Molekularne genetske metode za diagnozo dednih bolezni

Metode DNK tehnologije se uporabljajo za določanje lokalizacije v določenem kromosomu mutiranega gena, ki je odgovoren za nastanek določenih oblik dedne patologije. Ker je gen je segment DNA in genske mutacije - poškodba primarne strukture DNA (mutacija se razumejo vse spremembe v sekvenci DNA, ne glede na lokacijo in vpliva na posameznem preživetja), nato merilno preparati kromosomov metafaza bolnikov dedna bolezen, mogoče ugotoviti lokalizacija patološkega gena. Metode molekularne genetike ustvariti možnost diagnosticiranja bolezni pri spremenjeni strukturi DNA, ki omogočajo, da se ugotovi lokalizacijo podedovanih motenj. Molekularne genetske metode lahko razkrijejo mutacije, povezane z zamenjavo celo ene baze.

Najpomembnejša faza identifikacije gena je njegova izolacija. DNK se lahko izolira iz vseh vrst tkiv in celic, ki vsebujejo jedra. Koraki izolacije DNA vključujejo hitro lizo celic s centrifugiranjem z odstranitvijo fragmenti celičnih organel in membran, encimsko uničevanja proteinov in njihovo ekstrakcijo iz raztopine s fenolom in kloroformom, koncentracije DNA z obarjanjem v etanolu.

V genetskih laboratorijih je DNK najpogosteje izolirana iz krvnih levkocitov, za katere bolnik jemlje 5-20 ml venske krvi v sterilni epruveti z antikoagulantno raztopino (heparin). Ljukocite nato ločimo in obdelamo v skladu z zgoraj opisanimi koraki.

Naslednja stopnja materialne priprave do študijskega - DNA "cut" v fragmentov na mestih z ozko specifično osnovnega zaporedja izvedemo s pomočjo bakterijskih encimov - restrikcijskimi endonukleazami (restrikcijskih encimov). Restrikcijskimi encimi spoznajo specifične sekvence 4-6, vsaj 8-12 nukleotidov v molekuli dvoverižno DNA in njeni ločeni v fragmentih od teh sekvenc lokalizirajo območij imenovanih restrikcijskih mest. Število proizvaja restrikcijski fragmenti DNA določi frekvenco pojavljanja restrikcijska mesta in fragmenti velikosti - naravo porazdelitve teh mestih vzdolž dolžine prvotne molekule DNA. Čim bolj se nahajajo mesta za omejitve, krajša je DNK fragment po omejitvi. Trenutno je znano več kot 500 različnih vrst restrikcijskih encimov bakterijskega izvora in vsak od teh encimov prepozna svoje specifično zaporedje nukleotidov. V prihodnosti se lahko omejitvena mesta uporabijo kot genetski markerji za DNA. Dobljene restrikcijski fragmenti DNA lahko razporejene po dolžini z elektroforezo v agaroznem ali poliakrilamidnem gelu, s čimer se lahko določi njihovo molekulsko maso. Običajno za odkrivanje DNA iz gela s posebnim obarvanjem znamke (običajno etidijev bromid), in si gel v prepuščeni svetlobi na ultravijolično. Lokacije lokalizacije DNA imajo rdečo barvo. Vendar pa oseba pri predelavi več omejitev DNA endonukleazami oblikovana tako veliko fragmente različnih dolžin, da ne morejo biti ločeni s pomočjo elektroforeze, ni mogoče vizualno identifikacijo posameznih fragmentov DNA na electrophoregram (pridobljen enotno obarvanje vsej dolžini gela). Zato se za identifikacijo želenih fragmentov DNA v takem gelu uporablja metoda hibridizacije z označenimi sondami DNA.

Vsak enojni segment DNA ali RNA se lahko veže (hibridizira) v svojo komplementarno verigo, gvanin pa je vedno povezan s citozinom, adeninom s timinom. To je tvorba dvojno vijačene molekule. Če je enojna kopija kloniranega gena označena z radioaktivnim nalepko, se dobi sonda. Sonda je sposobna najti komplementarni segment DNK, ki ga nato enostavno identificira z radijskim avtogramom. Radioaktivna sonda, dodana zdravilu raztegnjenih kromosomov, omogoča genu, da se lokalizira na določenem kromosomu: nekatere vzorce DNK se lahko identificirajo s sondo DNA pri južnem blotiranju. Hibridizacija se pojavi, če testni del DNA vsebuje normalen gen. V primeru, kjer je nenormalni zaporedje nukleotidov, to ustrezne strukture kromosomov vsebuje mutiran gen, hibridizacija ne bo prihajalo, ki omogoča določiti lokalizacije nenormalno gena.

Za pridobitev DNA sond se uporablja metoda kloniranja genov. Bistvo metode je sestavljen s tem, da fragment DNA, ki ustreza kateremkoli gena ali regijo gena, vstavljenega v kloniranja delec, običajno bakterijskem plazmidu (krožnega ekstrakromosomski Trenutno DNA v bakterijskih celicah in prenašanje genov odpornosti na antibiotike), in nato bakterije imajo plazmid z vgrajenim človeškim genom, se pomnožijo. Zaradi postopkih sinteze je mogoče dobiti plazmid milijard izvodov humanega gena ali njegovega dela.

Poleg tega so kopije DNA, označene z radioaktivnimi nalepkami ali fluorokromi, uporabljene kot sonde za iskanje komplementarnih zaporedij med skupino preučenih molekul DNA.

Trenutno obstaja veliko različnih metod, ki uporabljajo DNA sonde za diagnozo genskih mutacij.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],