Molekularno genetske metode za diagnosticiranje dednih bolezni

Metode DNK tehnologije se uporabljajo za določanje lokalizacije mutantnega gena v določenem kromosomu, ki je odgovoren za nastanek določenih oblik dedne patologije. Ker je gen odsek DNK, genska mutacija pa poškodba primarne strukture DNK (mutacija se razume kot vse spremembe v zaporedju DNK, ne glede na njihovo lokalizacijo in vpliv na sposobnost preživetja posameznika), je s sondiranjem preparatov metafaznih kromosomov bolnika z dedno boleznijo mogoče ugotoviti lokalizacijo patološkega gena. Molekularno genetske metode ustvarjajo možnosti za diagnosticiranje bolezni na ravni spremenjene strukture DNK, saj nam omogočajo določitev lokalizacije dednih motenj. Molekularno genetske metode lahko identificirajo mutacije, povezane z zamenjavo celo ene same baze.

Najpomembnejša faza identifikacije gena je njegova izolacija. DNK je mogoče izolirati iz katere koli vrste tkiva in celic, ki vsebujejo jedra. Faze izolacije DNK vključujejo: hitro lizo celic, odstranitev fragmentov celičnih organelov in membran s centrifugiranjem, encimsko uničenje beljakovin in njihovo ekstrakcijo iz raztopine z uporabo fenola in kloroforma, koncentriranje molekul DNK z obarjanjem v etanolu.

V genetskih laboratorijih se DNK najpogosteje izolira iz krvnih levkocitov, za kar se pacientu odvzame 5–20 ml venske krvi v sterilno epruveto z raztopino antikoagulanta (heparin). Nato se levkociti ločijo in obdelajo po zgornjih korakih.

Naslednja faza priprave materiala za raziskave je »rezanje« DNK na fragmente na območjih s strogo specifičnim baznim zaporedjem, ki se izvaja z uporabo bakterijskih encimov - restrikcijskih endonukleaz (restrikcijskih encimov). Restrikcijski encimi prepoznajo specifična zaporedja 4-6, redkeje 8-12 nukleotidov v dvoverižni molekuli DNK in jo na mestih teh zaporedij razdelijo na fragmente, imenovane restrikcijska mesta. Število nastalih restrikcijskih fragmentov DNK je določeno s pogostostjo pojavljanja restrikcijskih mest, velikost fragmentov pa z naravo porazdelitve teh mest vzdolž dolžine prvotne molekule DNK. Pogosteje ko so restrikcijska mesta locirana, krajši so fragmenti DNK po restrikciji. Trenutno je znanih več kot 500 različnih vrst restrikcijskih encimov bakterijskega izvora in vsak od teh encimov prepozna svoje specifično nukleotidno zaporedje. V prihodnosti se lahko restrikcijska mesta uporabijo kot genetski označevalci DNK. Fragmente DNK, ki nastanejo kot posledica restrikcije, lahko z elektroforezo v agaroznem ali poliakrilamidnem gelu razvrstimo po dolžini in tako določimo njihovo molekulsko maso. Običajno se DNK v gelu identificira s specifičnim barvanjem (običajno z etidijevim bromidom) in opazovanjem gela v prepuščeni ultravijolični svetlobi. Mesta lokalizacije DNK so obarvana rdeče. Vendar pa pri ljudeh, ko DNK obdeluje več restrikcijskih encimov, nastane toliko fragmentov različnih dolžin, da jih ni mogoče ločiti z elektroforezo, tj. na elektroforezi ni mogoče vizualno identificirati posameznih fragmentov DNK (dobimo enakomerno obarvanje po celotni dolžini gela). Zato se za identifikacijo želenih fragmentov DNK v takšnem gelu uporablja metoda hibridizacije z označenimi DNK sondami.

Vsak enoverižni segment DNK ali RNK se lahko veže (hibridizira) s komplementarno verigo, pri čemer se gvanin vedno veže na citozin, adenin pa na timin. Tako nastane dvoverižna molekula. Če enoverižno kopijo kloniranega gena označimo z radioaktivno oznako, dobimo sondo. Sonda je sposobna najti komplementarni segment DNK, ki ga nato enostavno identificiramo z avtoradiografijo. Radioaktivna sonda, dodana pripravku raztegnjenih kromosomov, omogoča lokalizacijo gena na specifičnem kromosomu: z uporabo DNK sonde je mogoče med Southern blottingom identificirati specifična območja. Do hibridizacije pride, če testirani odsek DNK vsebuje normalen gen. V primeru, da je prisotno nenormalno nukleotidno zaporedje, tj. ustrezne kromosomske strukture vsebujejo mutantni gen, do hibridizacije ne bo prišlo, kar omogoča določitev lokalizacije patološkega gena.

Za pridobitev DNK sond se uporablja metoda kloniranja genov. Bistvo metode je, da se fragment DNK, ki ustreza genu ali delu gena, vstavi v klonirajoči delec, običajno bakterijski plazmid (obročasta ekstrakromosomska DNK, prisotna v bakterijskih celicah in nosi gene za odpornost na antibiotike), nato pa se bakterije s plazmidom z vstavljenim človeškim genom razmnožijo. Zahvaljujoč sinteznim procesom v plazmidu je mogoče dobiti milijarde kopij človeškega gena ali njegovega dela.

Nastale kopije DNK, označene z radioaktivno oznako ali fluorokromi, se nato uporabijo kot sonde za iskanje komplementarnih zaporedij med preučevanim naborom molekul DNK.

Trenutno obstaja veliko različnih vrst metod, ki uporabljajo DNK sonde za diagnosticiranje genskih mutacij.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]