Diagnostika mitohondrijskih bolezni

Ocena narave dedovanja in manifestacije kliničnih znakov mitohondrijskih bolezni

Ker so miohondrijska obolenja v nekaterih primerih lahko posledica poškodbe jedrnega genoma, bo prenos bolezni ustrezal Mendelovim zakonom dedovanja. V primerih, ko razvoj bolezni povzročijo mutacije v mitohondrijski DNK, bo dedovanje ustrezalo mitohondrijskemu tipu, torej se bo prenašalo po materini liniji. Nazadnje, ko se patologija razvije s sočasno poškodbo genov jedrnega in mitohondrijskega genoma, bo dedovanje kompleksno in ga bodo določali različni dejavniki. V zvezi s tem je mogoče pri genealoški analizi po formalni značilnosti (narava dedovanja glede na rodovnik) navesti najrazličnejše vrste dedovanja: avtosomno dominantno, avtosomno recesivno, X-vezano, mitohondrijsko.

Razvoj miohondrijskih bolezni, kot sta motnja presnove piruvične kisline ali beta-oksidacija maščobnih kislin, Krebsov cikel, je povezan z mutacijami genov jedrnega genoma. Za te patologije je značilno avtosomno recesivno dedovanje, ko so starši nosilci mutacij (heterozigoti), otrok pa je nosilec obeh podedovanih mutacij, prejetih od očeta in matere (homozigot). Starši so običajno navzven zdravi, podobno bolezen ali njene mikroznake pa je treba iskati pri bratih in sestrah bolnega otroka (proband sibs) ter pri sorodnikih tako po materini kot po očetovi strani (bratranci in sestrične).

V primeru recesivnega, na X vezanega tipa dedovanja (npr. neonatalna glutarna acidurija tipa II ali pomanjkanje podenote E1 piruvičnega kompleksa, Menkesova bolezen itd.) so fantje pogosteje prizadeti, matere pa so nosilke mutacij in jih prenesejo na sinove. Materinsko dedovanje se od X vezanega dedovanja razlikuje po tem, da sta prizadeta oba spola. V teh primerih je pri analizi rodovnika treba analizirati incidenco bolezni pri moških, saj se pri ženskah ne bo manifestirala. Rodovnik ne kaže prenosa bolezni po očetovsko-sinovski liniji, saj lahko oče na sina prenese le kromosom Y.

Kadar se bolezen razvije zaradi poškodbe mitohondrijskega genoma (na primer številne bolezni dihalne verige, Leberjeva optična nevropatija, MELAS, MERF, NARP sindromi itd.), se izsledi materinsko dedovanje, saj otrok podeduje mitohondrije od matere, ki jih lahko prenese tako na dečke kot na deklice. Tako sta oba spola enako prizadeta. V zvezi s tem je treba v rodovniku izslediti prenos bolezni po materini liniji.

Pri analizi družinskega drevesa in iskanju simptomov mitohondrijskih bolezni pri sorodnikih je treba upoštevati, da se lahko resnost bolezni (izrazitost znaka) zelo razlikuje, kar je lahko posledica različnega števila poškodovanih mitohondrijev, narave njihove poškodbe, različne porazdelitve mutacij v celicah itd. Zato ni vedno mogoče odkriti očitnih znakov bolezni. V nekaterih primerih se odkrijejo bodisi posamezni, izbrisani simptomi bodisi znaki, ki jih je mogoče odkriti med njihovim ciljnim iskanjem.

Razvoj mitohondrijske patologije je lahko povezan s poškodbo velikih površin mitohondrijev, tako imenovanimi mikrodelecijami (npr. Kearns-Sayrejev sindrom, Pearsonov sindrom, nekatere oblike sladkorne bolezni z gluhostjo, progresivna zunanja oftalmoplegija itd.). V teh primerih značilnih simptomov pri sorodnikih pogosto ne najdemo, saj je razvoj bolezni povezan s pojavom novih mutacij, ki so se pojavile v zigoti takoj po oploditvi jajčeca ( de novo mutacija). Bolezen je sporadična. Pogosto se poleg teh bolezni na avtosomno dominanten način dedujejo tudi številna stanja, povezana z večkratnimi mutacijami mitohondrijske DNK: na primer nekatere oblike encefalomiopatije, miopatije z okvaro oči, kljub prisotnosti mutacij mtDNA (večkratne delecije), imajo avtosomno dominanten tip dedovanja.

Vendar pa je za razliko od Mendelovega dedovanja avtosomno dominantni tip dedovanja pri mitohondrijski patologiji značilen po velikem številu prizadetih posameznikov v naslednjih generacijah.

Končno se lahko nekatere mitohondrijske bolezni, pogosto povezane z izčrpanjem mtDNK mitohondrijev ali njihovo odsotnostjo v celicah, dedujejo avtosomno recesivno. Sem spadajo prirojene oblike miopatije, kardiomiopatije, sindroma nevrodistresa, laktacidoze, okvare jeter itd.

Preučevanje narave dednega prenosa bolezni je pomembno za medicinsko in genetsko prognozo ter zahteva poglobljeno analizo kliničnih znakov s poznavanjem mehanizmov nastanka mitohondrijske patologije in vrst njenega dedovanja.

Klinične manifestacije se od prvih dni življenja do odraslosti zelo razlikujejo. Pri analizi tega kazalnika je treba upoštevati nozološke oblike, saj ima vsaka od njih določeno starost ob prvem pojavu.

Presnovne motnje, ki jih opazimo pri mitohondrijskih boleznih, so v veliki večini primerov progresivne. Začetni simptomi so pogosto blagi, nato pa napredujejo in lahko vodijo do znatnih invalidnih motenj. Redke oblike patologije, kot sta benigna infantilna miopatija in nekatere oblike Leberjeve optične nevropatije, so lahko benigne in podvržene regresiji.

Med laboratorijskim testiranjem se pozornost posveča značilnim znakom mitohondrijskih bolezni:

• prisotnost acidoze;
• povišane ravni laktata in piruvata v krvi, povečanje indeksa laktat/piruvat za več kot 15, zlasti povečanje z obremenitvijo z glukozo ali telesno vadbo;
• hiperketonemija;
• hipoglikemija;
• hiperamonemija;
• povečane koncentracije acetoacetata in 3-hidroksibutirata;
• povečano razmerje med 3-hidroksimasleno kislino in acetocetno kislino v krvi;
• povišane ravni aminokislin v krvi in urinu (alanin, glutamin, glutaminska kislina, valin, levcin, izolevcin);
• povišane ravni maščobnih kislin v krvi;
• hiperekskrecija organskih kislin v urinu;
• znižane ravni karnitina v krvi;
• povečanje vsebnosti mioglobina v bioloških tekočinah;
• zmanjšana aktivnost mitohondrijskih encimov v miocitih in fibroblastih.

Diagnostična vrednost teh kazalnikov je pri obremenitvi s hrano večja kot na prazen želodec. V praksi se je dobro izkazal diagnostični test: določanje laktata v krvi na ozadju obremenitve z glukozo, ki omogoča bolj jasno odkrivanje odpovedi dihalne verige pri dodatni obremenitvi z glukozo.

Za laboratorijsko diagnostiko mitohondrijske disfunkcije in njenih specifičnih nozoloških oblik običajne, rutinske biokemijske metode raziskovanja niso dovolj; potrebno je izvesti posebne teste. Še posebej priročno je analizirati aktivnost encimov v biopsijah skeletnih mišic kot v drugih tkivih. Možno je določiti aktivnost encimov dihalne verige, zlasti citrat sintetaze, sukcinat dehidrogenaze in citokrom C oksidaze.

Podatki iz morfoloških in molekularno-genetskih študij

Morfološke študije so še posebej pomembne pri diagnozi mitohondrijske patologije. Zaradi njihove velike informativne vrednosti sta pogosto potrebna biopsija mišičnega tkiva in histokemični pregled pridobljenih biopsij. Pomembne informacije je mogoče pridobiti s hkratnim pregledom materiala s svetlobno in elektronsko mikroskopijo.

Eden od pomembnih označevalcev mitohondrijskih bolezni je pojav "raztrganih" rdečih vlaken [pojav RRF (ragged red fibres)], ugotovljen leta 1963. Povezan je z nastankom gensko spremenjenih nenormalnih mitohondrijev vzdolž roba mišičnega vlakna zaradi proliferacije in fokalnega kopičenja. Ta pojav se zazna s svetlobno mikroskopijo z uporabo posebnega Gomorijevega barvila, v zadnjih letih pa se v ta namen uporabljajo različni mitohondrijski označevalci in različne imunološke metode.

Drugi morfološki znaki mitohondrijske patologije vključujejo:

• močno povečanje velikosti mitohondrijev;
• kopičenje glikogena, lipidov in kalcijevih konglomeratov v subsarkolemmi;
• zmanjšana aktivnost mitohondrijskih encimov;
• motena porazdelitev granul aktivnosti encimov sukcinat dehidrogenaze (SDH), NADH oksidoreduktaze, citokrom C oksidaze itd.

Pri bolnikih z mitohondrijskimi boleznimi lahko svetlobna mikroskopija mišičnega tkiva razkrije nespecifične morfološke znake: lokalno nekrozo mišičnih vlaken, kopičenje sarkoplazemskih mas, prisotnost lize subsarkolemalnih področij sarkoplazme, bazofilijo sarkoplazme, povečano število mišičnih jeder, aktivacijo regeneracijskih procesov itd.

Študija vloge pojava "raztrganih" rdečih vlaken je pokazala njegov pomen za diagnozo stanj, kot so MELAS, MERRF, Kearns-Sayrejevi sindromi, kronična progresivna oftalmoplegija in druga, povezana z mutacijami mtDNA. Ta pojav se lahko razvije tudi pri drugih boleznih: Duchennovi mišični distrofiji, dermatomiozitisu, miotonični distrofiji, jemanju zdravil (klofibrat) in drugih patoloških stanjih. Tako lahko poleg primarnih mitohondrijskih bolezni pojav RRF spremlja tudi sekundarne mitohondrijske disfunkcije.

Trenutno so histokemične in elektronsko-mikroskopske preiskave mišičnega tkiva za odkrivanje znakov mitohondrijske insuficience postale zelo razširjene. V nekaterih primerih pomagajo pri diagnozi, zlasti pri normalni morfološki sliki mišičnega tkiva glede na podatke svetlobne mikroskopije.

Elektronsko-mikroskopski znaki - odkrivanje mitohondrijske proliferacije, motnje njihove oblike in velikosti, dezorganizacija in povečanje krist, kopičenje nenormalnih mitohondrijev pod sarkolemo, kopičenje lipidov in nenormalnih parakristalnih (predvsem sestavljenih iz beljakovin) ali osmofilnih vključkov, lokaliziranih med notranjo in zunanjo membrano ali znotraj krist, sferični skupki, pogosto nameščeni v matriksu (sestavljeni predvsem iz trigliceridov) itd.

Pri nekaterih bolnikih lahko odkrijejo citokemične nepravilnosti v levkocitih.

Kompleks biokemijskih in morfoloških študij dopolnjujejo sodobne metode molekularne diagnostike (odkrivanje jedrnih ali mitohondrijskih mutacij), ki se izvajajo v specializiranih laboratorijih za diagnostiko DNK. Pri mitohondrijskih boleznih se odkrivajo različne vrste mutacij: točkovne mutacije, delecije, podvajanja, kvantitativne anomalije DNK itd.

V odsotnosti mutacij v mtDNA se pri sumu na mitohondrijsko patologijo izvede študija jedrne DNK.

Diagnostična merila

Obstajata dve skupini diagnostičnih kriterijev za mitohondrijske bolezni. Glavni diagnostični kriteriji (prva skupina).

• Klinično:
  • potrjene diagnoze: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, Pearsonovi sindromi, Leberjeva nevropatija, Leighova in Alpersova bolezen;
  • prisotnost dveh ali kombinacije naslednjih znakov:
    • multisistemska lezija, patognomonična za bolezni dihalne verige;
    • progresivni potek z epizodami poslabšanja ali prisotnostjo mitohondrijskih mutacij v družini;
    • izključitev presnovnih in drugih bolezni z izvedbo ustreznih testov.
• Histološko - odkrivanje pojava RRF v več kot 2 % mišičnega tkiva.
• Encimsko:
  • vlakna, negativna na citokrom c oksidazo;
  • zmanjšana aktivnost encimov dihalne verige (<20 % normalne vrednosti v tkivu, <30 % v celicah ali več tkivih).
• Funkcionalno - zmanjšanje sinteze ATP v fibroblastih za več kot 3 standardne deviacije.
• Molekularno genetske - patogenetično pomembne mutacije jedrne ali mtDNA.

Dodatna diagnostična merila (druga skupina).

• Klinični - nespecifični simptomi, ki se pojavljajo pri boleznih dihalne verige (mrtvorojenost, zmanjšana motorična aktivnost ploda, zgodnja neonatalna smrt, gibalne motnje, razvojne motnje, oslabljen mišični tonus v neonatalnem obdobju).
• Histološko - majhen odstotek pojava RRF, subsarkolemalno kopičenje mitohondrijev ali njihove anomalije.
• Encimska - nizka aktivnost encimov respiratornega kompleksa (20-30 % norme v tkivu, 30-40 % v celicah ali celičnih linijah).
• Funkcionalno - zmanjšanje sinteze ATP v fibroblastih za 2-3 standardne deviacije ali odsotnost rasti fibroblastov v mediju z galaktozo.
• Molekularna genetika - odkrivanje mutacij v jedrni ali mtDNA z domnevno patogenetsko povezavo.
• Presnovni - odkrivanje enega ali več presnovkov, kar kaže na motnjo v celični bioenergetiki.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]