparata. Poleg tega se zaradi bistveno večje globinske ostrine lahko poveča udobje študije.

Pri uporabi fluorescenčne mikroskopije ogled istega območja razmaza traja bistveno manj časa kot svetlobna mikroskopija razmazov, obarvanih po Ziehl-Neelsenu. Če mikroskopist v enem delovnem dnevu pregleda približno 20–25 takšnih razmazov, lahko s pomočjo fluorescenčne mikroskopije v istem času pregleda več kot 60–80 vzorcev. Izkušeni mikroskopisti vedo, da je barvanje celic z mešanico auramina in rodamina na nek način specifično za kislinsko odporne mikobakterije, ki imajo v tem primeru videz zlatih paličica. Saprofiti se obarvajo zelenkasto.

Druga pomembna prednost metode fluorescenčne mikroskopije je sposobnost odkrivanja spremenjenih mikobakterij, ki so pod vplivom številnih neugodnih dejavnikov, zlasti intenzivne kemoterapije, izgubile svoje kislinsko odporne lastnosti in jih zato Ziehl-Neelsenovo barvanje ne zazna.

Slabosti metode fluorescenčne mikroskopije vključujejo relativno visoke stroške mikroskopa in njegovega delovanja. Vendar pa je v centraliziranih ali drugih velikih laboratorijih, kjer delovna obremenitev presega normo treh laboratorijskih tehnikov, ki delajo s tremi običajnimi mikroskopi, ceneje uporabiti en fluorescenčni mikroskop.

Bakterioskopske metode imajo precej visoko specifičnost (89-100 %). Približno 97 % pozitivnih rezultatov, pridobljenih s katero koli mikroskopsko metodo, je jasno potrjenih z rezultati setve.

Treba je opozoriti, da mikroskopski pregled razmaza patološkega materiala ne omogoča določitve vrste odkritih kislinsko odpornih mikobakterij. Mikroskopska metoda omogoča sklepanje le o prisotnosti ali odsotnosti kislinsko odpornih mikroorganizmov v pripravku, kar je pojasnjeno z obstojem velikega števila netuberkuloznih kislinsko odpornih mikroorganizmov v naravi, ki so morfološko podobni mikobakterijam tuberkuloznega kompleksa.

Vrednotenje rezultatov mikroskopije se izvaja v semikvantitativnih enotah.

Za primerjavo rezultatov različnih mikroskopskih metod se uvedejo empirični koeficienti. Na primer, za primerjavo rezultatov razmaza, obarvanega s fluorescentnimi barvili, s podatki svetlobne mikroskopije (1000-kratna povečava) je treba število kislinsko odpornih mikobakterij, odkritih s fluorescentnim mikroskopom, deliti z ustreznim koeficientom: pri 250-kratni povečavi mikroskopa - z 10, pri 450-kratni - s 4, pri 630-kratni - z 2.

Značilnosti mikroskopije pri zunajpljučni tuberkulozi

Izvaja se direktna mikroskopija, pa tudi mikroskopija razmazov, pripravljenih po obogatitvi, z naknadnim barvanjem po Ziehl-Neelsenu ali fluorescentnih barvilih. Direktna mikroskopija razmazov je neučinkovita zaradi nizke koncentracije mikobakterij v materialu, zato je bolj smiselno uporabiti metode obogatitve. Najučinkovitejše je centrifugiranje. Če je biološki material viskozen, se uporabi centrifugiranje s sočasno homogenizacijo in utekočinjanjem materiala, ki se izvaja z uporabo visokohitrostnih centrifug s centrifugalno silo 3000 g in raztopin hipoklorita. Druge metode obogatitve, kot je mikroflotacija, se trenutno ne uporabljajo zaradi nastajanja biološko nevarnih aerosolov.

[ 37 ]

Metoda kulture za diagnosticiranje tuberkuloze

Metoda sejanja ali metoda gojenja je občutljivejša od mikroskopije razmaza in ima pred njo številne prednosti. Omogoča odkrivanje več deset živih mikobakterij v preiskovanem materialu in ima visoko diagnostično vrednost. To je še posebej pomembno pri pregledu materiala novo diagnosticiranih ali zdravljenih bolnikov, ki izločajo majhno število mikobakterij.

V primerjavi z mikroskopijo omogočajo raziskave kultur povečati število odkritih bolnikov s tuberkulozo za več kot 15–25 %, pa tudi preveriti tuberkulozo v zgodnejših fazah, ko je bolezen še vedno enostavno ozdravljiva. Zelo pomembna prednost raziskav kultur velja za možnost pridobitve kulture patogena, ki jo je mogoče identificirati in preučiti glede na občutljivost na zdravila, virulenco in druge biološke lastnosti.

Slabosti metod gojenja vključujejo njihovo trajanje (čakalna doba za materiale doseže 10 tednov), višje stroške in kompleksnost obdelave diagnostičnega materiala.

Načela predsetvene obdelave diagnostičnega materiala

Konvencionalnih mikrobioloških metod ni mogoče uporabiti za izvajanje testov za tuberkulozo. To je posledica dejstva, da tuberkulozne mikobakterije rastejo zelo počasi, večina kliničnih vzorcev pa vsebuje hitro rastoče piogene in gnilobne mikroorganizme in glive. Njihova hitra rast na bogatih hranilnih medijih ovira razvoj mikobakterij in ne omogoča izolacije povzročitelja tuberkuloze, zato je treba diagnostični material pred setvijo predhodno obdelati. Poleg tega so mikobakterije, ki se sproščajo iz bolnikovih dihalnih poti, običajno obdane z veliko količino sluzi, zaradi česar je težko zgostiti. V zvezi s tem je treba sputum in druge podobne materiale pred setvijo utekočiniti in dekontaminirati.

Vsi detergenti in dekontaminanti imajo bolj ali manj izrazit toksičen učinek na mikobakterije. Zaradi obdelave lahko umre do 90 % mikobakterij. Da bi ohranili zadosten delež populacije mikobakterij, je treba uporabiti nežne metode obdelave, ki omogočajo, na eni strani, zatiranje hitro rastočih piogenih in gnilobnih mikroorganizmov, na drugi strani pa maksimalno ohranitev sposobnosti preživetja mikobakterij, prisotnih v materialu.

Glede na material, njegovo homogenost in stopnjo kontaminacije se za predsejanje uporabljajo različna dekontaminanta: za sputum - 4 % raztopina natrijevega hidroksida, 10 % raztopine trinatrijevega fosfata, benzalkonijev klorid trinatrijev fosfat, NALC-NaOH (N-acetil-L-cistein-natrijev hidroksid) s končno koncentracijo NaOH 1 %, za urin in druge tekoče materiale - 3 % raztopina žveplove kisline, za kontaminirane vzorce, materiale, ki vsebujejo maščobe - raztopina oksalne kisline do 5 %. Poleg tega se v nekaterih primerih uporabljajo encimi in površinsko aktivne snovi (detergenti). Uporabo Tween in nekaterih drugih detergentov spremlja manjša smrt mikobakterijskih celic (preživi 40–50 %). Vendar pa se lahko uporabljajo le za tekoče materiale. NALC-NaOH, ki se proizvaja v kompletih, je najbolj razširjen na svetu. Ta metoda omogoča izolacijo več kot 85 % populacije mikobakterijskih celic. Dekontaminacija trdnih materialov, ki vsebujejo tkivo, je težja, saj je težko uganiti stopnjo disperzije materiala med homogenizacijo. Na primer, obdelavo biopsij bezgavk pogosto spremlja povečana pogostost kontaminacije s tujo floro. V tem primeru se lahko uporabi 1% etonij.

Nehomogeni material se homogenizira z uporabo steklenih kroglic v prisotnosti dekontaminantov. Tekoči materiali se predhodno centrifugirajo in obdela se samo usedlina.

Tehnika setve in inkubacije

Po predhodni obdelavi se material centrifugira, kar povzroči oboritev mikobakterij in povečanje njihove vsebnosti v usedlini ("obogatitev usedline"). Nastala usedlina se nevtralizira in inokulira na površino gostih hranilnih medijev ali epruvet s tekočimi (poltekočimi) mediji. Iz preostale usedline se pripravijo razmazi za mikroskopski pregled. Tehnika setve mora preprečevati navzkrižno kontaminacijo diagnostičnega materiala.

Za zanesljivo klinično interpretacijo rezultatov mikrobioloških raziskav je treba upoštevati naslednje pravilo: mikroskopske in kulturne študije je treba izvajati vzporedno iz istega vzorca diagnostičnega materiala.

Inokulirane epruvete se za 2 dni postavijo v termostat pri 37 ^° C v vodoravnem položaju. To zagotavlja bolj enakomerno absorpcijo materiala v hranilni medij. Po 2 dneh se epruvete premaknejo v navpičen položaj in hermetično zaprejo z gumijastimi ali silikonskimi zamaški, da se prepreči izsušitev zasejanega medija.

Pridelki se hranijo v termostatu pri 37 ^° C 10–12 tednov z rednim tedenskim pregledom. Pri vsakem kontrolnem pregledu se zabeležijo naslednji parametri:

• obdobje vizualno opazne rasti od dneva setve;
• stopnja rasti (število CFU);
• kontaminacija kulture s tujo mikrobno floro ali glivami (take epruvete se odstranijo);
• brez vidne rasti. Cevi ostanejo v termostatu do naslednjega pregleda.

Hranilni mediji

Za gojenje mikobakterij se uporabljajo različni hranilni mediji: trdni, poltekoči, tekoči. Vendar noben od znanih hranilnih medijev nima lastnosti, ki bi zagotavljale rast vseh mikobakterijskih celic. V zvezi s tem je za izboljšanje učinkovitosti priporočljivo hkrati uporabljati 2-3 hranilne medije različnih sestav.

Kot standardni medij za primarno izolacijo povzročitelja tuberkuloze in določanje njegove občutljivosti na zdravila SZO priporoča Lowenstein-Jensenov medij. To je gost jajčni medij, na katerem se mikobakterije razvijejo 20. do 25. dan po setvi bakterioskopsko pozitivnega materiala. Setev bakterioskopsko negativnega materiala zahteva daljšo inkubacijsko dobo (do 10–12 tednov).

V naši državi se je razširil jajčni medij Finn-II, ki ga je predlagal E. R. Finn. Razlikuje se po tem, da namesto L-asparagina uporablja natrijev glutamat, ki sproži druge poti za sintezo aminokislin v mikobakterijah. Rast se na tem gojišču pojavi nekoliko prej, pogostost izolacije mikobakterij pa je za 6–8 % višja kot na gojišču Lowenstein-Jensen.

Za povečanje učinkovitosti bakteriološke diagnostike zunajpljučne tuberkuloze je priporočljivo, da se v kompleks hranilnih medijev vključijo modificirani mediji Finn-II. Za pospešitev rasti se v hranilni medij Finn-II dodatno vnese 0,05 % natrijevega tioglikolata, kar zmanjša koncentracijo kisika. Za zaščito encimskih sistemov mikobakterij pred strupenimi produkti lipidne peroksidacije se v hranilni medij Finn-II vnese antioksidant α-tokoferol acetat v koncentraciji 0,001 μg/ml. Diagnostični material se zaseje po standardni metodi.

V ruskih protituberkuloznih laboratorijih se uporabljajo tudi druge modifikacije gostih hranilnih medijev: hranilni medij "Novaya", ki ga je predlagal G. G. Mordovsky, hranilni mediji A-6 in A-9, ki jih je razvil V. Anikin, itd.

Ker med kemoterapijo pride do poškodb različnih presnovnih sistemov mikrobne celice, del mikobakterijske populacije izgubi sposobnost normalnega razvoja na običajnih hranilnih medijih in potrebuje osmotsko uravnotežene (poltekoče ali tekoče) hranilne medije.

Vrednotenje in beleženje rezultatov diagnostične materialne kulture

Nekateri sevi in vrste mikobakterij rastejo počasi, rast se lahko pojavi že do 90. dne. Število takšnih kultur je majhno, vendar to sili seme, da se hranijo v termostatu 2,5-3 mesece.

Virulentne kulture bakterije Mycobacterium tuberculosis običajno rastejo na trdnih jajčnih gojiščih kot kolonije v obliki R-oblike različnih velikosti in videza. Kolonije so suhe, nagubane, slonokoščene barve in rahlo pigmentirane. Na drugih gojiščih so lahko kolonije bakterije Mycobacterium tuberculosis bolj vlažne. Po kemoterapiji ali med zdravljenjem se lahko izolirajo gladke kolonije z vlažno rastjo (oblike S).

Pri izolaciji kultur se uporablja niz posebnih študij za razlikovanje tuberkuloznih mikobakterij od netuberkuloznih mikobakterij in kislinsko odpornih saprofitov.

Pozitiven odgovor se dobi po obveznem mikroskopskem pregledu razmaza iz zraslih kolonij, obarvanih po Ziehl-Neelsenu. V primeru rasti mikobakterij se v razmazih nahajajo svetlo rdeče paličice, ki ležijo posamično ali v skupinah in tvorijo grozde v obliki filca ali pletenic. V mladih kulturah, zlasti tistih, ki so izolirane od bolnikov, ki so se dolgo zdravili s kemoterapijo, se mikobakterije odlikujejo po izrazitem polimorfizmu, do prisotnosti kratkih, skoraj kokoidnih ali podolgovatih variant, ki spominjajo na glivični micelij, skupaj s paličastimi oblikami.

Intenzivnost rasti mikobakterij se določi po naslednji shemi: (+) - 1-20 CFU v epruveti (nizko izločanje bakterij); (++) - 20-100 CFU v epruveti (zmerno izločanje bakterij); (+++) - >100 CFU v epruveti (obilno izločanje bakterij). Pri laboratorijski diagnostiki tuberkuloze ni dovolj le odgovoriti, ali so bile mikobakterije odkrite z določeno metodo ali ne. Potrebno je imeti tudi podrobno predstavo o količini in naravi populacije mikobakterij, njeni sestavi in lastnostih. Prav ti podatki omogočajo pravilno interpretacijo stanja procesa, načrtovanje taktike in pravočasno prilagoditev zdravljenja.

V zadnjih letih so bili za pospešitev rasti mikobakterij predlagani hranilni mediji na osnovi agarja z različnimi rastnimi dodatki in uporaba posebne plinske mešanice. Za dosego rasti mikobakterij na teh medijih se med gojenjem ustvari atmosfera s povečano vsebnostjo ogljikovega dioksida (4–7 %). V ta namen se uporabljajo posebni inkubatorji s CO2 _. Največji razvoj pa so doživeli avtomatizirani sistemi za gojenje mikobakterij: MGIT-BACTEC-960 in MB/Bact.

Eden takšnih sistemov je sistem MGIT (epruveta za indikacijo rasti mikobakterij), ki je visokotehnološki razvoj in je zasnovan za pospešeno bakteriološko diagnostiko tuberkuloze ter določanje občutljivosti mikobakterij na zdravila prve in nekatere druge izbire. MGIT je zasnovan za uporabo kot del naprave VASTEC-960. Mikroorganizmi se gojijo v posebnih epruvetah s tekočim hranilnim gojiščem na osnovi modificiranega gojišča Middlebrook-7H9. Za spodbujanje rasti mikobakterij in zaviranje rasti tuje mikroflore se uporablja dodatek za rast MGIT in mešanica antibakterijskih zdravil PANTA.

Rast mikroorganizmov se registrira optično. Temelji na fluorescenci, ki se pojavi, ko mikobakterije med rastjo porabljajo kisik. Na dnu posebne epruvete je fluorokromsko barvilo, odvisno od kisika, ki je prekrito s plastjo silikona. Razmnoževanje mikobakterij povzroči zmanjšanje količine kisika v epruveti in zmanjšanje njegove koncentracije, kar povzroči povečanje fluorescence, ki postane vidna, ko je epruveta obsevana z ultravijolično svetlobo in jo samodejno registrirajo fotosenzorji, vgrajeni v napravo VASTES-960. Intenzivnost luminiscence se registrira v rastnih enotah (GU). Podatki o rasti se samodejno vnesejo v računalnik, kjer jih je mogoče shraniti. Računalniška analiza rastnih krivulj lahko zagotovi informacije o prisotnosti različnih skupin mikobakterij, vključno z netuberkuloznimi, in pomaga tudi pri ocenjevanju rastnih lastnosti mikobakterij.

Zaradi uvedbe takšnih sistemov se je čas rasti mikobakterij znatno skrajšal, v povprečju je znašal 11 dni na VASTEC-960 in 19 dni na MB/Bact v primerjavi s 33 dnevi na standardnem gostem hranilnem mediju. Treba je opozoriti, da ti sistemi zahtevajo visoko usposobljeno osebje. Setev materiala na tekoča gojišča nujno spremlja setev na Lowenstein-Jensenov medij, ki ima vlogo rezerve v primerih, ko tuberkulozne mikobakterije ne rastejo na drugih gojiščih.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Določanje občutljivosti mikobakterij na zdravila

Določanje spektra in stopnje občutljivosti mikobakterij na protituberkulozna zdravila je zelo klinično pomembno, pa tudi za epidemiološko oceno širjenja tuberkuloze, odporne na zdravila. Poleg tega nam spremljanje odpornosti na zdravila omogoča oceno učinkovitosti protituberkuloznega programa kot celote, saj je sestavni kazalnik delovanja vseh komponent protituberkuloznih ukrepov.

Pogostost in časovni okvir testiranja občutljivosti na zdravila:

• pred začetkom zdravljenja, enkrat za določitev strategije in taktike zdravljenja:
• Pri izolaciji kultur iz različnih materialov pacienta (sputum, BAL, urin, eksudati, cerebrospinalna tekočina itd.) se pregledajo vsi izolirani sevi:
• ob koncu intenzivne faze zdravljenja ob odsotnosti klinične in radiološke dinamike:
• če je treba spremeniti režim zdravljenja v primeru:
  • odsotnost negativnosti sputuma;
  • ponovna kultura po negativnem izvidu sputuma;
  • močno povečanje količine AFB v razmazu po začetnem zmanjšanju. Dobro je znano, da se iz materiala bolnika s tuberkulozo izolirajo sevi Mycobacterium tuberculosis z različno občutljivostjo na zdravila. Občutljivost sevov na protituberkulozna zdravila se lahko razlikuje po spektru zdravil, stopnji, pogostosti in hitrosti razvoja odpornosti.

Stopnja odpornosti Mycobacterium tuberculosis na zdravila se določi v skladu z ustaljenimi merili, ki so osredotočena na klinični pomen odpornosti in so odvisna od protituberkulozne aktivnosti zdravila, njegove farmakokinetike, koncentracije v leziji, največjega terapevtskega odmerka itd.

Določanje občutljivosti mikobakterij na zdravila se trenutno izvaja z mikrobiološkimi metodami:

• absolutne koncentracije (metoda redčenja na trdnih ali tekočih hranilnih medijih),
• razmerja,
• koeficient upora.

Običajno se odpornost kaže v obliki vizualno opazovane rasti kolonij mikobakterij tuberkuloze, vendar obstajajo metode, ki spodbujajo rast v zgodnjih fazah delitve mikobakterijskih celic v obliki barvnih reakcij. Te metode skrajšajo čas testiranja s 3-4 na 2 tedna.

Metoda absolutne koncentracije, ki jo priporoča Odbor za kemoterapijo SZO, se je v Rusiji razširila kot enotna metoda. Z metodološkega vidika je najpreprostejša, vendar zahteva visoko standardizacijo in natančnost laboratorijskih postopkov. Test občutljivosti na zdravila je sestavljen iz niza epruvet s hranilnim medijem, modificiranim s protituberkuloznimi zdravili. Komplet je sestavljen iz 2-3 epruvet z različnimi koncentracijami vsakega od uporabljenih zdravil, ene kontrolne epruvete z medijem brez zdravila in ene epruvete, ki vsebuje 1000 μg/ml natrijevega salicilata ali 500 μg/ml paranitrobenzojske kisline za odkrivanje rasti netuberkuloznih mikobakterij.

Za pripravo kompleta gojišča s pripravki uporabite modificirano gojišče Lowenstein-Jensen (brez škroba), ki ga vlijete v bučke. V vsako bučko dodajte določeno količino ustrezne razredčitve protituberkuloznega zdravila. Vsebino bučk dobro premešajte, vlijte v epruvete in koagulirajte v nagnjenem položaju 40 minut pri temperaturi 85 °C. Priporočljivo je koagulirati gojišče v električnem koagulatorju z avtomatskim nadzorom temperature. Gojišče s protituberkuloznimi zdravili

1. vrsto lahko shranjujemo v hladilniku pri 2-4 °C 1 mesec, zdravila 2. vrste pa največ 2 tedna. Shranjevanje gojišča z zdravili pri sobni temperaturi je nesprejemljivo. Pri pripravi raztopin protituberkuloznih zdravil se upošteva njihova aktivnost, pri čemer se koncentracija izračuna s prilagoditvijo za molekulsko maso nespecifične sestavine zdravila, čistost itd. Za določanje občutljivosti na zdravila se uporabljajo samo kemično čiste snovi.

Načelo metode je določiti koncentracijo protituberkuloznega zdravila, ki zavira rast znatnega dela populacije mikobakterij. Ob pravilni izvedbi ima ta metoda dobro zanesljivost.

Pred izvedbo testa je treba zagotoviti, da izolirana kultura Mycobacterium tuberculosis ne vsebuje tuje mikroflore. Iz kulture mikobakterij v 0,9 % raztopini natrijevega klorida pripravimo homogeno suspenzijo, ki vsebuje 500 milijonov mikrobnih teles v 1 ml (optični standard motnosti 5 enot). Nastalo suspenzijo razredčimo z 0,9 % raztopino natrijevega klorida (1:10) in v vsako epruveto kompleta hranilnih medijev dodamo 0,2 ml suspenzije. Inokulirane epruvete postavimo v termostat pri 37 °C in jih 2–3 dni hranimo vodoravno, tako da je poševna površina hranilnega medija enakomerno inokulirana s suspenzijo Mycobacterium tuberculosis. Nato epruvete premaknemo v navpičen položaj in inkubiramo 3–4 tedne. Rezultate zabeležimo po 3–4 tednih.

Ker je čas, potreben za izolacijo patogena iz kliničnega materiala na hranilnih medijih, vsaj 1-1,5 meseca, je rezultate določanja občutljivosti na zdravila s to metodo mogoče dobiti šele 2-2,5 meseca po setvi materiala. To je ena glavnih pomanjkljivosti metode.

Rezultati testiranja občutljivosti mikobakterij na zdravila se interpretirajo na podlagi določenih meril. Na trdnih gojiščih se kultura šteje za občutljivo na koncentracijo zdravila, ki ga gojišče vsebuje, če število mikobakterijskih kolonij, vzgojenih v dani epruveti z zdravilom, ne presega 20 z obilno rastjo v kontrolni epruveti brez zdravil. Le če je več kot 20 kolonij, se kultura šteje za odporno na dano koncentracijo. V praksi je treba, ko se v epruvetah dobijo rezultati rasti blizu 20 CFU, obvestiti klinično enoto, da je občutljivost ali odpornost v tem primeru mejna, saj lahko to včasih pojasni nejasno dinamiko kliničnih kazalnikov.

Za različne pripravke se določi določena koncentracija, pri kateri opazimo razmnoževanje kritičnega deleža mikobakterijske populacije. Te koncentracije se imenujejo "kritične". Kot merilo za stabilnost se uporablja velikost rasti mikobakterijske populacije na hranilnem mediju s pripravkom v kritični koncentraciji.

V domači praksi ftiziologije pri določanju odpornosti na zdravila niso omejeni le na določanje kritičnih koncentracij. To je posledica dejstva, da razširjena opredelitev stopnje odpornosti patogena na zdravila omogoča zdravniku, da z uporabo znanja o potencirajočem učinku kombinacij zdravil pravilneje oblikuje taktiko kemoterapije, predvidi navzkrižno odpornost ali uporabi učinkovitejša zdravila iz uporabljene skupine protituberkuloznih zdravil.

Metoda absolutne koncentracije je najpreprostejša, a tudi najbolj občutljiva na napake pri njeni izvedbi. Zanesljivejša, zlasti pri določanju občutljivosti na zdravila druge izbire, in razširjena zunaj Rusije je metoda sorazmerja. Upošteva pomanjkljivosti metode absolutne koncentracije, vendar je njena izvedba bolj delovno intenzivna.

Metoda je zelo podobna metodi absolutne koncentracije. Priprava epruvet z zdravili je enaka kot pri metodi absolutne koncentracije. Vendar se semenski odmerek suspenzije tuberkulozne mikobakterije zmanjša za 10-krat, kar odpravi pogostost spontane odpornosti nekaterih sevov tuberkulozne mikobakterije na zdravila, kot so etambutol, protionamid, kapreomicin. Kot kontrole se uporabijo 2 ali 3 epruvete s semenskim odmerkom, enakim tistemu v epruvetah, zaporedno razredčene 10- in 100-krat. Kriterij za odpornost je delež vizualno opazovane rasti tuberkulozne mikobakterije. Za zdravila 1. izbire je kriterij za odpornost presežna rast 1 % začetne populacije, za zdravila 2. izbire pa rast 1 ali več kot 10 % začetne, odvisno od izbrane kritične koncentracije.

Leta 1997 je delovna skupina SZO in Mednarodne zveze proti tuberkulozi za odkrivanje odpornosti na protituberkulozna zdravila prilagodila ta merila in predlagala, da se mikobakterije, ki rastejo na gostem jajčnem mediju Lowenstein-Jensen pri naslednjih koncentracijah, štejejo za odporne:

• dihidrostreptomicin - 4 μg/ml;
• izoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicin - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

Leta 2001 so bile za naslednja zdravila druge izbire predlagane kritične koncentracije (za kritični delež 1 %):

• kapreomicin - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamicin - 30 μg/ml;
• viomicin - 30 μg/ml;
• cikloserin - 40 mcg/ml;
• aminosalicilna kislina - 0,5 mcg/ml;
• ofloksacin - 2 mcg/ml.

Rezultati rasti se ocenijo po 4 tednih kot predhodni in po 6 tednih gojenja kot končni.

Za določanje občutljivosti na pirazinamid, ki se pogosto uporablja v sodobni kemoterapiji tuberkuloze, je priporočena kritična koncentracija 200 μg/ml. Vendar pa še vedno ni splošno sprejete metode za določanje odpornosti na to zdravilo na trdnih hranilnih medijih, saj se njegova antibakterijska aktivnost kaže le v kislem okolju (pH < 6), ki ga je tehnično težko vzdrževati. Poleg tega številne klinične kulture Mycobacterium tuberculosis neradi rastejo na jajčnih medijih s kislim okoljem.

Za oceno kakovosti rezultatov določanja občutljivosti mikobakterij na zdravila je priporočljivo, da se vsako novo serijo gojišča Lowenstein-Jensen kontrolira z vzporednim določanjem občutljivosti standardnega muzejskega seva H37Rv. Poleg tega obstajajo določeni mikrobiološki kriteriji, ki morajo biti izpolnjeni, da metode dajo dobro ponovljiv in pravilno interpretiran rezultat. Sem spadajo sposobnost preživetja kulture tuberkuloznih mikobakterij, pravila za pridobivanje homogene suspenzije in suspenzije, pravila za izbiro kultur tuberkuloznih mikobakterij in reprezentativnost izbrane bakterijske mase. Zanesljivost določanja odpornosti na zdravila se zmanjša pri izjemno slabem izločanju bakterij.

V zadnjem času je bila metoda določanja občutljivosti na zdravila z uporabo avtomatiziranih sistemov prepoznana kot obetavna. Najbolj napredni na tem področju so razvoji, ki temeljijo na VASTEC MGIT-960. V tem primeru se občutljivost tuberkuloznih mikobakterij na zdravila določa na podlagi metode modificiranega razmerja. Med določanjem se primerja stopnja rasti tuberkuloznih mikobakterij v kontrolni epruveti in v epruvetah z zdravili. Za določanje občutljivosti na streptomicin, izoniazid, rifampicin in etambutol se uporabljajo obogatitveni dodatki in antibiotiki, ki so vključeni v komplet SIRE. Za določanje občutljivosti na pirazinamid se uporablja komplet PZA. Med preskusom se epruvete z zdravili inokulirajo s suspenzijo tuberkuloznih mikobakterij, kontrolne epruvete pa s 100-kratno razredčitvijo suspenzije za vsa zdravila, razen pirazinamida, kjer je razredčitev suspenzije 10-kratna. Kriterij za stabilnost je indikator rasti mikobakterij 100 GU, ko rast v kontrolni epruveti doseže 400 GU (glejte "Gulturne metode za izolacijo mikobakterij"). Rezultati se samodejno zabeležijo in interpretirajo ter jih nastavi vneseni ali izbrani program.

Končne koncentracije v epruveti s tekočim hranilnim medijem se uporabljajo kot kritične koncentracije. Trenutno so kritične koncentracije razvite tako za zdravila prve izbire kot za nekatera zdravila druge izbire. Treba je opozoriti, da se določanje občutljivosti tuberkuloznih mikobakterij na cikloserin in aminosalicilno kislino izvaja samo na jajčnih hranilnih medijih.

Podroben protokol za delo z opisanim sistemom omogoča testiranje občutljivosti na zdravila tako na izolirani kulturi (z gostim hranilnim medijem) kot tudi z uporabo primarne rasti mikobakterij v epruveti MGIT. Slednja možnost znatno skrajša čas, potreben za izvajanje kulturnih študij, saj omogoča pridobitev popolnih rezultatov kulture tuberkuloznih mikobakterij (vključno s podatki o občutljivosti na zdravila) v 3 tednih po odvzemu materiala, medtem ko tradicionalna metoda to lahko zagotovi šele v 3. mesecu. Pravočasni rezultati, ko je bolnik v intenzivni fazi zdravljenja, lahko nadomestijo relativno visoke stroške študij.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Diferenciacija mikobakterij

Glede na to, da uporabljeni hranilni mediji niso strogo selektivni, se šteje, da je naknadna diferenciacija izoliranih mikobakterij obvezna. Potreba po diferenciaciji mikobakterij je posledica številnih značilnosti patoloških procesov, ki jih povzročajo predstavniki rodu: različen potek in izid tuberkuloze in mikobakterioze ter prisotnost naravne odpornosti na nekatera protituberkulozna zdravila.

Znano je, da se primarna identifikacija mikobakterij kompleksa M. tuberculosis od netuberkuloznih mikobakterij izvaja v skladu z naslednjimi značilnostmi: stopnja rasti na gostih hranilnih medijih, tvorba pigmentov, morfologija kolonij, prisotnost odpornosti na kisline in temperaturni optimum za rast.

Žal ni ene same laboratorijske metode, ki bi lahko zanesljivo ločila mikobakterije kompleksa M. tuberculosis od drugih kislinsko odpornih mikobakterij; vendar pa kombinacija zgoraj opisanih znakov z rezultati številnih spodaj navedenih biokemijskih testov omogoča identifikacijo mikobakterij kompleksa M. tuberculosis z verjetnostjo do 95 %.

Za razlikovanje mikobakterij kompleksa M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii in druge) od počasi rastočih netuberkuloznih mikobakterij se uporabljajo osnovni biokemični testi za ugotavljanje prisotnosti naslednjih znakov:

• sposobnost tvorbe nikotinske kisline (niacinov test):
• aktivnost nitratne reduktaze;
• termostabilna katalaza;
• rast na gojišču z natrijevim salicilatom (1 mg/ml).

Kot dodaten test se lahko uporabijo tudi testi rasti na gojišču, ki vsebuje 500 μg/ml para-nitrobenzojske kisline ali 5 % natrijevega klorida.

Mnogi bakteriološki laboratoriji te mikroorganizme identificirajo le na kompleksni ravni, kar je posledica omejenih zmogljivosti laboratorijev in metodoloških zmožnosti specialistov.

V večini primerov v praksi za razlikovanje med M. tuberculosis in M. bovis zadostujejo naslednji testi: niacin, nitrat reduktaza, pirazinamidaza in registracija rasti na gojišču, ki vsebuje 2 μg/ml tiofen-2-karboksilnega hidrazida. Upošteva se, da so mikobakterije kompleksa M. tuberculosis značilne po naslednjem naboru značilnosti:

• počasna rast (več kot 3 tedne);
• temperatura rasti znotraj 35-37 ^° C;
• odsotnost pigmentacije (slonokoščena barva);
• izrazito kislinsko odporno obarvanje;
• pozitiven test niacina;
• pozitiven test nitratne reduktaze;
• odsotnost termostabilne katalaze (68 ^° C).
• odsotnost rasti na gojišču Lowenstein-Jensen, ki vsebuje:
  • 1000 µg/ml natrijeve salicilne kisline,
  • 500 mcg/ml para-nitrobenzojske kisline,
  • 5 % natrijev klorid:
• rast v prisotnosti 1–5 μg/ml tiofen-2-karboksilne kisline.

Pomen diferenciacije izoliranih mikobakterij se bo znatno povečal z naraščajočo pogostostjo registracije primerov HIV/AIDS, povezanih s tuberkulozo ali mikobakteriozo. Trenutno ni absolutne gotovosti o pripravljenosti praktičnih regionalnih laboratorijev za pravilno opravljanje tega obsega dela.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Imunološka diagnostika tuberkuloze

Obstaja vrsta univerzalnih pojavov, pripravkov in imunoloških testov, ki so bili sprva odkriti posebej pri tuberkulozi ali v modelu imunskega odziva na mikobakterije. Mednje spadajo BCG in tuberkulin, pojav, kot je kožni DST (tuberkulinski testi - Pirquetova in Mantouxova reakcija), reakcija na subkutano dajanje tuberkulina senzibiliziranim živalim (Kochov fenomen). Nekatera prva protitelesa pri nalezljivih boleznih so bila odkrita tudi pri tuberkulozi. Seveda, globlje kot je razumevanje mehanizmov protituberkulozne imunosti in njihovega genetskega nadzora, širša je lahko uporaba imunoloških metod in pripravkov, ki vplivajo na imunost, za reševanje praktičnih problemov ftiziologije.

Trenutno najpomembnejši in najzahtevnejši praktični problem velja za odkrivanje tuberkuloze v procesu množičnega presejanja prebivalstva. Vendar pa kljub številnim poročilom o "uspehih" (na omejenem materialu) ni imunološke metode (ki bi jo bilo mogoče ponovljivo uporabiti v "katerih koli rokah") ali zdravila, primernega za te namene.

V klinični praksi se pogosto uporabljajo imunološke metode, zlasti serološke študije (določanje antigenov, protiteles) in tuberkulinski provokacijski testi.

Serološke metode, ki določajo antigene in protitelesa v različnih telesnih okoljih, so na prvem mestu med imunološkimi študijami, ki se uporabljajo v diferencialni diagnostiki.

Specifičnost določanja protiteles proti mikobakterijam tuberkuloze je odvisna od antigenov, uporabljenih pri imunski analizi. Predlaganih je bilo veliko število antigenov, prvi med njimi je tuberkulin PPD:

• PPD in drugi kompleksni pripravki iz gojitvene tekočine;
• ultrazvočni dezintegrator;
• Tritonov izvleček in drugi kompleksni pripravki celičnih sten;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomanan;
• faktor vrvice (trehaloza-6,6-di-mikolat);
• fenolni in drugi glikolipidi;
• lipopolisaharidi;
• antigen, ki veže fibronektin;
• beljakovine (najpogosteje rekombinantne); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA itd.

Kot rezultat dolgoletnih raziskav ruskih in tujih znanstvenikov so bili ugotovljeni glavni vzorci nastajanja protiteles in učinkovitost serološke diagnostike tuberkuloze: bolj kompleksen kot je antigen, višja je občutljivost in nižja specifičnost testov. Specifičnost se v različnih državah razlikuje glede na okužbo prebivalstva z M. tuberculosis in netuberkuloznimi mikobakterijami, od cepljenja BCG itd. Pri otrocih je informativnost serodiagnostike nižja kot pri odraslih. Pri primarni tuberkulozi (pogosteje pri otrocih) je določanje IgM bolj informativno; pri sekundarni tuberkulozi - IgG. Pri okuženih z virusom HIV je informativnost serodiagnostike pri določanju protiteles zmanjšana. Učinkovitost določanja protiteles je odvisna od številnih "kliničnih trenutkov": aktivnosti procesa (prisotnost ali odsotnost "izolacije" mikobakterij, prisotnost gnilobnih votlin, stopnja infiltracije), razširjenosti procesa, trajanja njegovega poteka.

Občutljivost metode encimskega imunskega testa (EIA) je približno 70 %. Nezadostna učinkovitost študije je posledica njene nizke specifičnosti. Predhodno so bile preučene možnosti uporabe serološkega presejanja pri skupinah z visokim tveganjem, zlasti pri ljudeh s posttuberkuloznimi spremembami v pljučih.

Za povečanje specifičnosti testa ELISA se iščejo bolj specifični antigeni, vključno s tistimi, pridobljenimi z genskim inženiringom: ESAT-6 itd. (glej zgoraj). Uporaba strogo specifičnih antigenov (38 kDa, ESAT) poveča specifičnost, vendar znatno zmanjša občutljivost analize. Poleg testa ELISA (eksperimentalni laboratorijski testni sistemi, kot je Pathozyme ELISA kit) so na voljo tudi imunokromatografski kompleti z lateralno filtracijo (Mycodot) in drugi podobni testi (membranska dot analiza) z vizualno oceno rezultata testa. Pri izvajanju teh testov analiza traja 10–30 minut; ne zahtevajo posebne opreme, zahtevajo vizualno oceno rezultatov, kar je povezano z določeno subjektivnostjo. Te metode imajo približno enake značilnosti občutljivosti in specifičnosti (70 % oziroma 90–93 %) kot tradicionalni test ELISA.

Uporaba imunoloških analitskih metod ima določeno vrednost kot dodatna metoda, ki se upošteva v kompleksu metod, ki se uporabljajo pri diferencialni diagnozi tuberkuloze, zlasti pri diagnozi njenih zunajpljučnih oblik. Metoda ELISA je najučinkovitejša pri diagnozi tuberkuloznega meningitisa pri pregledu cerebrospinalne tekočine. V tem primeru je občutljivost analize 80–85 %, specifičnost pa 97–98 %. Obstajajo podatki o učinkovitosti določanja protiteles proti Mycobacterium tuberculosis v solzni tekočini pri diagnozi tuberkuloznega uveitisa.

Indukcija sinteze gama interferona in vitro

Gama interferon (IFN-γ) je dejavnik specifične imunske zaščite, ki se doseže z aktivacijo encimskih sistemov makrofagov. Indukcijo sinteze IFN-γ s strani senzibiliziranih T-limfocitov povzroči njihova interakcija z mikobakterijskimi antigeni.

Kot antigeni se uporabljajo tako tuberkulinski PPD kot specifični antigeni, pridobljeni z genskim inženiringom, zlasti antigen ESAT-6 (zgodnje izločeni antigen z molekulsko maso 6 kDa) in CFP-10 (protein filtrata kulture, 10 kDa). Gensko spremenjeni ali rekombinantni antigeni so odsotni v celicah cepiva BCG in drugih mikobakterij. Pri uporabi tuberkulina so rezultati indukcijskega testa IFN-γ primerljivi z rezultati tuberkulinskega kožnega testa (neposredna korelacija). Pri uporabi gensko spremenjenih antigenov so rezultati testa bolj specifični in niso odvisni od predhodnega cepljenja BCG. Pri pregledu cepljenih posameznikov, ki niso bili v stiku z okuženo s tuberkulozo, je specifičnost testa 99 %. Občutljivost testa pri bolnikih s tuberkulozo se giblje od 81 do 89 %.

Razviti so bili testi in diagnostika, ki temeljijo na kratkotrajni gojitvi polnih krvnih celic ali mononuklearnih celic, izoliranih iz krvi z antigeni tuberkuloznih mikobakterij in vitro, čemur sledi določanje koncentracije IFN-γ ali štetje števila T-limfocitov, ki sintetizirajo IFN-γ. Koncentracija interferona, sintetiziranega v epruveti, se določi z ELISA testom z uporabo monoklonskih protiteles, ki vežejo IFN-γ. Nato se s kalibracijo standardnega IFN-γ določi njegova koncentracija v epruveti ali vdolbinicah plošče.

V Elispot testu se število celic T, ki sintetizirajo IFN-γ, prešteje na površini posode, prevlečene s protitelesi proti IFN-γ.

Razvijalci in vitro diagnostičnega testa z indukcijo IFN-γ, ki ga je odobrila ameriška Uprava za hrano in zdravila (FDA), trdijo, da test ne more razlikovati latentne tuberkulozne okužbe od aktivne tuberkuloze. Zato v regijah z visoko stopnjo okužb test nima neposredne diagnostične vrednosti. Vendar pa se v naši državi lahko uporablja za razlikovanje tuberkulozne okužbe pri otrocih od alergije po cepljenju, pa tudi za oceno ravni specifične imunosti med zdravljenjem.

Trenutno se preučuje domači testni sistem za določanje indukcije sinteze IFN-γ s specifičnimi tuberkuloznimi antigeni in vitro.

Imunski status in potek tuberkuloze, imunokorekcija

Med zdravljenjem tuberkuloze se pri ljudeh pojavijo spremembe v antigenemiji in stanju imunskega sistema.

Podatki o spremembah v eksudatih in tkivih so v veliki meri protislovni. Edino, kar lahko upravičeno ugotovimo, je, da tuberkulozni granulomi praviloma vsebujejo znatno število aktiviranih T-limfocitov.

Smiselno se je osredotočiti še na dve točki, ki sta potrebni za razumevanje vloge imunoloških mehanizmov pri zdravljenju tuberkuloze pri ljudeh:

• Pri bolnikih z aidsom je pojavnost večkratne odpornosti na zdravila še posebej visoka;
• V primeru večkratne odpornosti na zdravila (in ob odsotnosti okužbe z virusom HIV) so imunske motnje (predvsem imunost celic T) še posebej pomembne.

Pri tuberkulozi se pogosto uporabljajo različne metode imunokorekcije: najprej so to zdravila, ki delujejo predvsem na imunost T-celic in mononuklearni fagocitni sistem (timusni hormoni, izofon, likopid, polioksidonij itd.), pa tudi celotne (oslabljene) mikobakterije in njihove komponente.

Molekularno biološka diagnostika tuberkuloze

Molekularno biološke metode v diagnostiki nalezljivih bolezni vključujejo predvsem metode, ki temeljijo na manipulaciji genomskih materialov bakterijskih in virusnih patogenov z namenom identifikacije specifičnega genskega materiala - odsekov DNK z nukleotidnim zaporedjem, specifičnim za določeno vrsto ali sev patogena, za analizo specifičnih zaporedij DNK v genih, ki določajo občutljivost patogena na določena zdravila, kot tudi za analizo funkcionalne aktivnosti določenih genov patogena. Molekularno biološke metode so se razširile v znanstvene raziskave in praktično uporabo v diagnostiki in spremljanju različnih bakterijskih in virusnih okužb po odkritju verižne reakcije s polimerazo leta 1985, ki jo je izvedla Carrie Mullis (Nobelova nagrajenka leta 1989).

Načela in zmogljivosti metode verižne reakcije s polimerazo

PCR omogoča amplifikacijo (pomnožitev) nukleotidnega zaporedja (fragmenta patogene DNK) v epruveti v nekaj urah za milijonkrat. Izvedba reakcije v prisotnosti posameznih verig DNK določa izjemno visoko občutljivost analize.

Nukleotidno zaporedje določenih odsekov verige DNK določa genetsko edinstvenost mikroorganizma, kar pojasnjuje visoko specifičnost PCR.

Pomen te metode za odkrivanje in preučevanje značilnosti Mycobacterium tuberculosis je posledica bioloških značilnosti mikroorganizma, ki ima zelo počasno rast: čas podvojitve DNK Mycobacterium tuberculosis med njihovo gojenjem je 12-24 ur.

Načelo metode PCR je amplifikacija - večkratno, milijonkratno množenje odsekov specifičnega zaporedja DNK v mikrovolumnu epruvete s cikličnim ponavljanjem naslednjih treh reakcijskih stopenj, od katerih vsaka poteka v drugačnem temperaturnem režimu:

• Faza I - denaturacija dvoverižne DNK pri segrevanju z divergenco njenih verig;
• Faza II - komplementarna vezava (hibridizacija) začetnih oligonukleotidov (priming oligonukleotidov) s končnimi odseki verig strogo specifičnega fragmenta DNA, izbranega za amplifikacijo;
• Faza III – dokončanje verige fragmentov DNK z uporabo termostabilne DNK polimeraze.

Za amplifikacijo mora epruveta vsebovati molekule matrične DNK. Štiri vrste deoksinukleozidnih trifosfatov (nukleotidov), ki vsebujejo ustrezne dušikove baze: adenin (A), timin (T), gvanin (G), citozin (C); umetno sintetizirane oligonukleotide za začetnike (primerje), ki so sestavljeni iz 18-20 baznih parov; termostabilen encim, DNK polimeraza, s temperaturnim optimumom 68-72 ^° C in magnezijeve ione.

Specifičnost PCR je odvisna od izbire fragmenta DNK. V skladu z njo se sintetizirajo bočni začetni oligonukleotidi. Specifičnost hibridizacije in dokončanja verige DNK je določena z načelom komplementarnosti naslednjih parov dušikovih baz: adenin-timin, gvanin-citozin.

Za določitev genoma mikobakterij tuberkuloznega kompleksa je v večini testnih sistemov najučinkovitejša tarča amplifikacije fragment DNA IS6110, ki ima v večini sevov mikobakterij tuberkuloze znatno število (10-20) ponovitev v genomu, kar poleg specifičnosti zagotavlja tudi visoko občutljivost analize. Hkrati so bili opisani sevi mikobakterij tuberkuloze z majhnim številom ponovitev ali odsotnostjo fragmenta IS6110.

Ekstrakcija molekul DNK iz biološkega vzorca

Za izvedbo PCR je treba iz biološkega materiala izolirati molekule DNK patogena v minimalnem volumnu, z minimalno količino nespecifične DNK in različnimi zaviralci encima - DNK polimeraze.

Priprava vzorcev mora potekati v pogojih, ki preprečujejo navzkrižno kontaminacijo preučevanih vzorcev z izoliranimi molekulami DNK. To zahteva predhodno obdelavo prostora z ultravijolično svetlobo, tal in delovnih površin miz in naprav pa z raztopinami, ki vsebujejo klor. Prav tako je treba uporabljati čiste rokavice, epruvete za enkratno uporabo in konice za avtomatske pipete.

Za izolacijo DNK Mycobacterium tuberculosis iz kliničnih vzorcev (cerebrospinalna tekočina, bronhialna lavaža), ki ne vsebujejo velikega števila levkocitov, celičnih ostankov ali soli, zadostuje, da vzorec centrifugiramo pri 3-4 tisoč vrtljajih na minuto, usedlini dodamo 20-30 µl 2% raztopine Tritona X-100 in segrevamo pri 90 ^° C 30 minut.

Priprava vzorca sputuma zahteva učinkovito utekočinjanje, običajno z uporabo 4 % natrijevega hidroksida in N-acetil-L-cisteina (NALC) v koncentraciji 50–80 mg na vzorec, odvisno od viskoznosti vzorca. Raztopino NALC je treba pripraviti ex tempore ali pa se prašek NALC doda suh neposredno vzorcu. Po utekočinjanju je treba vzorce centrifugirati 15 minut pri 3500–4000 vrt/min (3000 g) v 50 ml epruvetah z navojnim zamaškom, tj. pod enakimi pogoji, kot so priporočeni za pripravo sputuma pred kulturo.

Za ekstrakcijo DNK iz usedline se najpogosteje uporablja metoda, ki temelji na uporabi 5-6 molarne raztopine gvanidin izotiocianata kot lizirajočega reagenta in mikroporoznih delcev silicijevega oksida ("diatomejska zemlja"), ki sorbirajo molekule DNK. Nespecifične snovi, vključno z morebitnimi inhibitorji, se nato sperejo v 2,5 molarni raztopini gvanidin izotiocianata in raztopini etanola, nakar se molekule DNK desorbira v vodi in ti vzorci se uporabijo za izvedbo PCR. Za poenostavitev tehnologije ekstrakcije DNK se "diatomejska zemlja" pogosto nadomesti z magnetnimi mikrodelci, prevlečenimi s silicijevim oksidom. V tem primeru se za obarjanje delcev namesto centrifugiranja uporablja posebno magnetno stojalo za mikroepruvete.

V Rusiji je bila razvita originalna metoda imunomagnetne ločitve mikobakterij z naknadno ekstrakcijo patogene DNK. Za imunomagnetno ločitev tuberkuloznih mikobakterij se uporabljajo ferodelci velikosti 3-5 μm, prevlečeni s silicijevim oksidom, na katere se s kemično vezjo pritrdijo poliklonska (zajčja) protitelesa proti tuberkuloznim mikobakterijam. Vzorce sputuma po alkalni lizi nevtraliziramo s kislo raztopino Tris-HCl in inkubiramo z imunomagnetnim sorbentom. Nato imunoferodelce zberemo z magnetno palico z zamenljivo konico, prenesemo v mikroepruveto in oborimo. Dodamo 20-30 μl 2% raztopine Triton X-100 in segrevamo 30 minut pri 90 ^° C. Supernatant se uporabi kot matrica DNK za PCR analizo.

Težaven problem je ekstrakcija DNK tuberkulozne mikobakterije iz biopsijskih vzorcev. Za lizo biopsije se uporablja encim proteinaza K v končni koncentraciji 200–500 mg/l pri temperaturi 56 ^° C čez noč. Nato se ekstrahira z eno od znanih metod. Presežek nespecifične DNK v PCR analizi biopsijskih vzorcev pogosto povzroči zaviranje reakcije, kar zahteva ponovno ekstrakcijo DNK.

Metode zaznavanja rezultatov

Po zaključku reakcije se amplificirani fragmenti patogene DNA identificirajo z različnimi metodami.

Metoda gelske elektroforeze je dobro znana. V tem primeru se dobljeni fragment DNK identificira s pozitivno kontrolo, ki vsebuje želeni specifični fragment DNK, ali s predhodno znano velikostjo (številom nukleotidnih parov) fragmenta, ki se določi s standardnim molekularnim markerjem.

V prisotnosti specifičnega barvila - etidijevega bromida, ki je vključen v dvoverižno DNK, se sintetizirani fragment DNK razkrije kot trak, ki sveti pod vplivom ultravijolične svetlobe.

Velikost fragmenta DNK, določena z elektroforezo na podlagi prepotovane razdalje od začetka, mora ustrezati znanemu markerju molekulske mase ali pozitivni kontroli.

Druge metode za določanje rezultatov PCR temeljijo na hibridizaciji enoverižnih produktov PCR s komplementarnim oligonukleotidom - sondo DNA, označeno z biotinom, čemur sledi detekcija z uporabo encimske reakcije, na primer z vezavo konjugata streptavidin-alkalne fosfataze na biotin.

Na podlagi te vrste detekcije so bili ustvarjeni analizatorji PCR, pri katerih se detekcija rezultatov PCR izvede samodejno kot posledica odčitavanja optične gostote v vzorcih po končani encimski reakciji.

Slabosti teh metod vključujejo možnost kontaminacije znotraj laboratorija z dokaj kratkimi fragmenti molekul DNK. Ko te molekule vstopijo v na novo testirane vzorce, postanejo matrica za PCR in vodijo do lažno pozitivnih rezultatov.

V zvezi s tem so za preprečevanje lažno pozitivnih rezultatov uvedena stroga pravila za ločevanje in izolacijo prostorov: za ekstrakcijo DNK iz bioloških vzorcev; prostorov za detekcijo rezultatov (elektroforeza) od čiste cone. Ti prostori predstavljajo območje verjetne kontaminacije. Drugo izolirano območje je čista soba za vnos preučevanih vzorcev DNK v epruvete z reakcijsko mešanico za PCR. In končno se predvideva, da je treba glavno napravo - ojačevalnik DNK - odnesti v ločen, po možnosti pisarniški prostor.

Da bi preprečili kontaminacijo s produkti prejšnjih reakcij - amplikoni, nekateri PCR testni sistemi namesto deoksinukleozidnega timidina vsebujejo deoksinukleozidni uridin, ki se med in vitro sintezo verige vgradi na ustrezno mesto, tj. dušikovo bazo timin, prisotno v nativni DNK, nadomesti uracil. Uracilna DNK glikozilaza, dodana reakcijski zmesi analiziranega materiala, uniči le kontaminirajoče fragmente z deoksiuridinom, ne pa tudi nativne analizirane DNK, ki vsebuje deoksitimidin. Nadaljnje segrevanje pri 94 ^° C inaktivira ta encim in ne moti amplifikacije v PCR.

Obstaja testni sistem, ki temelji na izotermni amplifikaciji rRNA, pri katerem se najprej izvede reverzna transkripcija in sinteza molekul DNK, ki nato služijo kot matrica za nadaljnjo sintezo molekul RNK. Amplikoni RNK se detektirajo z uporabo z akridinom obarvane DNK sonde med hibridizacijo v raztopini reakcijske epruvete. Ta metoda ima poleg visoke občutljivosti prednost, da analizo izvaja v eni epruveti, kar preprečuje kontaminacijo. Po mnenju avtorjev občutljivost te metode v vzorcih dihal doseže 90 % s specifičnostjo 99–100 %.

V PCR v realnem času se uvajajo nove metode detekcije. Te metode se razlikujejo predvsem po tem, da se PCR in detekcija njenih rezultatov izvajata hkrati v eni zaprti epruveti. To ne le tehnološko poenostavi metodo analize, temveč tudi prepreči kontaminacijo laboratorijskih prostorov in vzorcev s produkti prejšnje PCR.

Pri PCR v realnem času se rezultati zaznavajo s fluorescenco, ki nastane pri hibridizaciji fluorogene DNA sonde s specifičnim fragmentom DNA, pomnoženim med PCR. Struktura fluorogenih DNA sond je zgrajena tako, da se fluorescenčni marker sprosti kot posledica encimske reakcije ali pa se od molekule dušilca fluorescence distancira šele ob specifični hibridizaciji z želeno molekulo DNA, pomnoženo med PCR. Ko se število molekul, hibridiziranih s sondo, poveča, je povečanje fluorescence na zaznavno raven sorazmerno s številom molekul pomnoženega produkta. Ker se število molekul fragmentov DNA med vsakim ciklom PCR podvoji, je številka cikla, od katerega se zaznava in povečuje fluorescenca, obratno sorazmerna s številom molekul DNA v prvotnem vzorcu. Če v reakcijo kot kalibrator vnesemo več različnih znanih koncentracij molekul ustreznega fragmenta DNA tuberkulozne mikobakterije, lahko število genomov DNA v preučevanem materialu izračunamo z računalniškim programom.

Vsak standardni vzorec je podvojjen. Kvantitativno merilo je minimalno število ciklov PCR, potrebno za pojav in rast zaznavne fluorescence. Abscisa predstavlja število ciklov, ordinata pa vrednost fluorescence. Koncentracije DNK so obratno sorazmerne s številom ciklov, potrebnih za pojav fluorescence. Okna v desnem stolpcu (21–32) prikazujejo število ciklov za ustrezne koncentracije. Razlike med 10-kratnimi koncentracijami fragmentov DNK 10² ^– 10⁶ ^ml znašajo 3,2–3,4 cikla. Pri dveh bolnikih sta bili koncentraciji fragmentov IS6110 približno 10³ ^/ ml in ^10⁴ /ml. Ob upoštevanju števila ponovitev (6–20) analiziranih fragmentov v genomu Mycobacterium tuberculosis je število Mycobacterium tuberculosis v kliničnih vzorcih približno 100 oziroma 1000 celic.

Uporaba PCR pri diagnozi tuberkuloze

Metoda PCR se v največji meri uporablja za hitro diagnozo tuberkuloze - odkrivanje Mycobacterium tuberculosis v kliničnih vzorcih: sputumu, bronhialnih izpirkih, plevralnem eksudatu, urinu, cerebrospinalni tekočini, punktatih osteolize, aspiratih ženskega genitalnega trakta in različnih biopsijah. V študiji na Nizozemskem, ki je zajela približno 500 vzorcev sputuma in bronhialnih izpirkov 340 bolnikov s potrjeno diagnozo pljučne tuberkuloze, so proučevali primerjalno občutljivost metod PCR, kulture in mikroskopije razmaza. Občutljivost analize je bila 92,6 %, 88,9 % oziroma 52,4 %. Specifičnost vseh metod je bila približno 99 %.

Primerjali smo učinkovitost odkrivanja Mycobacterium tuberculosis z uporabo mikroskopije razmaza, setve na gojišče Lowenstein-Jensen, testnega sistema VASTES in analize PCR. PCR je pokazala občutljivost 74,4 %, mikroskopija - 33,8 %, setev na trdno gojišče - 48,9 % in VASTES - 55,8 %. Povprečni čas odkrivanja pri setvi na gojišče Lowenstein-Jensen je 24 dni, VASTES - 13 dni, PCR - 1 dan.

Obravnavan je tudi potencial uporabe PCR kot občutljive in hitre metode za spremljanje učinkovitosti zdravljenja tuberkuloze.

Detekcija DNA Mycobacterium tuberculosis z metodo PCR z učinkovito kemoterapijo se določa v daljšem časovnem obdobju - v povprečju 1,7 meseca v primerjavi z izločanjem bakterij, določenim s fluorescentno mikroskopijo, in 2,5 meseca v primerjavi z bakteriološko preiskavo.

Diagnoza zunajpljučnih oblik tuberkuloze

Pomen PCR kot občutljive metode je še posebej velik pri zunajpljučnih oblikah, saj so prav pri teh oblikah klinične in radiološke metode ter tradicionalne bakteriološke metode za določanje Mycobacterium tuberculosis v diagnostičnih materialih neučinkovite.

Pri pregledu vzorcev urina so bili rezultati PCR analize pozitivni pri 16 od 17 bolnikov z aktivno tuberkulozo sečil in negativni pri 4 bolnikih z neaktivno ledvično tuberkulozo in 39 bolnikih z netuberkuloznimi boleznimi sečil.

Dokazana je bila učinkovitost PCR analize pri preučevanju aspiratov kostnega mozga pri bolnikih z vročino neznanega izvora s sumom na tuberkulozno naravo bolezni. Za diagnozo tuberkuloznega limfadenitisa pri otrocih so preučevali 102 punkcijska aspirata in biopsijska vzorca 67 otrok s sumom na tuberkulozni limfadenitis. Pozitivni rezultati so bili pridobljeni: s PCR v realnem času - 71,6 %, fluorescenčno mikroskopijo - 46,3 %, študijo kulture - 41,8 %. V študiji 50 biopsij bezgavk pri bolnikih z boleznijo mačjega praskanja so bili vsi rezultati negativni. Tako je bila dokazana 100-odstotna specifičnost PCR analize. V istem delu je bila prikazana možnost odkrivanja M. avium pri punkcijski biopsiji bezgavk.

Diagnoza tuberkuloze ženskih spolovil pri neplodnosti je eden najtežjih diagnostičnih problemov. Pri 14 (56 %) od 25 bolnic, ki so bile laparoskopsko pregledane s sumom na tuberkulozo, so bili pozitivni rezultati PCR študij biopsij endometrija, aspiratov endometrija in vzorcev tekočine iz Douglasovega žepa. Mikroskopski razmaz in študije kulture so dale 1 oziroma 2 pozitivna rezultata. Tudi ti primeri so bili PCR pozitivni. Večina PCR pozitivnih rezultatov je bila v primerih z značilnimi značilnostmi tuberkuloze po histološkem pregledu; manjše število jih je bilo v primerih s sumom na tuberkulozo po laparoskopiji. Le en pozitiven rezultat PCR je bil pridobljen v odsotnosti laparoskopskih podatkov za tuberkulozo.

Pri diagnosticiranju zunajpljučnih oblik tuberkuloze se zdravniki pogosto sprašujejo o možnosti identifikacije povzročitelja pri pregledu vzorcev krvi z metodo PCR. Podatki iz literature kažejo, da je odkrivanje DNK Mycobacterium tuberculosis iz vzorcev krvi možno pri napredovalih oblikah okužbe z virusom HIV. DNK Mycobacterium tuberculosis so odkrili le pri generalizirani tuberkulozi različnih organov pri bolnikih s presajeno ledvico in imunosupresijo.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identifikacija vrst mikobakterij

Metoda PCR je lahko precej učinkovita za hitro identifikacijo mikobakterij tuberkuloznega kompleksa in nekaterih vrst netuberkuloznih mikobakterij po pridobitvi njihove primarne rasti. V tem primeru lahko uporaba PCR prihrani 7-10 dni, potrebnih za kasnejšo kulturno identifikacijo pozitivnega rezultata. Študija PCR je tehnično zelo preprosta, saj ne zahteva kompleksne priprave vzorca kliničnega materiala za doseganje visoke občutljivosti. Pri pregledu 80 pozitivnih kultur v takšnem testnem sistemu (MB BacT. podjetja Organon) so bili vsi pozitivni rezultati analize PCR strogo specifični in so bili izvedeni v 1 dnevu. Za identifikacijo drugih vrst mikobakterij, ko so pridobljene v kulturi, se DNK patogena hibridizira s specifičnimi DNK sondami, označenimi z akridinom, sevi pa se detektirajo s pojavom kemiluminiscence z uporabo kemiluminometra ali na nitroceluloznih trakovih z vizualno oceno po hibridizaciji. Ta komplet identificira omejeno število vrst: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii in M. gordonae.

A. Telenti in sodelavci so razvili tudi relativno preprosto in poceni metodo za identifikacijo vrst klinično pomembnih mikobakterij na podlagi PCR in poznejše obdelave z dvema restrikcijskima encimoma (encimoma, ki imata sposobnost rezanja molekule DNK na določenih mestih). V tem primeru se fragment DNK, ki kodira protein toplotnega šoka (65 kDa), pomnoži, nakar se fragment DNK, pridobljen s PCR, velikosti 439 nukleotidnih parov, ločeno obdela z dvema encimoma - Bste II in Nae III. Nato se z elektroforezo na agaroznem gelu analizirata oba dobljena produkta, pri čemer se določi njuna velikost (število nukleotidnih parov) z uporabo nabora standardnih fragmentov DNK (molekularnih markerjev DNK) dolžine od 100 do 1000 nukleotidnih parov. V vsaki od definiranih vrst (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) se za vsak restrikcijski encim najdeta 2 ali 3 fragmenti DNK različnih velikosti. Kombinacija nastalih fragmentov DNK različnih velikosti omogoča medsebojno razlikovanje teh vrst.

Razvija se tehnologija za biološke DNK mikročipe, ki bo v eni sami študiji pomagala identificirati več kot 100 vrst mikobakterij.

Identifikacijo vrst je mogoče izvesti tudi z uporabo PCR amplifikacije variabilne regije 16S rRNA, ki ji sledi sekvenciranje amplikonov v primerjavi z ustrezno primarno strukturo, kar omogoča identifikacijo več kot 40 vrst mikobakterij.

PCR se lahko uporabi tudi za identifikacijo vrst znotraj kompleksa tuberkuloznih mikobakterij, vključno z razlikovanjem med M. bovis in M. bovis BCG. To se naredi z analizo prisotnosti ali odsotnosti določenih genov v genomskih regijah RD1, RD9 in RD10. RD1 ni prisoten pri M. bovis BCG, je pa prisoten pri virulentnih vrstah, vključno z M. bovis.

Določanje občutljivosti Mycobacterium tuberculosis na zdravila z uporabo PCR

Naloge molekularno-genetskih metod za določanje občutljivosti ali odpornosti Mycobacterium tuberculosis na zdravila so omejene na identifikacijo mutacij v določenih nukleotidnih zaporedjih znanih genov. Glavne metode temeljijo bodisi na neposrednem branju (sekvenciranju) teh zaporedij po amplifikaciji bodisi na hibridizaciji biotinsko označenih fragmentov DNA, amplificiranih med PCR, z DNA sondami. Obe možnosti vključujeta identifikacijo substitucij v nukleotidnih zaporedjih, ki pri uporabi DNA sond vodijo do odsotnosti ali nepopolne hibridizacije na nitrocelulozni membrani z uporabo encimskega konjugata (streptavidin-alkalna fosfataza) - metoda LIPA-Rif-TB.

Metoda merjenja fluorescence v lokalno fiksiranih DNK sondah na mikroregijah, ki komplementarno vplivajo na znane mutacije v s PCR pomnoženih genskih regijah, odgovornih za občutljivost ali odpornost na zdravila, se imenuje metoda mikrobiočipov. Osnovni algoritem za izvedbo te študije je naslednji. Po izolaciji DNK iz kliničnega vzorca ali mikobakterijske kulture je treba izvesti PCR za amplifikacijo ustreznih fragmentov gena groB, odgovornega za občutljivost zdravila na rifampicin, ali genov katG in inhA, ki kodirata mikobakterijske beljakovine, odgovorne za občutljivost na izoniazid. Rezultati PCR se ocenijo z elektroforezo na agaroznem gelu, ki potrdi prejem ustreznih fragmentov DNK želene dolžine. Nato se izvede drugi krog PCR, da se v DNK vnese fluorescentna oznaka. Rezultate PCR ponovno potrdimo z gelsko elektroforezo. Po tem se izvede hibridizacija (inkubacija čez noč), ki ji sledi izpiranje pridobljenega materiala na biočipu, ki je veliko število kratkih verig DNK (sond), pritrjenih na majhno stekleno ploščo, ki dopolnjujejo nukleotidna zaporedja na zdravila občutljive vrste tuberkuloznih mikobakterij na mestih morebitnih mutacij, pa tudi mutantnih zaporedij, odgovornih za odpornost na zdravila. Lokacija DNK sond na plošči je strogo določena in določena je raven fluorescence, opažene med hibridizacijo, za določitev rezultata z uporabo posebne naprave za odčitavanje. V zvezi s tem se rezultati analize določijo s posebnim računalniškim programom.

V zadnjih letih so bile razvite alternativne metode za določanje občutljivosti Mycobacterium tuberculosis na zdravila, ki temeljijo na tehnologiji PCR v realnem času, kar omogoča izvajanje teh študij v zaprti epruveti.

Slika 13-13 prikazuje rezultat analize kliničnih kultur Mycobacterium tuberculosis pri določanju odpornosti na rifampicin z uporabo PCR v realnem času: 218 - kontrolni vzorec (občutljiv na rifampicin); 93 - pozitivna kontrola za mutacijo Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitivna kontrola za mutacijo Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - eksperimentalni vzorci. Rezultat izračuna kinetičnih krivulj amplifikacije za 4 kanale: kanal 1: 393 - pozitivna kontrola za mutacijo Ser-Trp TCG-TGG; kanal 2: 4482 - pozitivna kontrola za mutacijo Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - eksperimentalni vzorci; kanal 4: kinetične krivulje amplifikacije vseh vzorcev, ki sodelujejo v poskusu. Pozitivna kontrola reakcije amplifikacije. Zaključki: Analiza je pokazala naslednje mutacije, ki določajo odpornost na rifampicin: v vzorcih 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Enako načelo je bilo uporabljeno za določanje odpornosti na zdravilo proti izoniazid z genoma katG in inhA, ki določata najpogostejše mutacije.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identifikacija seva Mycobacterium tuberculosis

Najbolj preučevana metoda identifikacije seva Mycobacterium tuberculosis je tehnologija, imenovana polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov (RFLP), ki temelji na fragmentaciji (restrikciji) DNK Mycobacterium tuberculosis z encimom Pvu II in poznejši hibridizaciji pridobljenih fragmentov z določenimi specifičnimi zaporedji na DNK njenega ponavljajočega se elementa IS6110. Intraspecifična variabilnost se doseže zaradi različnega števila ponovitev IS6110 in njihove lokacije na DNK, pa tudi zaradi različnih razdalj med določenimi točkami napada restrikcijskega encima (restrikcijskimi mesti) in elementom IS6110. Ta tehnologija je zelo kompleksna in delovno intenzivna. Po obdelavi DNK, izolirane iz kulture tuberkulozne mikobakterije, z restrikcijskim encimom se izvede gelska elektroforeza, nato se fragmenti DNK različnih dolžin prenesejo na nitrocelulozno membrano, hibridizirajo s fragmenti elementa IS6110, rezultati pa se detektirajo z encimsko reakcijo. Nastali specifični vzorec pasov označuje DNK specifičnega seva tuberkulozne mikobakterije. Računalniška analiza razkrije identiteto ali sorodstvo sevov. Kljub temu, da je metoda RFLP najbolj diskriminatorna, tj. da razkrije največje število razlik med analiziranimi sevi, je neučinkovita, saj pri nekaterih sevih opazimo majhno število (manj kot 5) ponovitev IS6110. Sliki 13–14 prikazujeta rezultate tipizacije sevov z RFLP.

Alternativa je lahko metoda spoligotipizacije - analiza polimorfizma distančnih zaporedij DNA - vmesnih delov med direktnimi ponovitvami DR regije. Pri spoligotipizaciji sevov se izvede PCR s primerji, ki omejujejo DR regijo, nakar nastanejo fragmenti različnih dolžin, ki se hibridizirajo z variabilnimi vmesnimi regijami DNA. Analiza distančnih zaporedij DR regije se po mnenju raziskovalcev zdi enostavnejša, produktivnejša in primernejša za primarno presejanje sevov in predhodno epidemiološko analizo, pa tudi za neposredno preučevanje kliničnega materiala.

Očitno je učinkovitejša in tehnološko dostopnejša metoda VNTR (okrajšava angleških besed) oziroma metoda določanja spremenljivega števila natančnih tandemskih ponovitev v DNK Mycobacterium tuberculosis. Ta metoda temelji le na uporabi PCR in ne zahteva dodatnih manipulacij. Ker je število tandemskih ponovitev v različnih sevih in v različnih lokusih različno, se na nastalem elektroforegramu produktov PCR določijo in analizirajo fragmenti različnih velikosti. Po mnenju raziskovalcev se s pomočjo VNTR doseže večja stopnja razlikovanja sevov kot z metodo RFLP.

V zadnjih letih je bila velika pozornost namenjena širjenju sevov Mycobacterium tuberculosis iz družine W-Beijing (včasih imenovanih sev Beijing), ki so v veliki meri odporni na zdravila.

Osnovne zahteve za kakovost molekularno-bioloških raziskav

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Glavni regulativni dokumenti za izvajanje PCR

Odredbe Ministrstva za zdravje Ruske federacije: št. 45 z dne 7. 2. 2000; št. 109 z dne 21. 3. 2003; št. 64 z dne 21. 2. 2000. Smernice: 1.3.1888-04 "Organizacija dela med PCR raziskavami materiala, okuženega s patogenimi biološkimi agensi skupin patogenosti III-IV"; 1.3.1794-03 "Organizacija dela med PCR raziskavami materiala, okuženega z mikroorganizmi skupin patogenosti I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Dezinfekcija testnega materiala, okuženega z bakterijami skupin patogenosti I-IV, pri delu z metodo PCR", 2001. Dodatek 11 k Navodilim o enotnih metodah mikrobioloških raziskav pri odkrivanju, diagnosticiranju in zdravljenju tuberkuloze.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Osebje

Molekularno biološke študije lahko izvajajo zdravniki klinične laboratorijske diagnostike, bakteriologi, virologi, biologi klinične diagnostične laboratorijske diagnostike, pa tudi specialisti s srednješolsko medicinsko izobrazbo, ki so opravili specializacijo in izpopolnjevanje na ustaljen način.

Ureditev laboratorijskih prostorov

Potrebni so naslednji laboratorijski prostori:

• Območje za obdelavo vzorcev - laboratorij, prilagojen za delo z povzročitelji okužb skupin patogenosti III-IV, v skladu z metodološkimi smernicami 13.1888-04.
• Prostor za pripravo reakcijskih mešanic PCR je laboratorijska soba, ki zagotavlja zaščito pred notranjo laboratorijsko kontaminacijo – »čisto« območje.
• • Če se za analizo produktov PCR uporablja elektroforeza ali hibridizacija, mora biti laboratorijski prostor, v katerem se amplificirani fragmenti DNK ekstrahirajo iz amplifikacijske epruvete in lahko zato vstopijo v okolje, v skladu z zahtevami za laboratorije PCR (Metodološke smernice 1.3.1794-03, Metodološke smernice 1.3.1888-04), popolnoma izoliran od prostorov, navedenih v prejšnjih odstavkih. Izključeno mora biti gibanje osebja, opreme, materialov in predmetov iz območja elektroforeze v območje obdelave vzorcev in »čisto« območje, kot tudi prenos zraka skozi prezračevalni sistem ali zaradi prepiha. To območje ni potrebno za fluorimetrično detekcijo produktov PCR.
• Prostor za dokumentiranje in obdelavo rezultatov je opremljen z računalniki in potrebno pisarniško opremo. Ta prostor lahko vsebuje opremo, ki zagotavlja detekcijo produktov PCR brez odpiranja epruvete. - fluorescenčne detektorje PCR in termociklerje za PCR v realnem času.

Sanitarne in epidemiološke zahteve za primarno obdelavo sputuma so podobne standardnim mikrobiološkim zahtevam za delo z Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Celoten komplet laboratorijske opreme za PCR diagnostiko

Laboratorijski komplet vključuje opremo za naslednje prostore.

• Prostor za pripravo vzorcev vsebuje naslednjo opremo: laminarni pokrov zaščitnega razreda II "SP-1.2": polprevodniški termostat z ogrevanim pokrovom za epruvete Eppendorf; mikrocentrifuga s 13.000 vrt/min; centrifuga ("Vortex"); hladilnik s temperaturnim območjem od -20 ^° C do +10 ^° C; pipete s spremenljivo prostornino serije "Proline"; črpalka z lovilnikom OM-1; stojalo za pipete; stojalo za delovno postajo 200x0,5 ml; stojalo za delovno postajo 50x1,5 ml; stojala za shranjevanje epruvet 80x1,5 ml;
• prostor za pripravo reakcijske zmesi: zaščitna komora PCR škatla ("Laminar-C. 110 cm); centrifuga "Vortex"; pipete s spremenljivim volumnom serije "Proline"; stojalo za pipete; stojalo za delovno postajo 200x0,2 ml; stojala za shranjevanje epruvet 80x1,5 ml; hladilnik s temperaturnim območjem od -20 ^° C do +10 ^° C;
• Prostor za elektroforezo: horizontalna elektroforezna komora; vir napajanja; transiluminator;
• Ojačevalnik DNK ali analizator nukleinskih kislin (PCR v realnem času) z računalnikom in programsko opremo; lahko se namesti v kateri koli razpoložljivi prostor. Če se uporablja tehnologija PCR v realnem času, soba za elektroforezo ni potrebna.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Zunanji nadzor kakovosti

Da bi zagotovili objektivno zanesljive rezultate, morajo laboratoriji sodelovati v sistemu zunanjega ocenjevanja kakovosti laboratorijskih raziskav.

Udeleženci sistema nadzora kakovosti prejmejo: 12 ampul z liofiliziranimi suspenzijami bakterijskih celic, od katerih dve vsebujeta E. coli, 3 ampule z mikobakterijami tuberkuloze (avirulentni sev) v koncentraciji 10² ^/ ml; 3 ampule s celicami podobnega seva v koncentraciji 10² ^/ ml; 2 ampuli z netuberkuloznimi mikobakterijami M. avium-intracellulare in M. kansasii v koncentraciji 10³ ^/ ml.

Testi, poslani v zunanjo oceno kakovosti, so predhodno preizkušeni v dveh neodvisnih laboratorijih z bogatimi izkušnjami na tem področju.

[ 85 ], [ 86 ]