Embrionalne izvorne celice

Odkritje embrionalnih matičnih celic - ni bilo naključje, in se je pojavila na pripravljeno raziskave tal na področju razvojnega raziskovanja biologije. Izraz "izvornih celicah" je bil uveden v medicino leta 1908 pri Društvu za hematologijo kongresu v Berlinu, Alexander Maximov uporablja za hematopoetske celice. Dolgo pred izolacijo in pripravo stabilne linije pluripotentnih embrionalnih matičnih celic v zgodnjem razvoju raziskovalnega procesa uporablja steblo terato- (zarodek karcinoma celice, ki je študiral na neznane mehanizme embriogenezo, vključno z zaporedjem za izražanje zgodnjih genov in proteinov izdelkov njihovega dela.

Toda ali je v procesu evolucije nepovratno izgubljena človeška genoma? Ne, in embriogeneza je dokaz. Če je tako, potem, kdaj bo načeloma dosežena druga pot evolucijskega razvoja? Verjetno, ko oseba zapusti Cosmos, kjer bodo okoljevarstvene razmere že dolgo časa relativno konstantne. Izguba kostne mase (kosti demineralizacijo v breztežnostnem stanju) zelo počasi mogoče preoblikovanje in regeneracijo se lahko šteje kot prvi korak v procesu prilagajanja človeškega kot vrste bivanja v vesolju. Vendar bo plačilo za drugo pot evolucijskega razvoja drugačno - sterilnost bo cena, ki jo je treba povrniti vsem celicam totipotency in absolutne plastičnosti. Torej se v tem svetu pomnožimo s "evolucijskimi kameleonji" brez mejoze, otpochkovaniem. Vendar bomo živeli dolgo. Telomerazna nesmrtnost je nesmrtnost amebe. V večceličnih organizmih so izvorne celice substrat kvantitativne in kvalitativne dolgoživosti.

[1], [2], [3], [4]

Viri embrionalnih matičnih celic

Danes vir izvornih celic za laboratorijske teste so Line mišje teratokarcinom (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, R, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) in človeški teratokarcinom (NTERA-2, TERA-2 , Klon H-9), kot tudi linije ESC Trauneone. Vendar prisotnost podrobno celično potni list z navedbo imunski fenotip, rezultate analize kromosomskih mRNA ekspresijskih profilov, izpostavljenih receptorje in beljakovin intracelularni signalizacijo ne nadomesti pomembne pomanjkljivosti teratokartsinomnyh linije ESO - hitre izgube totipotency in nezmožnost uporabe v kliničnih raziskavah in mešano diferenciacije v je kultura zelo težko izolirati čista specializirana linija iz heterogene populacije celic. Zato običajno vir linije ESC proizvedena za klinične namene, služi kot masa notranje celic blastociste, zarodki posamezni blastomeres etape 8-celični razvoja, celice morula nadaljnjih stopnjah in primarnega zarodne celice.

Opozoriti je treba, da imajo teratokarcinomske celice, čeprav imajo pluripotentnost, znatno nižji pluripotentni potencial v primerjavi z ESC. Njihova integracija z embrionalnimi celicami le redko vodi v nastanek himerov, pri katerih se nikoli ne tvorijo gametije s genotipom teratokarcinoma. Verjetno je, da je to zaradi pogostega pojava med nenormalnosti teratokarcinom kromosomskih celične kulture: izguba Y kromosoma, trisomijo sorte, delecij ali prenosov.

Poskusi razlikovati človeško linijo ESC so bili izvedeni večkrat, vendar te naloge ni bilo mogoče rešiti, saj je običajnim človeškim blastocistom težko dostopati do predmetov. Poleg tega je pri ljudeh pogostnost nenormalnosti kromosomov višja kot pri embriogenezi živali. Prevladujoča večina zgodnjih človeških zarodkov, dobljenih po in vitro oploditvi, kažejo kaotični kromosomni mozaikizem in pogosto so številčne in strukturne aberacije. Tudi kasneje, v stadiju blastociste, le 20-25% človeških zarodkov sestavljajo celice z normalnim kariotipom. Takih zarodkov je bilo skoraj nemogoče uporabiti za izdelavo ESC, saj so bili zigoti običajno kultivirani na stopnje dveh ali štirih blastomerov in nato presajeni v maternico. Šele v zadnjem času je bila zanesljiva tehnika, razvita za gojenje oplojenih človeških ovul v blastocistno fazo. Uvedba te tehnike v prakso oploditve in vitro je ne samo povečala pogostost uspešnega implantacijskega izida, ampak tudi naredila normalne blastociste bolj dostopen objekt.

Drug pluripotentne vir izvornih celic primarne sex celice, ki v nasprotju z naprednejše predniških populacij germenativnogo epitel, niso na površini beta-integrin, vendar izražajo visoko aktivnost shelochnoy fosfatazo. Treba je opozoriti, da so v poskusu prebivalstva izvornih celic, ki nastajajo iz prvotnih spolnih celic je študiral pri 80-ih letih prejšnjega stoletja. Obenem je bila razvita tehnika za izolacijo primarnih zarodnih celic iz orehovega gležnja zarodka miši. Prvi neuspešni rezultati gojenje primordial zarodnih celic in vitro kaže na nesmiselnost teh prizadevanj, kot je celic, čeprav je preživela, vendar ne razmnožujejo in umrl v prvem dnevu. Kasneje je bilo ugotovljeno, da je primarni murine zarodnih celic proliferirajo in vitro v prisotnosti le v gojitvenem mediju topnih in membrano vezan rastnih faktorjev specifični polipeptid. Številne študije so pokazale, da je treba prisotnost v gojitvenem mediju, ne samo LIF, ampak membrannosvyazannyh in jeklo, topen faktor (SIF) za preživetje in proliferacijo prvobitnih zarodnih celic. Ti peptidi so izdelani z somatskih zarodkov celic homozigotna za mutacijo jekla, in eden od njih je ligand iz proto-onkogena Ckit.

Primarne zarodne celice sesalcev in ljudi so izven gonadalnega izvora in so vir klonskega razvoja linije spolnih celic. Zagon linije prvobitna zarodnih celic, kot tudi vsa tkiva zarodka in ekstraembrionalne mezoderma daje epiblast (primarni ectoderm) zgodnje zarodke, ki imajo mozaik organizacijsko strukturo. Mikrohirurška odstranitev različnih delov zgodnjega zarodka je vzpostavila lokalizacijsko cono v epiblastu klona predhodnih predhodnikov primarnih zarodnih celic. Z rodamindekstrana ki je bil uporabljen kot celični označevalec bilo ugotovljeno, da so predhodniki primordial zarodnih celic se nahaja v proksimalnem območju epiblast, v bližini ekstraembrionalne ectoderm. Primarna spolna celična linija izhaja iz 45-celičnih klonov, katerih razporeditev se pojavi na samem začetku gastrulacije. Nato se pojavi segregacija klona in med gastrulacijo primarne spolne celice vstopajo v ekstraembrionsko mezoderno kožo in se nahajajo v dnu alantnozijskega popka, za primarnim pasom. Od tod se primarne zarodne celice selijo proti ventralnemu koncu endocermne endocervice in nato aktivno premikajo vzdolž mezenterije, ki naseljujejo genitalne valje na koncu migracije. V procesu selitve in v prvih 2-3 dneh lokalizacije v gonadnem rudimentu primarne spolne celice aktivno proliferirajo in opravijo osem razmnoževalnih ciklov. Če na začetku migracije obstaja približno 50 primarnih zarodnih celic, potem pa v reproduktivnih cistah mišjih zarodkov dvanajstdnevnega razvoja število primarnih spolnih celic presega 25.000.

Funkcionalna podobnost ESO in prvobitnih zarodnih celic kaže popolno vključitev slednjega v nadomestni blastociste mase na notranji celic in kasnejšo popoln razvoj zarodka, tkiva, ki je sestavljen samo iz potomcev primordial zarodnih celic. Po drugih značilnostih murine primarnih zarodnih celic PGCs so tudi identične, ki prikazuje sposobnost za razlikovanje v različnih smereh, da se tvori embryoid telesa in vitro, a vivo tvorijo teratomas, kadar smo injicirali subkutano v imunsko pomanjkljivostjo miši podobni spontani teratomas testisov miši linije 129 / TER.

Ugotovljeno je, da, kadar je dodan LIF mediju, in topnim membrannosvyazannogo SIF izoliramo primarnih zarodnih celicah 8 dni murine zarodki preživijo in razmnožujejo v kulturi za 4 dni, nato pa umre. Poleg tega je obdobje, ko se kultura smrti opazili primordial zarodnih celic sovpada s stopnjo razvoja zarodkov miško (12.5-13.5 dni), ko so popki primarni žlez ženske spolne celice vstopijo mejoze in moških prvotnih spolnih celic so blokirani mitotićne delitev. Vendar pa, če dodate do okolja, ne samo rast faktorjev LIF in od SIF, ampak tudi FGF2, primarni zarodnih celic še naprej proliferirovat in subkulture nastajajo celične kolonije lahko razmnožujejo tudi po odstranitvi iz okolja rastnih faktorjev (SIF in FGF). Takšne celice lahko dolgo časa gojimo na substratu embrionalnega fibroblasta brez dodajanja topnega faktorja rastnega faktorja LIF. Te stabilne celične linije, pridobljene iz primarnih zarodnih celic, so bile predlagane za imenovane embrionalne zarodne celice. Ta izraz se ne more šteti uspešni pri kultivirani EG-celice ni mogoče dobiti embrionalnih zarodnih celic, ki lahko izvedbo naslednjih fazah oogeneza ali spermatogeneze. To je posledica dejstva, da EG-celične linije, čeprav, ki izhajajo iz prvobitnih zarodnih celic, vendar v kulturi pridobitve lastnosti embrionalnih pluripotentnih matičnih celic izgubijo sposobnost, da stori germenativnye linijo. Z drugimi besedami, primarne spolne celice po gojitvi izgubijo lastnosti predhodnih sestavin gamete in se preoblikujejo v pljučne celice, podobne ESC.

Opaziti je treba, da pri dajanju imunsko odmerkov EG miši teratomi ne nastanejo. Predpostavlja se, da je izguba sposobnosti človeških celic EG za inicializacijo teratome posledica dejstva, da te črte niso bile ustvarjene neposredno iz kultiviranih primarnih zarodnih celic, ampak so bile pridobljene iz celic, izoliranih iz embrionalnih teles. Zato je možno, da so potomci pluripotentnih, a že storjenih celic.

Treba je opozoriti, da obstajajo bistvene razlike med celicami EG in primarnimi zarodnimi celicami. Slednji ne omogočajo pridobivanja kimernih mišjih zarodkov, kar kaže na pomanjkanje sposobnosti primarnih zarodnih celic, da se vključijo v notranjo celično maso ali trophektodermo. Značilnosti populacije primarnih spolnih celic so bolj podobne storjenim linijam somatskih celic poznejših zarodkov, katerih vnos v blastocist tudi ne vodi v nastanek kimernih zarodkov.

Sprememba tehnike kultiviranje embryoid telesa dobljene z EG-agregacije celic z izbiro dovoljenih na selektivnem mediju prejeti drugo populacijo pluripotentnih celic, ki se imenuje "celice, pridobljene iz embryoid teles (pridobljenih celic embryoid body - EBD-celice). Sposobnost celic EBD, da se dolgo časa razmnožujejo v kulturi, ki omogoča ustvarjanje stabilnih celičnih linij zavezanih celic. Dobljeni so bili kloni celic, ki izražajo širok spekter mRNA in beljakovinskih markerjev specializiranih celic. Ta pristop zaradi dokazali, da so primarni spolni pluripotentnimi humanih celic in razlikovanje vitro v različne celične tipe: nevronov, glia, žilnega endotelija, hematopoetičnih celic, mišicah in endodermal celic.

Alternativni viri embrionalnih izvornih celic

Alternativni vir človeških linij ESC so lahko hibridne celice. Vsaditev v maternico strukture pseudopregnant kravjega geterogenomnoy dobljene ob združevanju z elektroporacijo fetusa človeških somatskih celic z jajčnimi krave, ki je bil predhodno odstranjen iz pronucleus, omogoča, da sprejme notranjo celično maso pred implantacijo zarodka umetnih razvojnih stopenj. V ta namen se na prvi stopnji pridobi blastocist iz jajca krave s presajenim jedrom človeške celice.

V drugi fazi se embryoblast izloča iz blastociste in iz njega - ESC po Thomsonovi metodi. Omeniti je treba, da so bili najboljši rezultati v ločilnima linijama ESC s to metodo dobimo z uporabo jedra folikularnih celic ali prvobitnih zarodnih celic, ki ostajajo v človeško telo v stanju mirovanja. To je posledica dejstva, da je kravje jajce presajenega človeških celic jedra neukorochennye mora imeti visoko aktivnost in telomere telomeazy, ki preprečuje prezgodnje staranje kloni ESC, ki izhajajo iz hibridnega jajca (Repin, 2001). Znano je, da so najpomembnejše znotrajceličnih označevalne beljakovine PGCs UPB3, Oct4, TCF, Groucho, ki spadajo v tako imenovanih dušilci, kromatin beljakovine. Glušniki zagotavljajo posebno kompaktno pakiranje heteroromatina, ki preprečuje nastanek zanke euhromatina. Paket kromatina, ki ga posredujejo ti proteini, je v korelaciji s tototipnostjo genoma ESC. Danes je ugotovila, da so zrele jajca pri govedu in ljudeh le vrste specializiranih celic, ki vsebujejo visoko koncentracijo za dušilce zvoka, beljakovin v citoplazmi. Na tej podlagi je bila razvita metoda za proizvodnjo hibridnih ESC s prenosom somatskih celičnih jeder v nejedrske ovulje krav. Predhodni vitro študije so pokazale, da citoplazmo oocitov krav vrača totipotency genom človeških somatskih jeder celic po 12-24 urah kultiviranja.

Poseben interes so podatki o značilnostih razvoja preimplantacije človeških zarodkov, ki nakazujejo kasnejšo zamenjavo totipotentnih celic s populacijo pluripotentnih celic kot pri miših. Študija celičnih transformacij je pokazala, da celice notranje celične mase človeškega blastociste poleg ESC tudi tvorijo trofoblastne celice, kar kaže na njihovo skupno moč.

Znano je, da na stopnji blastociste obstajata dve različno zavedni celični populaciji. Ena od njih je zunanja plast blastociste, trofodermne kisline, ki izhaja iz trofoblastnih celic in drugih embrionalnih sestavin placente. Druga populacija celic je združena v gosto maso, ki se dotika notranje površine trophektoderme. Celična populacija notranje celične mase je pridobljena iz vseh tkiv in mikroorganizmov embrionalnih organov. Na stopnji poznega blastociste se iz notranje celične mase oblikuje ekstra-embrionalni endoderm in nastane epiblast (primarna ektodermija). Hkrati epiblastne celice ohranjajo pluripotenco, medtem ko je sposobnost diferenciacije celic ekstra-germinalne endoderme omejena.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Pridobivanje izvornih celic človeških zarodkov

Do nedavnega se je verjel, da ni bilo mogoče pridobiti ESC iz trofoblasta. Vendar diploidnih matične celice linija trophectoderm izolirane iz blastociste v mediju, ki vsebuje namesto LIF in FGF2 heparin, proliferates in se pretvori v matičnih celic. Če odstranite iz sredi FGF2 so trophectoderm celice ustavi razmnoževanje, začnejo endoreduplikacije kromosomov in mobilnih elementov trofektodermalnye postopoma preoblikoval v velikan trofoblast celic. Verjetno, LIF ne stimulira proliferacijo trophectoderm celic zaradi dejstva, da FGF2 sproži mehanizem transsignalizatsii kot FGF2, vezavo na citoplazemske receptor (FGFR2), aktiviranje MAP kinaze v citoplazmi - ERK1 in ERK2. Zato, kadar so vključeni v celice blastociste ene signalne poti (LIF - gpl30 - JAK-kinazo - stat3) notranje celične mase celice se pretvorijo v pluripotentnih hESCs, medtem aktiviranje drugega mehanizma transmembranski signalizacije (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaz ERK1 / ERK2) V blastocistu nastanejo izvorne celice trophektoderm. Izbira signalne poti je odvisna od aktivnosti oct4 gena. Ta gen pripadajo POU domena, ki se nahaja na lokusu t 17 autosomes in je izražena v oogeneza v drobljenje rok kot tudi v celicah maso notranje celic blastociste in prvobitnih zarodnih celicah. Funkcija oct4 gen, ki kodira transkripcijski faktor, potreben za nastanek pluripotentnih celic, njihovo diferenciacijo in dedifferentiation.

Izraz oct4 gena v ESC se razlikuje glede na interakcijo tega transkripcijskega faktorja s kofaktorji. Usmerjeni izraz ureditev oct4 v blastocist pokazala, da njegova aktivnost pri nižjih oblikah pol trophectoderm celice, ker pri višjih inducirane ekspresije oct4 nastanejo v glavnem hESCs.

V poskusu ESC ni mogoče pretvoriti v črto pri gojenju totipotentnih blastomerov na stopnji drobljenja, pa tudi na stopnji gastrulacije in kasnejših faz embrionalnega razvoja. Miška sektorski sveti običajno razporediti na 3.5-4.5 dni nosečnosti, ki ustreza šestim (enoslojne blastociste) in sedme faze (dvoslojnih blastociste - zgodnji jajce cilinder) normalno embriogenezo. Očitno je, da samo v predimplantacijskem obdobju embriji miši vsebujejo celične populacije, ki jih je mogoče preoblikovati v ESC. Zato je izolacija linij ESC možna le na določenih stopnjah embriogeneze. Totitipotentna, z vidika možnosti razvoja živega zarodka z embrionalnimi membranami in placento, so zigota in blastomeri, ki nastanejo med drobljenjem. Izguba celotne jakosti zarodnih celic se začne v pozni morilni fazi, ko je nadaljnje blastomere comminution odvisno od njihove lokacije. Zgodnje-mrliški blokatorji ohranjajo totipotency, ker eksperimentalne manipulacije s spremembo lokacije, na primer inverzijo njihove lokacije, ne preprečujejo razvoja celotnega zarodka.

Ugotovljeno je bilo, da je stanje blastocist v učinkovitosti sproščanja ESC v črto v času njihovega eksplantiranja. Uporaba blastocist po sedmih dneh simulacijo diapavze v genitalnega trakta miši, ovariektomizirane na 3,5 dni gestacije in obdelamo z progesterona, prispeva k bolj uspešni ločevanje linij izvornih celic. Predpostavlja se, da se v takšnih pogojih poveča število blastomerov, ki tvorijo notranjo celično maso. Možno je tudi, da se celični cikel razširi in da večina blastomerov vstopi v fazo G0.

Še več, oblikovanje stabilne pluripotentnih človeških zarodnih izvornih celic vodov odvisen genotipom zarodkov: zlahka loči od sektorski sveti glodalskega blastocist liniji 129, je bistveno težje jih dobimo pri miših CS7BL / 6 in praktično nemogoče izolirati črte od hESCs blastocist CBA / Ca miših. Očitno zgodnji zarodki imajo nekatere genetske lastnosti, ki vplivajo na razvoj pluripotentne linije ESC. Vendar pa je pri izolirani kultiviramo epiblast, kot tudi s selektivnim izborom diferencirnim hESCs celične linije iz zgodnjih zarodkov še vedno dodeljena CBA / Ca miši.

Dokazana standardna tehnika za pridobivanje ESK linij iz blastocist je v laboratorijskih navodilih o tehniki eksperimenta z zgodnjimi zarodki. Eksperimentalne linije ESK lahko dobimo tudi z gojenjem izoliranega epiblasta (primarnega ektoderma) 4,5-dnevnih zarodkov miši z precej zapleteno mikro-kirurško tehniko in spremenjenimi pogoji gojenja. Kompleksnost tega postopka je utemeljena, saj je bila pogostost nastanka linij ESC veliko višja kot pri delu z notranjo celično maso blastociste.

Za izolacijo linij ESC se vsak klon prenese v mikro vdolbino, goji se agregat 40-60 celic, ponovno se razprši. Večkratne ponovitve tega postopka dovoljuje pridobitev imortalizirana ESK linijo z najvišjimi normokariotipnyh celicami mero proliferacija pritrjenih na umetne snovi, ki skozi prehode 50-100 ohranijo totipotency in visoko aktivnost telomeraze. V procesu podporo linije ESO največja nevarnost je onesnaževanje ali serumski bakterijski endotoksini - celo sledi koncentracijo endotoksina v gojitvenem mediju povzročila množično smrt nezrelih zarodnih celic. S skrbnim nadzorom rasti linearno in pravočasno disperzije ESS v kulturi so sposobni simetrično fisije, v kateri sta obe hčerinske celice ostanejo pluripotentne in sposoben opravljati neomejeno število celičnih ciklov, vzdrževanje diploidnih kariotip in skupno moč.

Izbira čiste populacije človeških ESO lahko izvedemo naslednje transfekcijo v svoj genom molekule rekombinantne DNA, ki vsebujejo gen, ki kodira sintezo zeleni fluorescentni protein (GFP). Izražanje GFP povečuje z narašča ekonomsko-socialnimi sveti v okolju, ki podpira njihovo povečanje, ker je začetek diferenciacije nivo ekspresije gena zmanjšana, kar omogoča, izbranih na selektivnem mediju čistega stabilnega, pluripotentne celične linije. Pri gojenju z GFP selekcijo ESC se pogostost kolonij močno poveča, saj se v pogojih selekcijskih poljščin izloča močan antiproliferativni učinek diferenciranih celic.

Prevod človeških embrionalnih izvornih celic v skladu z načinom njihove izolacije preimplantiranih zarodkov (korak 80-120 celice), ki ostanejo po oploditev in vitro. Za to so umetno pridobljeni "presežni" zarodki mehansko razpršeni v okolju Delbecco-Needle. Po označevanju celice z monoklonskimi protitelesi selektivno etiketi fluorescentno embrioblasta izoliranih celic. Embryoblast se razprši v posamezne celice z uporabo mešanice disaspazne kolagenaze. Disociira Celice smo gojili v posebnem mediju (80% Delbekko srednje 20% seruma + fetalnega telečjega v prisotnosti 500 ug / ml IL-6, LIF in SCF) o monosloja zarodkov fibroblastov podajalnik 3, prvi prehode. V tem primeru je preživetje in proliferacija izvornih in progenitornih celic podprto z izpostavljenostjo IL-6, LIF in SCF. V tem okolju so hESCs vzmetenje rastejo kloni osharennyh batnim celic, ki se ločeno z rahlim večkratno pipeto. Novi kloni se pojavijo v suspendirani kulturi 5. In 7. Dne. Najvišjo stopnjo rasti ESC dosežemo z večkratno disocijacijo klonov na stopnji 10-15 celic. Potem se vsak klon prenese v mikrocelulozo in zrasi na agregat 40-50 celic. Postopek se večkrat ponovi v prehodih, povečuje se količina kulture do gostote 5-10 milijonov celic na 6-centimetrski skodelici. Z uporabo takih Thomson pasažo ga izoliramo 10 klonov nesmrtno človeških ekonomsko-socialnimi sveti, ki skozi prehode 100 ohranijo visoko aktivnost telomeraze, možnost intenzivnega širjenja in fenotipskih značilnosti minimalna jakosti, z diferenciacijo kateremkoli od 350 specializiranih celične linije, ki so pridobljene ekto-, meso- - in endoderm. Razlikovanje humanega ESO začelo (pri menjavi medija, poleg in odpravo serumskega LIF) z pritrditve celic na podlago, kar kaže na razvoj citoskeleta in izražanje adhezijskih receptorjev. Pomembno je, da je ob neomejeno širjenju človeških ESK ohranil normalni kariotip.

Druga metoda izolacije človeških linij ESC temelji na uporabi primarnih spolnih celic. Eksperimentalne študije so pokazale, da so linije Eu-celic pridobljene iz genitalnih plakic starih 12,5-dnevnih zarodkov miši. Vendar pa je bila v teh primerih pogostnost nastanka progenitornih celičnih linij znatno nižja kot pri poskusih s prejšnjimi zarodki. Istočasno se primarne spolne celice iz gonad z miševnimi zarodki 13,5-dnevne gestacijske starosti na splošno ne morejo pretvoriti v linije.

Prve stabilne linije pluripotentnih človeških EG celic smo pridobili iz primarnih gonocitov, izoliranih iz genitalnih popkov starih 5-9 tednov zarodkov. Izolirane celice kultiviramo na substratu inaktiviran mišje embrionalne fibroblaste v DMEM mediju z fetalni serum, ki smo mu dodali merkaptoetanola, forskolin, kakor tudi rekombinantnih faktorjev Človeški rastni (FGF in IOH). Po 7-12 dneh so se v kulturi pojavile večcelične kolonije, glede na morfološke značilnosti in molekularne označevalce, ki ustrezajo človeškim EG celicam. Po agregaciji so te celice oblikovale embrionalna telesa, z nadaljnjim razvojem katerih so se pojavile specializirane celice, ki so značilne za derivate vseh treh embrionalnih listov. V 10-20 prehodih EG-celične linije so obdržale normalni kariotip in niso izgubile pluripotence.

Prav tako je razvidno, da kombinirani učinek LIF, membransko vezanih in topnih faktorjev jekla, kot tudi TGF-b, spreminja program razvoja primarnih zarodnih celic. Namesto da bi ustavili mitotične delitve in se začeli razlikovati proti oogenezi ali spermatogenezi, se primarne spolne celice še naprej razširijo. Po nekaj dodatnih mitoloških ciklih postanejo podobni epiblastnim celicam in se izgubijo lastnosti prekurzorjev zarodnih celic, transformirajo v pluripotentne embrionalne matične celice EG.

Tako so leta 1998 nesmrtne linije primarnih spolnih celic najprej izolirale iz seksualnega zastoja človeškega plodnega obdukcijskega tkiva. Embriogeneza človeških primarnih zarodnih celic pojavijo v hranilni mešiček v tretjem tednu razvoja, in na 4-5th tednih, te celice migrirajo na področju spolnega tuberkla, kjer tvorijo populacijo primarnih dormantnye gonocytes. V stanju neaktivnosti primarne zarodne celice ostanejo v roza do rojstva. Celične linije primarnih zarodnih ekstrahiramo iz fetalnih spolnih tubercle 5-9 tednov starih zarodkov pridobljenih ex tempore tkanine, ki se zdravijo z zmesjo tipa kolagenaze IV-V, hialuronidaza in DNaze za kvantitativno in kvalitativno dobitkom povečanje celic. Primarne zarodne celice v tkivih tubalnega gena zarodka ploda obkrožajo Sertoli stromalne (mezenhimalne) celice. Funkcionalna namen Sertolijeva Celica je proizvodnja anti-apoptotskih dejavnikov (Fas-ligand), mitogeni in imunosupresivi, ki ščitijo izvorne celice spolne iz imunskega napada telesu. Poleg tega ima stromalno mikrookolje genitalnega tubusa pomembno vlogo pri zorenju gamet. Izolirane primarne kletke so posajene v kulturi nad stromalno plastjo hranilnika, ki jo sestavljajo fetalni fibroblasti prvih treh prehodov. Najbolj učinkovita kombinacija mitogenov je kompleks, ki ga sestavljajo LIF, FGF in forskolin (stimulant za tvorbo cAMP). Proliferaciie primordial zarodnih celic in vitro zahtevajo dodatek fetalni serum v prisotnosti primarnih reprodukcijskih gonocytes v kulturi klonov s hkratno tvorbo kroglastih, neadherentnih celic na substrat.

V ZDA National Institutes of Health na podlagi povzema obstoječe podatke o načinih dodeljevanja človeških linij ESS iz blastociste je bila predhodno sklepa, da je najverjetneje, ko kultivirani blastocist z dobro oblikovanega notranje celične mase (Matične celice uspešno dodelitev ESS: znanstveni napredek in prihodnjih raziskovalnih smeri Nat. Inst, Health USA). S tega vidika je najboljši vir ESS za ustvarjanje linije so človeški blastociste 5. Dan razvoja, od katerega je treba razporeditev mase notranje celične previdno odstranili trophectoderm. Izolirani notranja celična masa sestoji v tej fazi 30-35 celic morajo biti vzgojene na podlagi mišje embrionalne fibroblaste, kar je odločilen pogoj za nastanek kolonij v kulturi hESCs.

Analiza fenotipskih lastnosti embrionalnih izvornih celic

Konkretne obresti med vrstami primerjalna analiza fenotipskih značilnosti ESC. Ugotovljeno je bilo, da človeške kolonije ESC - gosto grozdov sploščenih epitelnih celic, medtem ko miši embryoid tele sestavljena ohlapne konglomerata Zaobljena celic. V človeški indeksa ESC je jedrska plazmi razmerje nižje kot v ESS miško. Embrionalne matične celice opic tvori bolj ravne celične kolonije z neenakomernimi robovi. V zgodnjih klonih primatov ESC se lahko vidijo posamezne celice. Bolj razširjeni hESCs vse vrste živali, ki ne izražajo MHC razreda I in II. Istočasno, človeški sektorski sveti dobimo pozitiven odgovor na protitelesa tera 1-60 in GCTM-2, kar kaže na prisotnost na svoji površini keratin / hondroitin sulfat proteoglikani značilnost zarodka (teratomas) -kartsinomnyh izvornih celic. Izražanje v hESCs vse vrste živali oct4 gena kaže, da kljub fenotipskih razlik v človeških in mišjih ESS, očitno aktivira isti nabor genov, ki so odgovorni za ohranjanje pluripotency (Peru, 2001). Poleg tega, linije ESC, ki izhajajo iz embrionalnih podgan, prašičev, zajcev, primatov, in govedo, imajo podobne morfološke značilnosti, podobno zastavljenih za molekularno identifikacijo markerjev in skoraj enaka molekularni mehanizem za izvajanje programa embriogeneze, ki vam omogoča, da sprejme nov pogled na vprašanje ksenotransplantacija .

Za razliko od običajnih embriogenezo in vivo, se vitro proliferacijo hESCs ne spremlja tvorbo germinalnih plasti in nadaljuje proti bloku homeotičnih Nohgenov ozadje, to je brez organogenezo. Ker segmentacije geni ne delujejo v kulturi hESCs mogoče reproducirati te dobe embriogeneze kot segmentacijo zavihek somitni iz jedra, nastanek hranilni mešiček, allantois provizorično in drugih organov in tkiv. Kulturni ESC so bili zamrznjeni na začetku oblikovanja 350 omejitvenih linij specializiranih celic. Tako matičnih celic klon pomožnih in centralno lokalizirane PGCs so edini model zarodkov v razvoju, v katerih se oblikujejo različne regije tkiva v eni fazi, so drugačni od specializiranih celic, ki izvirajo pa iz skupnih predhodnih sestavin. Čeprav minimalni ravni receptorjev na površini hESCs, imajo možnost za opravljanje primitivne morfogenetski proces za simulacijo večino strukture zgodnjega zarodka: hESCs črpalko v kulturi in agregatov tvori strukturo, ki spominja blastociste ali celo kasneje zarodkov (jajčni valji). Tovrstne suspenzijske agregate so bile ustrezno imenovane kot preprosta in zapletena embrionalna telesa.

Zmeseh diferencirajo v različne celice embryoid telesa v začetku genov ectoderm (UPB3, FGF-5, vozlišča), endoderm (Gata-4), mezoderma (Brachyury), kardiogeni mezoderma (pkh-2,5), nevralne cevi (msx3 hkrati izraženih ) in hematopoeze (elkf). Z uporabo različnih kombinacij citokinov in rastnih faktorjev za ciljanje tvorbo zarodnih plasti celic in vitro v številnih primerih je bilo mogoče pridobiti embryoid teles, ki so prednostno izraženih genov ectoderm ali mezoderma, ki odpira pot za modeliranje gastrulation in zgodnji fazi organogeneze.

Klonov rast hESCs je dokaz delitve asimetrično celic, v katerih le eden od ESS v centru klona ohranja ne omejuje sposobnost razmnoževanja, medtem ko je druga hči celic povzroča generacijo matičnih celic, diferenciacija je že prihaja. Zato klon razmnoževanje hitrost na obodu embryoid telesa je višja kot v centru. Obrobne celice rastnega klona so spontano motene diferenciacije, preselijo ali umrejo z mehanizmi apoptoze. Ti dogodki določajo usodo klona, če je stopnja orožja presega stopnjo migracij in apoptotske celične smrti, klon velikosti še povečati, stabilizacija pojavi z enako apoptoze in stopnjo nastajanja novih celic hitrost, regresije - obratnem razmerju teh procesov. Progenitorske celice se delijo simetrično, to pomeni, da sta obe hčerinski celici dodatno diferencirani v zrele specializirane celične linije. Razmerje ESO / matičnih celic se spreminja, vendar je vedno število enotnih kontaktnih točk je le delček en odstotek populacije matičnih celic. Zato lahko samo previdno pipetiranje in pravočasna razčlenitev klonov poveča število ekonomsko-socialnih vprašanj v kulturi. Razčlenitve klone pojavil v stopnji 10-12 celice najučinkovitejša za pridobitev najvišje hESCs donosa. Smer in stopnja diferenciacije celic v embrionalno telo je odvisna od njihove lokacije. Zunanja embryoid telesne celice ne izražajo gen in oct4 opraviti diferenciacijo v primarnih endoderm celicah iz katere nato oblikujemo epithelioid celice in parietalnih ekstraembrionalne visceralne endoderm. Notranje celice embrioidnega telesa izražajo oct4 gen in ohranijo pluripotenco za 48 ur kulture. Ampak potem je morfološka reorganizacija pojavlja v epitelijskih enoplastni kulturi se začne in izražanje genov, ki nadzorujejo razvoj primarnega ectoderm. Nato začne postopek popolne neurejene citodiferenciranja s pojavom različnih vrst celic, ki so derivati vseh treh germinalnih listov. V procesu spontanega razlikovanja embryoid telesnih celic najprej pojavijo agregatov endoderm markerji v obliki delcev (ciste) hranilni mešiček. Nadalje se v teh strukturah pojavijo angioblasti in endotelne celice rastnih kapilar. V končni fazi spontano diferenciacije notranjih celicah embryoid telesa razvija različne terminalno diferencirane celice, vključno nevronov, glialnih elementov, kardiomiocitih, makrofagov in eritrocitih. V nekaterih približevanju (glede na prostorsko inverzijo listov, ki zarodka tkivo) preko embryoid organov in vitro lahko raziskujejo morfogenetski proces in analizirajo molekularne mehanizme zarodka cytodifferentiation začetnem obdobju, in vzpostavitev vlogo posameznih genov pri izvajanju teh postopkov.

Tako so v klonu celice, v katerih so odkrili različne programe genetskega razvoja - ESC, zgodnji predniki in diferencirane populacijske populacije. Gojitev ESC z metodami kapljičenja ali masne kulture brez hranilne plasti in brez dodajanja LIF v mediju neizogibno vodi v nastanek embrionalnih teles. Morfologija celic zunanjih in notranjih plasti embrionalnih teles je drugačna. Zunanja plast je sestavljena iz velikih procesnih celic. Njihova površina, ki je obrnjena proti okolju, je pokrita s številnimi mikrovili. Zunanja plast celic je ločena od notranje bazalne membrane, ki spominja na Reichertovo membrano, medtem ko so celice notranje plasti embrionalnih teles cilindrični epitel. Morfološko, notranji sloj, čeprav vsebuje veliko delilnih celic, bolj spominja na nediferencirane kolonije ESC.

Značilnosti človeških embrionalnih izvornih celic

Odsotnost parenhimskih-mezenhimskih interakcijami na signalu ozadja blokiranje gene homeosis povzroča neurejenih rast PGCs v kulturi, saj je ta jeziček je pokvarjen in investicije v infrastrukturo s pridržki organov. Neorganizirano rast in neurejeno spontano diferenciacijo hESCs v kulturi zaradi pomanjkanja mezenhimskih oznake stromalni okvir prihodnjih teles: vitro je možno nastajanje milijonov hepatocitov, vendar ga ne more dobiti nobene segmente jeter, vključno s takšnimi strukturnih in funkcionalnih elementov, kot so sinusov, prostoru Disse in Kupfferjevih celic.

Domneva se, da je pluripotency iz ESS realizirani izključno v embriogeneze da tvorijo tkiva in organe iz zarodka, medtem ko so popkovine in posteljice izhaja trofoblast. V plašču trofektodermalnuyu ESK dosledno ustvarjajo celične klone provizorično realizacije razvojnega programa, ki kombinatornih mRNA v velikem obsegu Nohteyaov topografske matriksa, ki določa vnaprej prostorska razporeditev, obliko, dimenzije, število začasnih in dokončnih celicah organskih in sklopa parenhima strukturne in funkcionalne enote. Hkrati krmilnik edini celični tip, v kateri je molekulsko mehanizem realizaciji njihovih potencialov popolnoma ločena od genetskega programa razvoja in energetske storitve same odvzeta možnost interakcij z drugimi celicami zaradi zaprtja obeh zaznav receptorjev in transsignalizatsii sistemov. Vendar pa se ustrezne aktivacije ekonomsko-socialnih svetov rezultati v postopno uvajanje embriogeneze program, ki se je končalo rojstva popolnoma oblikovana in pripravljena za extrauterine življenja organizma sestavljen iz milijard celic. V tem kratkem času, vendar je nepredstavljivo dolga v celičnem prostoru poti neizogibnega pojava napak v molekularnih mehanizmov, ki zagotavljajo vitalne funkcije celic, in v programih, ki nadzorujejo njihovo proliferacije, diferenciacije in specializacije. Zato v sodobnih farmakogenomika obravnavati ločeno bolezen molekularnih naprav, in celic bolezen programiranje. In delovanje večine novih zdravil, katerih cilj je odpravljanje ime programa diferenciacije, orožja in organogenezo, kot tudi regeneracijo organov in tkiv. V organizmu odraslih prek ESO postane mogoče nadzorovati obnašanje izvornih / matičnih celic transplantiranih v možganih, jetrih, vranici, kostnem mozgu in drugih organov pri človeku za popravilo poškodovanega prejemnikove parenhimskih organov zaradi diferenciaciji in specializaciji donator mezenhimskih celic konzervirane matrico. V bistvu je totipotency Program začenja še oocit genomov ravni, zygotes in blastomeres, vendar te celice še ni mogoče klonirati in vnesejo v količinah, potrebnih za potrebe izkustvenih in praktične medicine. Zato je ESC je edinstven vir genetske informacije, ki vsebuje tridimenzionalno linearno restrikcijske mape zarodka in kodekse specializiranih celičnih linijah med gastrulation.

Skoraj neomejene možnosti regenerativne ESC zaradi dejstva, da njihov genom, v nasprotju z genetskim aparata diferenciranih somatskih celic, ohranja pluripotency. Ena manifestacija mirujočem stanju korenine v ekonomsko-socialnih svetov genetskih informacij, je tako imenovani minimalni fenotip - na površini ESS izrazil omejeno število receptorjev, zato razporejeni zelo malo programov za interakcijo transsignalizatsii jedrsko aparat celice s svojo mikrookolja. Glede na mirovanja genov, ki so odgovorni za omejitev specializiranih celičnih linij in diferenciacijo celic, aktivira le okoli 30 od 500 genov, katerih produkti zagotavljajo komunikacijske celice z okoliško mikrookolja. Z metodo serijsko analizo genske ekspresije dokazala, da splošni pomen glavnih funkcionalnih genomu škatle urejajo energije in presnovo v somatskih celic in ESO v zadnjem določena zelo nizko količino mRNA receptorjev, G-proteini, drugi sli, transcriptases, kofaktorjev izražanja in zatiranje da je celoten sistem transmembranski regulativni signala v celico. To je posledica pomanjkanja ali zelo nizko izražanje genov transsignalizatsii. Med diferenciacijo inducira v genomu ESO 18 operaciji se ustavi sinhrono delujočih genov za ozadje aktivacija transsignalizatsii 61 gena, ki nadzoruje sintezo celičnih adhezijskih receptorjev, izvencelicnega matriksa, omejitev transcriptases messendzhernyh elemente in sistem za prenos signala za jedrske naprave z receptorji celične membrane plazmi. Hkrati blokiran izražanje genov, ki so odgovorni za sintezo proteinov dušilce zvoka, kot tudi izražanje genov koingibitorov zagotavljanje totipotency genomov hESCs.

Za celice vseh treh zarodnih plasti je dalo genetskih markerjev. Identifikacija plast ektodermalnih celica izvedena na izražanje genov nodalni, UPB3 in FGF-5, mesodermal celice - gen Brachyury, zeta-globin, endoderm - pri Gata-4 genske ekspresije. Pri normalnem embriogenezo, med gastrulation opazili aktivno migracije nezrelih populacije matičnih in predhodnih celic, lokalno imenovana območja obraznih kosti lobanje, nekateri deli možganov, perifernega živčnega sistema, srčne prevodnosti sistema in timus tkiva, ki se tvorijo iz klonov premakne celic. Označevanje celic zgodnji geni klični list olajša topografskih analizo migracije matičnih celic v razvijajoči se zarodek. To je bilo zlasti, da so celice v agregati embryocarcinoma P19 ekspresijo prve gen mezoderma Brachyury začne pri zmanjšanju genske ekspresije tkivnega aktivatorja plazminogena, a-fetoprotein, keratin 8, in keratina 19, ki so markerji zgodnje mezoderma migracijskih populacije. Zato je oblikovanje tkiv mesodermal izvora se začne šele po procesu migracij in poravnava točkovnih mesodermal matičnih celic.

Z zelo omejeno število funkcij fenotipske in odsotnosti večine blokov transsignalizatsii ESC pa izražajo nekatere molekule receptorjev, ki se lahko uporabljajo za njihovo identifikacijo. Omeniti velja, da so bili antigeni-markerji ESC pri ljudeh in primatih pogosti. Najpogosteje uporabljena za hESCs označevanja označenih protiteles proti antigenom membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (edinstvenih lipidov antigeni predstavljajo kompleksno glikolipidov GL7 z sialne kisline), kot tudi visoko polimerni glikoproteini TRA-1-81, TRA-1-60. Poleg tega hESCs izražajo specifične zarodka antigen SSEA-1 in endogene alkalne fosfataze, kot tudi specifičen transkripcijski faktor Oct4. Slednja je potrebna za vzdrževanje mehanizmov hESCs orožja - Oct4 gen specifičen transkripcijski faktor aktivira izražanje fibroblastnega rastnega faktorja 4 genskega izražanja in stabilizira boks odgovoren za neomejujoč DNA reduplication v nezrelih celic. Najpomembnejši znotrajceličnih označevalne proteini so UPB3, Oct4, TCF in Groucho, povezane z beljakovinami kromatina-glušnikov.

Skoraj takoj po dolgoročnih kultiviranih ekonomsko-socialnih svetov poskusih neuspešen in organizem je bil prvič pripravil kulture matičnih celic, izoliranih iz blastociste miško in primarne zarodne celice kulture, se je začela v fazi študije zmogljivosti pluripotency ESC, če ga dajemo v zgodnjih fazah razvoja zarodka. Izkazalo se je, da je na morula in blastocista PGCs so sposobni oblikovati kimerne zarodkov v katerem darovalke PGCs potomci ugotovljenih v vseh somatskih tkiva in tudi pri spolnih celic. Tako je v razvojne biologije s pomočjo ESO skriptov "most" med eksperimentalnimi študijami in vivo in in vitro, kar bistveno povečalo možnost preučevanje procesov z zaznamki primarnih tkiv in organov, njihovo diferenciacijo in embrionalnih organogenezo.

Znano je, da je in vivo med embriogeneze ESK vključiti v celično maso zgodnji zarodek, in njihovi derivati, so na voljo v vseh organov in tkiv. PGCs kolonizirajo zarodnih himernega zarodnih celic, potomci, ki so v celoti jajce in spermo. Izvornih celic so klonogene - enojni PGCs more ustvariti genetsko identični kolonije celic s molekularnih markerjev, ki vključujejo oct4 izražanje genov in alkalne fosfataze in visoka aktivnost telomeraze, pa tudi ekspresijo specifičnih embrionalnih antigenov.

Za študij mehanizmov embriogenezo uporabi tehnike iz hESCs himerizacija morula z oblikovanjem biološko strukturo, ki se nahaja zunaj sloja tetraploidni blastomeres prejemna in donorska PGCs dajemo v. Tako trofoblast tvorjen iz potomcev tetraploidna blastomeres prejemnika, ki omogoča vsaditev in Placentacija in dajalca PGCs delujejo kot celični masi notranje, katero tvorijo trden zarodno linijo primarnih telesa in predniških gamet. Vrednost študija ESC ni le v tem, ko je manipulacija in vitro s svojim genom ohrani pluripotency, ampak tudi v tem, da ob ohranjanju sposobnosti za sodelovanje pri oblikovanju hESCs prvobitna zarodnih celicah himernim zarodka. Dokazano je, da je samo eden potomec gensko spremenjenih PGCs kolonizirajo vse osnovne in bakterije, ki tvorijo tkanine himerni embria, pridobljenega z združevanjem ali coculture celic z 8-celic zarodka. Ko presajeni v miši morula ESO transficirane z zelenim fluorescentnim gena proteina, so fluorescentno potomci celice najdemo v vseh preiskovanih tkivih razvoju zarodka (Shimada, 1999) s. Presaditev ESC v morula lahko ustvarite uspešne miši, telo, ki zajema le potomci podaril ESC, ki odpira možnosti za različne terapevtske možnosti kloniranja. Zdaj je tak metodološki pristop uspešno uporabljajo za preučevanje problematike razvojne biologije, še posebej, lahko analizira genetske mehanizme inaktivacije kromosoma X ali epigenetske nestabilnost hESCs. Transplantacija ESC v zgodnji zarodek se uporablja tudi v biotehnologiji v kmetijstvu, pa tudi pri poskusih genske terapije.

Transplantacije gensko spremenjenih ESC se uporabljajo za testiranje ciljnih celic mutantnih genov. In vitro kultivirani ESC se uporabljajo v biotehnologiji za ustvarjanje nokatiranih miši. V ta namen s homologno rekombinacijo, ki se odstrani iz sektorski sveti študija genov (knockout) in selektivni medij izločajo celice, ki nimajo tega gena. Nato se knockout ESC-ji vbrizgajo v blastociste ali združijo z blastomeri morule. Tako dobljene kimerna zgodnje zarodke presadijo v ženski prejemnika ter novorojene miši izbran med posamezniki s spolnimi celicami, nullizigotnymi tega gena. S to tehnologijo smo ustvarili številne linije knockout miši, ki se pogosto uporabljajo v eksperimentalni biologiji in eksperimentalni medicini. Na teh bioloških modelov preučevali vrednosti določenih genov v embrionalni razvoj, kot tudi njihovo vlogo v mehanizmih bolezni in bolezenskih stanj pri ljudeh. Poleg tega je na izpadanje živali linija uporablja v fazi predklinični preizkušanja novih metod genske terapije. Na primer, z uporabo gensko transfekciji v ESK normalni alel mutant gena upravljati učinkovito popravljena mutacije, udari sistem hemopoietic. Uvajanje tujih genov v ESC omogoča ustvarjanje linij homozigotnih transgenskih laboratorijskih živali s pospešeno hitrostjo. Vendar pa je treba opozoriti, da je tehnika usmerjena rekombinacijo genov izbris zanesljivo delal, še le relativno miši ESC. Uporaba mišje ekonomsko-socialnimi sveti dvojno izničenje nameščen funkcionalno površino vlogo gruče genov na kromosomu 7 (kopija genomske regije 19 minut humanega kromosoma) in proksimalni odsek 11. Kromosoma (kopiranje humani 5d kromosom) - črtanje teh genov v Mišice ESK so lahko ovrednotile funkcijo njihovih analogov pri ljudeh.

Študije funkcijske sposobnosti humanih embrionalnih genov, transfekciji v genu, ki laboratorijske živali dovoljene hESCs zlasti CRYPTO razjasnitvi vloge gena na kartici in ki gena kardiogeni mezoderma, Pax-6 - v embriogenezo oko. Je prvi ekspresije genov v nezrele proliferirajoče kartice ESO teratokarcinom in blastociste miši potrdili ogromno represijo v ESK transsignalizatsii genov. Kombinacija mutiranih ESS 60-80 in 20-30 celic normalnih pred implantacije zarodkov miško vodi k razvoju himernih zarodkov, v katerem zaznamkov telo je sestavljeno iz donatork in prejemnic celic, ki nam omogoča, da določi vlogo neznanih genov v gastrulation in organogenezo. Funkcionalna zemljevid genov razvoj zarodkov miške povečanih podrobnosti o vlogi genov zavihku sf-1 v nadledvične žleze in spolnih primordia, mas 1-gen - v ledvicah zavihek myoD družinskih genih - v zavihku skeletnih mišic genske družine gata-04/01 - v omejitev zorenja zametke erythro- in limfopoietično.

Usmerjeni off mame in očeta alelov genov v hESCs uporabo vektorskega rekombinazo razjasnile funkcije različnih genov v zgodnji embriogeneza in tehnologija ciljanja človeških neznanih genov v ESS miško prispevajo k odkrivanju novih mutiranih genov, ki so odgovorni za razvoj hudih dednih bolezni. Z metodo knockout definiran obvezuje pomen nekaterih genov za polaganje embrionalnih tkiv: gata-4 - za infarkt, Gata-1 - za eritroidnih hemopoietic tkiva, myoD - skeletne mišice, Brachyury - za omejitev mezoderma transcriptases hnf3 in hnf4 - za matične celice jeter, rag-2 - zaznamki za klonov limfocitov T in B (Repin, 2001). Dvojna izbris genov v hESCs je odprla dostop do študija funkcionalne vloge genov v zarodni plasti, segmentacijo in homeosis in presajanju ESC glede na možnost pridobitve uspešne interspecifične hibridne zarodke. Z izboljšanimi metodami presaditvi PGCs donatork v enem 8-celic zarodka dokazano, da himerizacija na celičnem nivoju številnih organov zarodka prejemnika. Upoštevajte, da se celice ohrovt najdemo v človeških tkiv prejemnik miših organov po dajanju človeških hematopoetskih izvornih celic v blastociste. Ugotovljeno je bilo, da v zarodkov mišjih med tvorbo krvnih teles, ki krožijo pluripotentnih hESCs. Možno je, da je njihova biološka funkcija organizacija prihodnjega ploda imunskega sistema. Z ESC vitro reproducirani ustrezne modele človeškega genetske bolezni: dvojno izničenje modeli distrofinske gena pri miših Duchennove mišične distrofije, zaustavitev atm gena (krmilni signal sinteza kinaze kromatina) - ataksija-teleangektaziyu. V tem primeru, usodna dedna bolezen pri otrocih zaradi napak v popravilo DNA razvija degeneracijo Purkynjevih celic v malih možganih, ki jo spremlja involucijo timusa zaradi smrti proliferirajoče celice. Clinic, patofiziologije in patomorfologija ataksija-teleangek- tazii reproducirajo prek vnosu ESO odvečne genetskih informacij iz miši himere po ustrezajo tistim pri človeku. Poleg ataksija-teleangektazii uporabo PGCs in knockout miši razvila eksperimentalni model, nekatere dedne homozigotne človeških bolezni, povezanih z motnjami ogljikovih hidratov in metabolizma lipidov, razgradnjo aminokislin, odstranjevanje bakra in bilirubina, kar znatno povečano možnost eksperimentalne medicine predkliničnih preizkušanja novih metod za zdravljenje ustreznih bolezni pravice.

[12], [13], [14], [15]

Uporaba citohibrida izvornih celic

Hibridne celice, pridobljene s taljenjem somatskih celic hESCs, so primerni in obetaven model za preučevanje izvornih celic pluripotency in ponovno diferenciranih celic kromosomov. Tsitogibridy dobimo z združitvijo ESC z diferenciranih celic živali odraslih, priložnost, da preuči razmerje med genomov različnih "starosti": razvija edinstveno situacijo, v kateri so homologni kromosomi, ki izhaja iz celic v različnih fazah diferenciacije, in različne stopnje zrelosti, so v istem jedru, kjer jih lahko enostavno transdeystvuyuschimi deliti regulatorne signale. Težko je predvideti, kako se bodo odzvali tsisregulyatornye epigenetsko sistem homolognih kromosomov obstoječih med yn svoje individualne razvoj, v odziv na vpliv transdeystvuyuschih signale iz embrionalnih sorodnih genomov na. Poleg tega je v hibridnih celicah pride do ločevanja staršev kromosoma, ki omogoča, da preuči interakcijo genomov na področju ločenega kromosomov, to je potencialno opredeliti del posebnih kromosomov pri vzdrževanju pluripotency, ali nasprotno, rezultat diferenciacije.

Kot prvi eksperimentalni model za proučevanje interakcije genomov različnih "zgodovine razvoja" uporablja tsitogibridy dobimo z združitvijo teratokartsinomnyh pluripotentne in diferencirane somatske celice. V nekaterih primerih so takšne hibridne celice ohranile pluripotentne lastnosti na dovolj visoki ravni. Zlasti so in vivo na somatskih hibridne teratokartsinomno-celice induciramo razvoj resničnih teratomas vsebujejo derivate vseh treh zarodnih plasti, A in vitro v suspenzijske kulture oblikovanih embryoid telesa. Tudi pri tej vrsti med vrstami tsitogibridov ugotovljenih prisotnosti fetalnih antigenov v primerih, ko so bile somatsko partner pri združitvi z teratokarcinom celic limfocitov ali timocitov. Omeniti velja, da tsitogibridy jih združitev teratokartsinomnyh celic z fibroblastov, ki je skladna s fenotipom fibroblastov.

Najbolj pomembno je, da vzpostavljenega mimo v-teratokartsinomno somatske hibridne celice pojavili znaki genoma ponovno diferenciranih celic, označen s reaktivacijo posameznih genov ali neaktivni X-kromosoma somatsko partnerja. Tako, rezultati raziskav o teratokartsinomno-somatskih celic tipa tsitogibridah razvidno, da hibridne celice pogosto zadržani pluripotency in ponovno genoma, obstajajo znaki somatsko partnerja.

V poskusih pridobiti embrionalne Intraspecifična hibridne celice s taljenjem splenocitov z živali na miško ekonomsko-socialni sveti odraslih študiral lastnosti kot tsitogibridov, analize ločevanje starševskih kromosomov in ocenil pluripotency hibridni genomov. Za medvrstnih hibridnih celic, ki jih fuzijskih teratokarcinom celic z somatskih celic, na splošno označen z nizko ločevanje kromosomov z Tetraploidna ali skoraj Tetraploidna kariotip. Podobno kromosomsko sestavo smo opazili v citotabridu s fuzijo primarnih spolnih celic z limfociti. Hkrati se interspecifični hibridne celice, pridobljene kot posledica združitve miške limfocitov teratokartsinomnyh minka je bil intenziven ločevanje kromosomov somatsko partnerja.

Kakovostno novo fazo v študiji ločevanju starševskih kromosomov v medvrstnih hibridov prišel po razvoju metode mikrosatelitno analizo s polimerazne verižne reakcije, pri čemer je vsaka miš kromosom ugotovljeno nekaj sto označevalcev, ki omogočajo zanesljivo razlikovati med katerima koli homolognih kromosomov v hibridnih celicah.

Z združitvijo ESK (v kivetah HM-1 primanjkuje gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivnosti, 2n = 40, XY, izolirano iz blastocist miške seva 129 / 01A) z splenocitov iz miši congenic črti DD / c ne sprejme nabor hibridnih klonov morfološko imela podobna hESCs. Vsi klone izoliramo na selektivnem mediju, v katerem je rast možna le z gipoksantinfosforiboziltransferazoy aktivne celice. Elektroforetsko analizo pokazala prisotnost vseh klonov alelna varianta gipoksantinfosforiboziltransferazy značilnost miši DD / c. Uporaba citogenetični analizo je bilo ugotovljeno, da je imel štiri tri hibridne kloni okolodiploidny niz kromosomov. Ena skoraj tetraploidna klon vsebuje dve populacije hibridnih celic, od katerih je bila ena tetraploidna, in drugi, manjši - diploidna.

Analiza mikrosatelita, ki omogoča, da diskriminira nobenega par homolognih kromosomov miške 129 / 01A in DD / c, v hibridnih klonov z okolodiploidnym niz je pokazala, da kloni prišlo v dveh ločenih prednostna odprave autosomes somatsko partnerja. Večina avtosomalne klonov HESS2 in HESS3 imel označevalci linijo 129 / 01A, kar pomeni, pluripotentne partner. Izjema je kromosom 1 in I: klone HESS2 in HESS3, skupaj z oznakami celic HM-1, majhno število markerjev prisoten somatsko partnerjev. Ti rezultati lahko posledica nepopolne ločevanje kromosomov 1 in in somatsko partnerja in so skladni s citogenetskimi podatkov, ki trisomija kromosomov, ki se pojavi v 30-40% HESS2 in HESS3 celičnih klonov. HESS4 klon razlikujejo bistveno v kromosomski sestavka: veliko autosomes Ta klon izvira iz genoma ESK (kromosomi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 in 17), vendar kromosomi 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 in 19 so bili predstavljeni homologov obeh staršev. Količinska razmerja mikrosatelitnih označevalcev ti homologni kromosomi ustreza približno 1: 1. To je omogočilo, da avtorji, ki kažejo, da je en homolog izhaja iz genoma ESS in drugi - od diferenciranih celic. V nekaterih subkloni klon HESS4 opazili samo simbolično prisotnost kromosomov 18 in 19 somatsko partnerja. Rezultati kažejo, da so celice klonirati HESS4, poleg ločevanje kromosomov somatsko partnerico, se je odprava enega ali obeh homologov v zgoraj kromosomov pluripotentne genoma, kar pomeni, da je dvostranski ločevanje kromosomov obeh staršev - pojav je precej nenavadno, saj tsitogibridov značilno ločevanje kromosomov samo eden od staršev.

Poleg tega, po 20. Prehodu, vsi kloni hibridnih celic vsebuje samo kromosom X označevalcev zdravih somatsko partnerja, ki je, v klonov je bil nadomeščen kromosom X ESC na X kromosomu somatsko partnerja. To potrjujejo in situ podatki hibridizacije s pomočjo FITC-označene sonde, specifične za mišični X-kromosom: pozitivni signal je bil zaznan samo na enem kromosomu. Opozoriti je treba, da so v prejšnjih stopnjah gojenja (do 15. Prehoda) v skladu s citogenetskimi podatki v številnih celicah obstajali dve X-kromosomi. Zato je uporaba selektivnega medijev vam omogoča, da manipulira sestavo kromosomsko hibridnega celice in usmerjena v izbiro klonov prevažajo z enim kromosomov somatskih partnerske ekonomsko-socialnimi sveti v genomu ozadju.

Kot je edinstvena značilnost genoma tsitogibridov lokalizacija starševskih genomov v enem jedru, seveda postavlja vprašanje ohranjanja lastnosti pluripotentnih embrionalnih genomskih ESC-somatskih hibridov celic v pogojih tesnem stiku z genom diferenciranih celic. Morfološko je citotabrid ESC in somatskih celic podoben starševski liniji ESC. Pogojih pluripotency pokazala, da okolodiploidnym vsi kloni niza so kromosomi sposobni tvoriti v suspenziji kultur embryoid organov, pri kateri so derivati treh zarodnih plasti prisotna.

Večina hibridnih celic vsebuje antigen ECMA-7, značilen za zgodnje mišje zarodke, in tudi visoko aktivnost alkalne fosfataze. Najbolj prepričljivi podatki o visokih pluripotentnih lastnostih hibridnih celic so bili pridobljeni v poskusih za pridobitev vrste injekcijskih himerov, ki vključujejo hibridne celice klona HESS2. Analiza biokemičnih markerjev je pokazala, da so potomci hibridnih celic donorjev našli v večini tkiv kimera. Zato hibridne celice, pridobljene s fuzijo ESC in somatsko diferenciranih celic, ohranijo pluripotenco na visoki ravni, vključno s sposobnostjo, da se tvorijo himere, ko se vstavijo v blastocistno votlino.

Kloni HESS2 in HESS4 so se bistveno razlikovali v sestavi matičnih kromosomov, vendar so imeli podobne pluripotentne lastnosti. Ena bi domnevala, da plyuripotentnostv "v hibridnem genomu se kaže kot prevladujoči znak, vendar je možno, da niso vsi embrionalnih genoma kromosomov sodeluje pri vzdrževanju pluripotency. Če je ta predpostavka pravilna, lahko pričakujemo, da izločitev nekaterih kromosomov pluripotentnega partnerja iz genoma hibridoma ne bo spremljala sprememba njihovega pluripotentnega stanja. V tem primeru bi bila analiza ločitve staršev kromosoma v embrionalnih hibridnih celic, omogočajo, da pridejo blizu, da prepoznajo kromosome, ki so odgovorni za nadzor pluripotency iz embrionalnih celic.

Serov O. In ostali (2001) je pokazala med 50 potomcev, pridobljenih iz križanja z himer z običajnimi miši, tiste, ki bi imelo genotip miši 129 / 01A, in nosi kromosom X DD miši. Avtorji vidijo razlog za to pri zmanjšanju pluripotentnosti v hibridnih celicah pod vplivom somatskega genoma. Alternativa razlaga je lahko negativen učinek trisomijo nekaj neravnovesja autosomes in spolnih kromosomov (XXY opazili v celicah do 15. Prehod) v hibridnih celicah ob prehodu mejoze. Znano je, da celice XXY ne morejo preiti skozi mejozo in oblikovati gamete. Trisomy lahko povzroči tudi zmanjšanje proliferativne aktivnosti hibridnih celic, zaradi česar lahko selektivna prednost pri razvoju himera pripada celicam prejemnikovega zarodka. Iz tega sledi, da je za ustrezno vrednotenje pluripotentnega potenciala hibridnih celic potrebno pridobiti hibridne klone z običajnim diploidnim kompletom kromosomov.

V poskusih Serova O. Et al (2001), prvi je pokazala možnost reprogramiranja X kromosom v genom somatskih celic hibridno celico. Ta ugotovitev izhaja iz avtorji analizirali ekspresijo himere HPRT gen (X-kromosom marker): prisotnost alelne variante HPRT DD / c miši so odkrili v vseh tkivih analiziranih himerno. Treba je poudariti, da po uvedbi hibridnih celic v blastociste votlini tsitogibridy spadajo v neselektivnih pogoji in ohranjanje kromosom X v genom hibridnih celicah pomeni, da je postala nujen usklajen del svojega genoma in ga ne razlikuje od Y kromosoma pluripotentne partnerja.

Povzema rezultate analize interakcije somatske in pluripotentnih embrionalnih genoma v hibridnih celicah, avtorji ugotavljajo, da je v določenem tsitogibridah pluripotency pojavi kot prevladujočega lastnost. Hibridni gen sposoben posameznih kromosomov programirati diferencirane celice, kar pa ne izključuje obraten učinek na somatske genoma pluripotency embrionalnih genoma. Pri gojenju hibridnih celic pride do indukcije diferenciacije veliko pogosteje kot v prvotni nadrejeni liniji ESC NM-1. Podoben učinek so opazili pri oblikovanju primarnih družin: več primarnih kolonij zarodkov hibridnih celic, ki se razlikujejo v zgodnjih fazah izobraževanja z veliko izgubo klonov med njihovo vzrejo in razmnoževanje.

Tako tsitogibridy z združitvijo ESC z somatskih celic, v kljub tesnem stiku z genom diferenciranih celic ohraniti pluripotency kot edinstvena značilnost zarodka genoma. Poleg tega je v takšnih hibridnih celicah mogoče reprogramirati posamezne kromosome, ki izvirajo iz razpršenih celic. Ostanek je nejasen, v kolikšni meri pluripotentne lastnosti embrionalnega genoma v hibridnih celicah ostajajo še zlasti njihova sposobnost sodelovanja pri nastanku embrionalne poti v hibrih. Za to je potrebno pridobiti embrionalne hibridne celice z normalnim kariotipom. V vsakem primeru pa lahko pluripotentnih embrionalnih hibridne celice se pravi model za genetsko identifikacijo kromosomov, ki sodelujejo pri vzdrževanju pluripotency ali njenega nadzora kot dvostranski ločevanje starševskih kromosomov potencialno zagotavlja takšno priložnost.

Nič manj privlačnega je preučevanje tega pojava, ki ga O. Serov in soavtorji (2001) opredeljujeta kot »kromosomni spomin«. V hibridni genoma homologni kromosomi so dva alternativna konfiguracije: homologov somatsko partner enkrat doživela diferenciacije, medtem homologov pluripotentne partnerja, ta proces se šele začenja. Zato vzdrževanje visokih pluripotentnih lastnosti hibridnih celic kaže, da "pluripotentnimi" konfiguracije homologov ESC dokaj stabilen v hibridnih genomov, kljub vplivu transdeystvuyuschih dejavnikov, ki izhajajo iz somatsko partnerja. Zgoraj opisane značilnosti preprogramiranjem razlikujejo homologne genomu kromosomov med razvojem himere ne izključujejo možnosti, da so prve faze nastajanja in vitro in kultiviranje tsitogibridov ohranijo svoj status, pridobljenih med diferenciacijo in vivo. Po zadnjih podatkih, ob prenosu zarodkov hibridnih celic v brez-selektivnem mediju, v katerem je intenzivno le kromosomi odprave somatsko partnerja, to je genom hibridnih celic lahko razlikuje homologe po vitro kulture 10-15 prehodov. Tako embrionalne hibridne celice predstavljajo obetaven eksperimentalni model za študij, ne samo od temeljnih lastnosti zarodka genoma kot pluripotency, ampak tudi njene alternative - zarodka diferenciacijo.

Terapevtska učinkovitost transplantacije zarodnih matičnih celic

Pred analizo terapevtske učinkovitosti transplantacije ESC in njihovih derivatov povzemamo zgornji material. Lastnosti ESC glede polnega izvajanja embriogeneze in vitro so nezadostna zaradi napak v tem primeru zaradi odsotnosti mezenhimskih matičnih celic, ki se pojavljajo v telesu samostojno in neodvisno od hESCs. Genetska moč ESK manj genetski potencial zygotes torej neposredno za kloniranje zarodki ekonomsko-socialne svete ne uporablja. Edinstvena biološki potencial hESCs kot so samo celice, v kateri so razvojni programi, razporejenih v celoti dosledno izvajanje, uporabljati v študiji študij genske funkcije. Uporaba ESK izvaja dekodiranje Prvi signal kombinacije, ki aktivira izražanje zgodnjih in poznih genov, ki kodira za razvoj treh zarodnih plasti. Ohranjanje genoma pluripotency ekonomsko-socialnih svetov in vitro jih naredi edinstveno orodje za popravilo regeneracijo, ki lahko samodejno izravnavo izgub celic poškodovanih organov in tkiv. V idealnem hipotetično izvedbi lahko sklepamo, da je "... S presajanjem PGCs donatork v organizmu prejemnika prenesejo kompaktno pakirani programe, ki so pod ugodnimi pogoji realizirane pri gradnji novega tkani'7 sposoben" ... Učinkovito vključiti v telesu prejemnika kot morfološka, funkcionalno in funkcionalno. "

Seveda, po razvoju metod za monodiferencijo ESC, se je začelo in vivo študije funkcionalne aktivnosti celic, pridobljenih in vitro, iz enega specializiranega klona. Razširjeni klon ESO ustvarja populacije migrirajočih progenitornih celic, ki se resnično lahko aktivno vključijo v cone tkivne poškodbe prejemnika, ki se uporablja v regenerativno-plastični medicini. Ugotovljeno je bilo, da presaditev Dopa-nevronov v substanciji nigra zmanjša klinične manifestacije pri eksperimentalnem hemiparkinsonianizmu. Regionalne presaditve donorskih izvornih celic zmanjšajo stopnjo motoričnih motenj, ki jih povzročajo travma ali kontuzija hrbtenjače in možganov. Prejeti in prvi pozitivni rezultati transplantacije izvornih celic pri demielinizirajočih boleznih. Zdi se, da regenerativno-plastična moč ESC-a odpira neomejene možnosti za uporabo celične transplantacije v praktični medicini. Vendar pa se pri presajanju v ektopične cone ESK neizogibno preoblikujejo v tumorje. Kadar se tvorijo subkutane injekcije ESC pri imunsko neopredeljenih teratoma miši. Ko presajanje pod kapsula gnojevke ESK testisov v singenskih miših tako tvorjen teratomas so sestavljeni iz različnih tkiv, celic, ki so derivati vseh treh zarodnih plasti. V takih teratome so procesi zmanjšane organogeneze izredno redki.

Številni del dajejo informacije o pozitivnih rezultatih presaditve zgodnjih derivatov ESCO na živali z eksperimentalno patologijo. Mobilni neurotransplantation uporabo derivate PGCs nadalje razvita v poskusu in prvih kliničnih poskusih za korekcijo funkcionalnih motenj v možganih in travme hrbtenjače, zdravljenje siringomielija in multiple skleroze (Repin, 2001). S prihodom tehnologije neyronogeneza ESO in vitro, ki uporablja zarodka možganskem tkivu tehnike presajanja razvite derivate neurospheres, pridobljenih iz kultur embrionalnega živčnem tkivu. Takšne presaditvene suspenzije so veliko bolj homogene in vsebujejo predregistrirane nevrone in nevroglične predhodnike.

Poleg rednega gojitvenem mediju s retinojske kisline v odmerku 10 ^ g / ml pri 6 tednih embrionalnih linij (teratomas) NTERA-2 humani -kartsinomy tvori več kot 80% po mitotićnih nevronov. Popolna homogenost nevronske prebivalstva doseže pretok označenih immunophenotypic označevalcev zrelih nevronov, ki se lahko znebite ostankov teratokartsinomnyh in nezrele celice sortiranje. Po presaditvi v različnih regijah možganov poskusnih živali se ti nevroni ne samo preživeti, ampak tudi vlagati v regionalnih nevronskih mrež. Pri živalih z eksperimentalnih modelih lokalnih napak CNS neurotransplantation zmanjša klinične manifestacije človekovega patologije kot so učinki kraniocerebralna travma, kap, demielinizirajoče bolezni, dedne cerebelarni razvojnih okvar, boleznih odlaganje lipidov in polisaharidov.

Za optimizacijo regeneracijskih procesov pri degenerativnih boleznih centralnega živčnega sistema se razvijajo tehnologije za pripravo oligodendrocitov, ki proizvajajo mielin. Prva faza tradicionalno vključuje širjenje ESC z množenjem števila celic, potrebnih za presaditev. V drugi fazi izvajamo usmerjeno diferenciacijo celic v populacijo mielinovih predhodnih sestavin oligodendrocitov, ki ga nadzirajo selektivni označevalni antigeni.

Nekatere možnosti so odprte za izvedene finančne instrumente uporabo ESS za razvoj metod za korekcijo imunske pomanjkljivosti, ki jih genetskih napak povzročeno zorenja priželjca. V študijah pri knockout (rag 1) miši z inducirano genskega defekta - zlorabo rekombinacija Mehanizem V (D) J gen lokusov TCR, ki vodijo do izgube funkcije limfocitov T, transplantacije zgodnje derivati PGCs v timus žival opomore zorenje normalnih populacij imunskih klonov, ki so odgovorni za celična imunost. Klinični poskusi presaditev predoblikovane in vitro hESCs za zdravljenje usodno dedno anemije pri otrocih.

Nasprotovanje hitro uvajanje transplantacija matičnih celic pri kliničnih poskusih so upravičena zaradi omejenega števila stabilnih linij človeških izvornih celic in potrebo po standardizaciji. Za povečanje čistosti standardnih linij ESC in matičnih celic odraslih je predlagana metoda izbire vrstic, ki temelji na molekularni genetski analizi kratkih tandemskih ponovitev DNK. Potrebno je tudi preveriti linije ESC prisotnosti majhnih kromosomskih aberacij in genskih mutacij, možnost pojava, ki v pogojih celične kulture je precej velika. Teza razširja obvezno testiranje lastnosti vseh vrst PGCs in regionalnih pluripotentnih matičnih celic, saj lahko njihovo razmnoževanje in vitro povzročijo nove značilnosti, ki niso v zvezi izvornih celic do dokončne ali tkiv. Zlasti se predvideva, da dolgoročno gojenje v medijih s citokini Hess bližje tumorskih celic, saj se pojavljajo podobne poti sprememb, ki urejajo celic cikel s pridobitvijo sposobnosti za izvedbo neomejeno število celičnih delitev. Nekateri avtorji, na podlagi potenciala za razvoj tumorjev, menijo, da je človeška transplantacija zgodnjih derivatov embrionalnih izvornih celic kot nesmotrnost. Po njihovem mnenju je veliko bolj varno uporabiti zavezane potomce ESC, to je linije prednikov diferenciranih celic. Vendar zanesljiva tehnika za pridobivanje stabilnih človeških celičnih linij, ki se razlikujejo v pravo smer, še ni razvita.

Tako je v literaturi vedno več podatkov o pozitivnem terapevtskem učinku transplantacije derivatov človeških embrionalnih izvornih celic. Vendar pa je veliko teh del predmet revizije in kritike. Nekateri raziskovalci verjamejo, da so rezultati zgodnjih kliničnih preskušanj predhodni in predlagajo le, da matične celice lahko koristno vplivajo na klinični potek bolezni. Zato je treba pridobiti podatke o dolgoročnih rezultatih presaditve celic. Kot argument je podana stopnja razvoja klinične nevrotransplantologije. Dejansko v literaturi, na začetku prevladuje objavo visok izkoristek možganskih transplantacijah fragmentov zarodkov pri Parkinsonovi bolezni, nato pa se je začela pojavljati poročila zanikanje terapevtske učinkovitosti zarodka ali plodu živčnem tkivu presajenega v možganih bolnikov.

Izvajajo prvih kliničnih poskusov ocenjevanja varnosti presajanja neuroblast - derivate PGCs NTERA-2 teratokarcinom, so nezrele celice, ki proliferirajo v kulturi podvržemo shranjevanje 100 milijonti celične mase. Del tako dobljene celic smo uporabili za določitev karakteristike celic fenotip in nečistoč, kakor tudi za testiranje možnosti onesnaženja z virusi in bakterije. Iz smo gojišče odstrani LIF in podajanje plast stromalnih celic in fetalnih ustvarjeni pogoji za usmerjeno diferenciacijo hESCs v neuroblasts s kombinacijo citokinov in rastnih faktorjev. Potem so bili nevroblasti očiščeni iz nezrelih celic teratokarcinomov na sorterju s pretočno cevjo. Po drugi čiščenje in karakterizacijo fenotip presajenih celic neuroblasts (10-12 milijonov) suspenzija s posebno brizgo in mikrokanilami stereotaxy in pod nadzorom CT vbrizga v jedru basalis možganov bolnikov (sedmega meseca po hemoragične kapi). Odnogodovoy po presaditvi pregledovanje učinke transplantaciji nevronov v taktni coni pokazala nobenih škodljivih in neželenih učinkov. Polovica bolnikov je doživela izboljšanje motorične funkcije v obdobju od 6 do 12 mesecev po presaditvi. Pozitivne klinične spremembe je spremljal povečanje oskrbe krvi kapi območju po presaditvi celic: srednja absorpcijsko povečanjem fluorescenčno zaznamovana 2-dezoksiglukoze po emisijsko tomografijo pozitronsko dosegla 18%, in v nekaterih bolnikih - 35%.

Vendar je ameriški nacionalni inštitut za zdravje opravil neodvisno študijo klinične učinkovitosti nevrotransplantacije pri bolnikih s parkinsonizmom. Bolnike v prvi skupini so presadili z embrionalnim živčnim tkivom, ki so proizvedli dopamin, medtem ko je bila druga skupina bolnikov podvržena lažnemu delovanju. Rezultati kažejo nič klinično učinkovitost takega Neurotransplantation, kljub dejstvu, da dofaminprodutsiruyuschie embrionalnih nevrone preživela v prejemnikov možganov. Poleg tega je po 2 leti po transplantaciji fetalnega živčnem tkivu pri 15% bolnikov je razvilo trajno diskinezijo, ki je prisoten pri bolnikih, ki so prejemali placebo (Matične celice: znanstveni napredek in prihodnjih raziskovalnih smeri Nat Inst, zdravja ZDA ...). Nadaljujejo se opazovanja nadaljnjega razvoja bolezni pri teh bolnikih.

Nekateri avtorji pripisujejo kontradiktorno literaturo o oceni kliničnih podatkov Neurotransplantation učinkovitost z drugačnim pristopom k izboru bolnikov skupin, neustrezna izbira objektivnih metod za ocenjevanje njihovega stanja in, kar je najpomembneje, različni pogoji za razvoj ploda živčnem tkivu in v različnih delih možganov, iz katerega je tkanina, proizvedenih v različnih velikostih presaditev in metodične lastnosti kirurškega posega.

Omeniti je treba, da je poskus neposredne presaditve pluripotentnih embrionalnih zarodnih celic v striatnem predelu možgan podgan z eksperimentalno telesne gemiparkinsonizmom spremlja proliferacijo ESO in njihovo diferenciacijo v dopaminergične nevrone. Treba je smatrati, da novo nastali nevroni učinkovito vgrajen v nevronske mreže kot smo opazili sektorski sveti po presaditvi popravljanje nepravilnosti obnašanja in motornega asimetrije v testu apomorfina. Hkrati so nekatere živali umrle zaradi preoblikovanja presajenega ESK v možganski tumor.

Strokovnjaki državnega in medicinske akademije v ZDA, strokovnjaki iz National Institutes of Health menijo, da je klinični potencial hESCs zasluži resno pozornost, pa vztrajajo, da je treba za podrobno preučevanje njihovih lastnosti, verjetnost zapletov in dolgoročnih učinkov pri poskusih z ustreznimi bioloških modelov človeških bolezni (Matične celice in prihodnja regenerativna medicina National Academy Press, matične celice in prihodnje smeri raziskovanja., Nat. Inst, Health USA).

S tega stališča je pomembno, da je primerjalna Histološka analiza poskusnega teratom pridobljen s presaditvijo v testisov PGCs črpalko s teratomas ki so razvile zaradi transplantata zgodnji zarodek, ki je vključevala tudi prisotna ESO pokazala, da ESK glede na njihovo poreklo ali interakcijo z s tistimi ali drugimi okoliškimi celicami na enak način uresničijo svoje tumorske moči. Izkazalo, da imajo takšne teratomas je klonskega izvora, kot iz tumorja ESO lahko pojavijo, sestavljena iz derivatov vseh treh zarodnih plasti (.Rega, 2001). Omeniti je treba, da kadar presajeni v imunsko pomanjkljivostjo miši kloniranih PGCs z normalnim kariotipom in tvorjenih teratomas so sestavljeni iz različnih vrst diferenciranih somatskih celic. Ti eksperimentalni podatki so odličen dokaz klonskega izvora terata. Z vidika razvojne biologije, pa kažejo, da ni mnogokratnik predanih matičnih celic in pluripotentne matične celice identitete je vir, ki se razlikujejo derivatov vseh treh zarodnih plasti, teratom komponent. Vendar pa v so praktični rezultati presaditve celic teh študij, če ne previsoki, potem opozorilni znak potencialno nevarnost, saj cepljenja ESC ali prvobitnih zarodnih celic v različnih tkivih odraslega imunsko pomanjkljivostjo miši neizogibno povzroči razvoj tumorjev iz presajenih matičnih celic. Neoplastični degeneracija ectopically presaditi ESC, ki ga spremlja pojav satelitskih populacije diferenciranih celic -, ki ga delno razlikuje gotovo ESS in zarodnih kloni namenske linije. Zanimivo je, da so hESCs presadkom v celicah skeletnih mišic v bližini teratokartsinomnymi nevroni tvorijo bolj pogosto. Vendar pa je v upravljajo PGCs Mace jajce ali blastociste skupaj s popolno integracijo v zarodnih celicah brez tvorbe neoplastične celice. Hkrati ESC vgrajeni v skoraj vseh organov in tkiv zarodka, vključno s spolnim rudiment. Take allofennye živali smo najprej pripravili z izpostavljanjem teratokarcinom celico 129 v zgodnjih fazah zarodkov pri 8-100 celic. V allofennyh miših prebivalstvu geterogenomnyh PGCs donatorske celice izvirajo uvedli v kostnem mozgu, črevesja, kože, jetra in spolovila, ki vam omogoča, da ustvarite v poskusu celo med vrstami himere celic. Manjši čas zgodnjega zarodka, višji odstotek celic himerizacija, najvišjo stopnjo himerizacija opazili v krvotvornih sistem, kožo, živčni sistem, jetra in tankega črevesa allofennogo zarodka. V organizmu odraslih tkivo mogoče himerizacija zaščiteni pred izpostavljenostjo imunski sistem prejemnika gistogematicalkie pregrad v: presajanje prvobitni zarodnih celic v testisih parenhima z vstavitvijo darovalec matičnih celic skupaj v prejemniku tkiva germenativny plasti. Vendar presaditev ESO v postavitev blastociste kimernih primordia genitalij z generacijo donatork prvobitni zarodnih celic ne pride. ESO pluripotency pri ustvarjanju posebnih pogojih in se lahko uporablja za kloniranje: ESC transplantacijskih miših 8-16-mišja celica embria, celične mitoze pri čemer tsitokalazinom blokiran, prispeva k normalnemu embriogenezo z razvojem PGCs donorskih zarodkov.

Zato alternativa je transplantacija alogensko ESO terapevtskega kloniranja temelji na jedrski presaditve somatskih celic v izvedeni enucleated oocita ustvariti blastociste notranjo celično maso, iz katerih se nato dodeljena linijo genetsko identičnih donatorskih PGCs somatsko jedru. Tehnično, ta ideja je izvedljiva, saj je možnost ustvarjanja človeških zarodnih izvornih celic linij iz blastociste, pridobljenih po presaditvi somatskih jeder v enucleated jajčno celico večkrat izkazal pri poskusih na laboratorijskih živalih (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Zlasti pri miših homozigotna za rag2 mutacije, fibroblasti, pridobljen z gojenjem subepidermalnih tkivne celice smo uporabili kot so jedra donorske presajeni v enucleated oocitov. Po aktivaciji oocitov "zigota" gojimo do tvorbe blastociste od mase notranje celične izoliramo PGCs in jih poteka v vrsti za mutantni gen nullizigotnyh celic (rag2 ~ / ~). S homologno rekombinacijo v takih ESC je bila korigirana mutacija enega alelnega gena. V prvi vrsti poskusov iz hESCs rekombinantni gen vrniti pripravimo embryoid telesa, transfektiramo celice njena z rekombinantnim retrovirusom (HoxB4i / GFP) in po razmnoževanje pri miših injicirali vene rag2 ~ / ~. V drugi seriji tetraploidnih blastomeres združijo z gensko spremenjenimi hESCs in jih presaditi v samico prejemnico. Born imunokompetentnih Miši darovalcev kostnega mozga za presaditev mutantne miši rag2 ~ / ~. V obeh serijah je bil rezultat pozitiven: 3-4 tedne pri vseh miših normalnih zrelih mieloične in limfnih celic, je bilo ugotovljeno, sposobna proizvajati imunoglobulinov. Tako lahko presaditev v oocit jedra somatskih celic lahko uporablja le za proizvodnjo človeških zarodnih izvornih celic linij, ampak tudi za tsitogenoterapii - popravek dednimi motnjami uporabljajo ESO kot vektor za prevoz popravljanje genetsko informacijo. Toda v tej smeri presaditve celic, poleg bioetičnih težav, obstajajo tudi omejitve. Ni jasno, kako varna bo presaditev terapevtsko klonirane celice z genotipom, ki je enak genotip posameznega bolnika, saj lahko te celice uvede mutacije, ki ustvarjajo nagnjenost k nekaterim boleznim. Običajni človeški jajca nedostopni objekt, ker tudi če presaditev somatskih jedra v Moodle enucleated živali jajčnih celic le 15-25% inženirstva "zigota" razvoj na stopnji blastociste. Tako se ni opredeljeno, koliko blastocist je potrebna za pridobitev ene linije pluripotentnih klonirali hESCs. Upoštevati je treba in visok nivo finančnih stroškov, povezanih s kompleksnostjo metodologije terapevtskega kloniranja.

Če povzamemo, v pluripotency genomu ESO hypomethylated DNA v kombinaciji z visoko aktivnost telomeraze in kratko fazo C ^ celičnega cikla, ki zagotavlja intenzivno in potencialno neskončno množenje, v katerem PGCs zadrži diploidnih kromosomov in "juvenilne" niz fenotipskih značilnosti. Klonov rast PGCs v kulturi ne izključuje njih razlikujejo v katere koli specializirane celice organizma pri širjenju na postajališče linije in dodal, ustrezne regulativne signale. Omejitev razlikovanje hESCs v skladu vitro somatske celice uresničiti brez sodelovanja mesenchyme, mimo Nohteyaov, je organogeneza in brez nastanek zarodka. Zunajmaternična vivo dajanje PGCs neizogibno vodi do teratokarcinom oblikovanja. Presaditev ESC v blastociste ali zgodnji zarodek, ki ga spremlja njihovo povezovanje s tkivi zarodka in njene stabilne himerizacija organov.

Regeneracijske in plastične tehnologije, ki temeljijo na presaditev celic je sečišče interesov članov celične biologije, razvojne biologije, eksperimentalne genetike, imunologije, nevrologije, kardiologije, hematoloških in mnogih drugih področjih eksperimentalne in praktične medicine. Najpomembnejši eksperimentalni rezultati potrjujejo možnost reprogramiranjem izvornih celic s smerjo spremembe njihovih lastnosti, ki odpira možnosti za zatiranje cytodifferentiation procesov z rastnimi faktorji - za miokardni regeneracijo, obnovo lezij osrednjega živčevja in normalizacije delovanja aparata otočkov trebušne slinavke. Vendar širjenjem presaditve derivati ESO v medicinski praksi je treba raziskati lastnosti izvornih celic človeških podrobneje v nadaljnji poskusi z PGCs v eksperimentalnih modelih bolezni.

Bioetike vprašanja in problem zavrnitve presadka alogensko celic bi lahko rešila opaženo plastičnost genoma regionalnih odraslih izvornih celic. Vendar, začetna informacija je, da ko presajanje jetrih izoliramo in temeljito označen avtolognih hematopoetskih celic, od katerih je nova hepatocitov, ki vsebujejo v jetrih lobules, se sedaj pregledujejo in kritizirali. Vendar objavil podatke, da je presaditev nevronskih matičnih celic v timusu tvorba novih ohrovt dajalca T-limfocitov B in presajanje nevralne izvorne celice v možganih v kostnem mozgu vodi do tvorbe hematopoetične kalčkov trajno dajalca mieloidnih in eritropoeze . Zato lahko pri odraslih organov ohraniti pluripotentnih matičnih celic, ki lahko genoma reprogramu ESC do zmogljivosti.

Vir ESS za medicinske namene, je še vedno človeški zarodek, ki je normo neizogibnost novega prehoda moralnih, etičnih, moralnih, pravnih in verskih vprašanj na izvoru človeškega življenja. Odkritje ESS je močno spodbudilo nadaljevanje grobih razprav o tem, kje je linija med živimi celicami in materijo, snovjo in osebnostjo. Istočasno ni nobenih univerzalnih norm, pravil in zakonov o uporabi ESC v medicini, kljub večkratnim poskusom ustvarjanja in sprejemanja. Vsaka država v svoji zakonodaji sam po sebi rešuje ta problem. Zdravniki z vsega sveta še naprej poskušajo razviti regenerativno plastično medicino, ki presega takšne razprave, predvsem z uporabo ne-embrionalnih izvornih celic, in rezervami izvornih celic odraslega organizma.

Nekaj zgodovine osamitve izvornih celic zarodka

Terato- (embrio) celic smo izolirali iz -kartsinomnye spontano pojavljajo testisov seva teratomas miške 129 / terciarni Sv, spontane jajčnikih teratomas mišje linije Lt / Sv, in iz teratomas smo presadili ektopichno vir celice ali zarodka tkiva. Med tako dobljenih terato- stabilnih linij miški (zarodkov) -kartsinomnyh nekatere celice so pluripotentne, ostali pa so bili na diferenciacijo samo v celicah ene določene vrste, in nekateri so bili na splošno nesposoben cytodifferentiation.

Takrat je bil poudarek raziskave, ki je pokazala na morebitno vrnitev terato- (embrio) -kartsinomnyh celice na normalen fenotip po njihovi uvedbi v tkivo zarodka v razvoju, kot tudi delo za ustvarjanje in vitro gensko spremenjenih terato- (embrio) -kartsinomnyh celice, v katerih smo pripravili mutant miši za biološko modeliranja človeških dednih bolezni.

Kondicionirana kultivacija suspenzije je bila uporabljena za izolacijo linij celic terapevtskih celic. V kulturi terato- (embrio) -kartsinomnye celic, kot ESO, rastejo, da se tvori embryoid telesa in zahteva, da je treba prevesti v skladu zavezujoč disociacijo ohranjanje pluripotency na napajalni plast embrionalnih fibroblastih ali suspenzije kultiviranju v kondicioniranem mediju. Terato- pluripotentnimi celice (embrio) - karcinom linije velik, sferične imajo visoko aktivnost alkalne fosfataze, tvorita agregate in so sposobni večsmerno diferenciacije. Pri vnosu v blastociste se združijo z morulae, kar ima za posledico tvorbo kimernih zarodkov, v različnih organov in tkiv, ki so derivati Najdenih terato- (embrio) -kartsinomnyh celice. Vendar pa je velika večina tovrstnih himernih zarodkov umre v maternici in v organih preživeli hibridnih bitij novorojenčka tuje celice in le redko odkrijejo z nizko gostoto. Hkrati pojavnost tumorjev (fibrosarkoma, rabdomiosarkom, in druge vrste malignega otekline in adenom slinavke) strmo naraste in neoplastične degeneracijo pogosto pojavlja tudi v maternici himernih zarodkov.

Večina celic terapevtskih celic karcinoma v mikro-okolju normalnih embrionalnih celic skoraj naravno pridobi maligne neoplastične lastnosti. Menijo, da je nepovratna malignost posledica aktivacije proto-onkogenov v procesu strukturnih preureditev. Izjema so celične linije embriokartsinomnoy SST3, teratom izveden iz glodalskega testisov (proge 129 / SV-ab), ki kažejo visoke sposobnosti za vključitev v tkiva in organov plod brez nadaljnega nastanka tumorjev v kimernih miših. Derivati celičnih linij zarodka terapevtskih karcinoma v mišjih kimera praktično ne sodelujejo pri nastanku primarnih gonocitov. Očitno je, da je povezan z visoko frekvenco kromosomskih aberacij skupne večini terato- (embrio) -kartsinomnyh progah v katerem celice opazili anevploidije ali kromosomske nepravilnosti.

V laboratoriju smo pridobili več stabilnih linij človeških teratoskopskih karcinomov, za katere je značilna pluripotenca, visoka proliferativna aktivnost in sposobnost razlikovanja z rastjo kultur. Zlasti je bila za proučevanje mehanizmov nevronske citodiferenciranja uporabljena linija človeških celic človeškega terapevtskega karcinoma NTERA-2. Po presaditvi celic te linije v subventrikularno regijo prednjega dela novorojenčkov so opazili njihovo migracijo in nevronogenezo. Bilo je tudi poskusi presaditev nevronske terato- dobljene z gojenjem celic (embrio) -kartsinomnoy linijo NTERA-2, paciente s udarcev, ki so po avtorjev, ki vodijo do klinično izboljšanje bolezni. V tem primeru niso bili opaženi primeri malignosti presajenih celic linije NTERA-2 terapevtsko-karcinomnega raka pri bolnikih z možgansko kapjo.

V prvi vrstici nediferenciranih pluripotentnih embrionalnih matičnih celic miši v zgodnjih 80-ih letih prejšnjega stoletja dobil Evans in Martin, da jih izberete iz mase notranje celice v blastociste - embrioblasta. Izolirane linije ESC za dolgo časa ohranjajo pluripotenco in sposobnost razlikovanja v različne vrste celic pod vplivom dejavnikov posebnega kulturnega medija.

Izraz "pluripotentnih embrionalnih zarodnih celic" pripada Leroy Stevens, da je preiskava vpliva tobaka katranske o pogostosti razvoj tumorjev opozorili na spontane testisov teratokarcinom linearnih (129 / v) miši iz kontrolne skupine. Modih teratokarcinom celice smo značilen po visoki stopnji proliferacije in v prisotnosti tekočine, ki ostane v trebušni votlini s tvorbo spontano diferenciacije nevronov, keratinocitov, hondrocitov, kardiomiocitih, kot tudi za lase in kostnih fragmentov, vendar brez navedbe urejen cytoarchitectonics primerno tkiva. Pri sajenju v teratokarcinom celični kulturi goji nevezan na substrat pluripotentnih klonov in oblikovani embryoid telesa smo nato pogasimo in podvržemo spontane cepitve neurejeno diferencirajo v nevronov, glia, mišičnih celicah in kardiomiocitov. Stevens ugotovljeno, da teratokarcinom miš 129 / vol vsebuje manj kot 1% celic, primernih za diferenciacijo v različne specializirane somatske linije, in sama diferenciacija je odvisna od faktorjev, ki jih zadevajo (Sestavek peritonealna tekočina, proizvodi dodane kulture zrelih celic ali tkiv). Leroy Stevenson predpostavko o prisotnosti med teratokarcinom celic zarodka predniških spolne zarodnih celic je bila potrjena: suspenzijo embrioblasta preimplantiranih zarodkov celic pri odraslih mišjih tkivih tvorjen teratokarcinom, in so ločeni od njih čistih celičnih linij po intraperitonealni aplikaciji, da so živali prejemnice razlikujejo v nevronih, kardiomiocite in druge somatske kletki derivati vseh treh zarodnih plasti. V poskusih in vivo presaditve ESK (pridobljen iz embrioblasta vendar ne trofoblast) zarodke z miško na različnih stopnjah linij 8-32 blastomere končal rojstvu himernega živali (brez nastanek tumorja) v organih, ki jih zazna ohrovt darovalca tkiva. Himerizma so opazili tudi v skladu spolnih celic.

Primarna predniške zarodnih celic izolirali iz miši embrio zarodnih spola, morfologijo, imunološkega fenotip in funkcionalne značilnosti, ki je skladen z hESCs pridobljenih iz teratokarcinom Stevenson in embrioblasta. Na himere rojenih po dajanju hESCs v blastociste, allofenny morfogeneza orgle označen mozaik izmenični darovalca in prejemnika strukturne in funkcionalne enote so jetra, pljuča in ledvica. V nekaterih primerih je bilo nastajanje črevesnih grobnicah ali jeter rezine, ki so sestavljeni tako darovalca in prejemno celico. Vendar pa se je vedno znova pojavila morfogeneza glede na genetski program vrste, ki ji pripada prejemnik, in kimerizem je bil omejen samo na celično raven.

Nato smo ugotovili, da pride do širjenje hESCs brez cytodifferentiation na napajalni mezenhimskih celic plasti izveden (fetalnih fibroblasti) v prisotnosti LIF vezavo v selektivnih hranilnem gojišču, ki selektivno izvajajo samo preživetje matičnih in predhodnih celic, medtem ko je večina specializiranih celičnih elementov matrice. S pomočjo teh tehnik v letu 1998 s strani James Thomson je bil dodeljen pet ovekovečil linij izvornih celic iz mase notranje celice v blastociste osebe. Istega leta je John Gerhart razvil metodo za izolacijo nesmrtne linije ESC iz spolnega puff štirih-petih teden človeških zarodkov. Zaradi svoje edinstvene lastnosti, le dve leti kasneje embrionalnih matičnih celic in matičnih celic dokončno tkivo se je začel uporabljati v praksi regenerativne medicine in genske terapije.