Vloga encimov in citokinov v patogenezi osteoartritisa

V zadnjih letih je bila velika pozornost raziskovalcev usmerjena v identifikacijo proteaz, odgovornih za razgradnjo zunajcelične mase sklepnega hrustanca (ECM) pri osteoartrozi. Po sodobnih konceptih imajo matriksne metaloproteinaze (MMP) pomembno vlogo pri patogenezi osteoartroze. Pri bolnikih z osteoartrozo odkrijejo povečano raven treh MMP - kolagenaz, stromelizinov in želatinaz. Kolagenaza je odgovorna za razgradnjo nativnega kolagena, stromelizin - kolagena tipa IV, proteoglikanov in laminina, želatinaza pa za razgradnjo želatine, kolagenov IV, Vh XI tipov in elastina. Poleg tega se domneva prisotnost še enega encima - agrekanaze, ki ima lastnosti MMP in je odgovorna za proteolizo hrustančnih agregatov proteoglikanov.

V človeškem sklepnem hrustancu so bile identificirane tri vrste kolagenaz, katerih ravni so pri bolnikih z osteoartritisom znatno povišane: kolagenaza-1 (MMP-1), kolagenaza-2 (MMP-8) in kolagenaza-3 (MMP-13). Soobstoj treh različnih vrst kolagenaz v sklepnem hrustancu kaže, da ima vsaka od njih svojo specifično vlogo. Kolagenazi-1 in -2 sta dejansko lokalizirani predvsem v površinskem in zgornjem vmesnem območju sklepnega hrustanca, medtem ko se kolagenaza-3 nahaja v spodnjem vmesnem območju in v globokem območju. Poleg tega so rezultati imunohistokemične študije pokazali, da z napredovanjem osteoartritisa raven kolagenaze-3 doseže plato in se celo zmanjša, medtem ko se raven kolagenaze-1 postopoma povečuje. Obstajajo dokazi, da je pri osteoartritisu kolagenaza-1 vključena predvsem v vnetni proces v sklepnem hrustancu, medtem ko je kolagenaza-3 vključena v preoblikovanje tkiva. Kolagenaza-3, ki se izraža v hrustancu bolnikov z osteoartritisom, intenzivneje razgrajuje kolagen tipa II kot kolagenaza-1.

Od predstavnikov druge skupine metaloproteinaz so bili v človeškem stromelizinu identificirani tudi trije: stromelizin-1 (MMP-3), stromelizin-2 (MMP-10) in stromelizin-3 (MMP-11). Danes je znano, da je v patološki proces pri osteoartrozi vključen le stromelizin-1. Stromelizin-2 ni zaznan v sinovialni membrani bolnikov z osteoartrozo, vendar ga v zelo majhnih količinah najdemo v sinovialnih fibroblastih bolnikov z revmatoidnim artritisom. Stromelizin-3 najdemo tudi v sinovialni membrani bolnikov z revmatoidnim artritisom v bližini fibroblastov, zlasti v conah fibroze.

V skupini želatinaz v človeškem hrustančnem tkivu sta bili identificirani le dve: 92 kD želatinaza (želatinaza B ali MMP-9) in 72 kD želatinaza (želatinaza A ali MMP-2); pri bolnikih z osteoartritisom se ugotovi povečanje ravni 92 kD želatinaze.

Nedavno je bila identificirana še ena skupina MMP, ki so lokalizirane na površini celičnih membran in se imenujejo MMP membranskega tipa (MMP-MT). Ta skupina vključuje štiri encime - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Izražanje MMP-MT so odkrili v človeškem sklepnem hrustancu. Čeprav ima MMP-MT-1 kolagenazne lastnosti, sta oba encima MMP-MT-1 in MMP-MT-2 sposobna aktivirati želatinazo-72 kDa in kolagenazo-3. Vloga te skupine MMP v patogenezi osteoartritisa zahteva pojasnitev.

Proteinaze se izločajo v obliki zimogena, ki ga aktivirajo druge proteinaze ali organske živosrebrove spojine. Katalitična aktivnost MMP je odvisna od prisotnosti cinka v aktivni coni encima.

Biološko aktivnost MMP-jev nadzirajo specifični TIMP-ji. Do danes so bile identificirane tri vrste TIMP-jev, ki se nahajajo v človeških sklepnih tkivih: TIMP-1–TIMP-3. Četrta vrsta TIMP-ja je bila identificirana in klonirana, vendar je v človeških sklepnih tkivih še niso odkrili. Te molekule se specifično vežejo na aktivno mesto MMP-jev, čeprav se nekatere od njih lahko vežejo na aktivno mesto 72 kD progelatinaze (TIMP-2, -3, -4) in 92 kD progelatinaze (TIMP-1 in -3). Dokazi kažejo, da pri osteoartritisu obstaja neravnovesje med MMP-ji in TIMP-ji v sklepnem hrustancu, kar povzroči relativno pomanjkanje inhibitorjev, kar je verjetno deloma posledica povečanja ravni aktivnih MMP-jev v tkivu. TIMP-1 in -2 se nahajata v sklepnem hrustancu in ju sintetizirajo hondrociti. Pri osteoartrozi je v sinovialni membrani in sinovialni tekočini odkrit le TIMP tipa I. TIMP-3 se nahaja izključno v zunajceličnem matriksemalnem telesu (ECM). TIMP-4 si deli skoraj 50 % svojega aminokislinskega zaporedja s TIMP-2 in 38 % s TIMP-1. V drugih ciljnih celicah je TIMP-4 odgovoren za modulacijo aktivacije 72 kD progelatinaze na celični površini, kar kaže na pomembno vlogo tkivno specifičnega regulatorja preoblikovanja ECM.

Drug mehanizem za nadzor biološke aktivnosti MMP je njihova fiziološka aktivacija. Domneva se, da so encimi iz družine serinskih in cisteinskih proteaz, kot sta AP/plazmin in katepsin B, fiziološki aktivatorji MMP. V sklepnem hrustancu bolnikov z osteoartritisom so odkrili povišane ravni urokinaze (uAP) in plazmina.

Kljub temu, da se v sklepnih tkivih nahaja več vrst katepsinov, velja katepsin-B za najverjetnejšega aktivatorja MMP v hrustancu. V človeških sklepnih tkivih so našli fiziološke inhibitorje serinskih in cisteinskih proteaz. Aktivnost zaviralca AP-1 (IAI-1) in cisteinskih proteaz je pri bolnikih z osteoartritisom zmanjšana. Podobno kot pri MMP/TIMP lahko neravnovesje med serinskimi in cisteinskimi proteazami ter njihovimi inhibitorji pojasni povečano aktivnost MMP v sklepnem hrustancu pri bolnikih z osteoartritisom. Poleg tega se MMP lahko medsebojno aktivirajo. Na primer, stromelizin-1 aktivira kolagenazo-1, kolagenazo-3 in 92 kD želatinazo; kolagenaza-3 aktivira 92 kD želatinazo; MMP-MT aktivira kolagenazo-3, želatinaza-72 kDa pa to aktivacijo okrepi; MMP-MT aktivira tudi želatinazo 72 kDa. Citokine lahko razdelimo v tri skupine – destruktivne (vnetne), regulatorne (vključno s protivnetnimi) in anabolne (rastni faktorji).

Vrste citokinov (po van den Berg WB et al)

Uničujoče	Interlevkin-1 TNF-α Faktor zaviranja levkemije Interlevkin-17
Regulativni	Interlevkin-4 Interlevkin-10 Interlevkin-13 Zaviralci encimov
Anabolični	Inzulinu podobni rastni faktorji TGF-β Kostni morfogenetski proteini Morfogenetske beljakovine, pridobljene iz hrustanca

Destruktivni citokini, zlasti IL-1, povzročajo povečano sproščanje proteaz in zavirajo sintezo proteoglikanov in kolagenov s strani hondrocitov. Regulatorni citokini, zlasti IL-4 in -10, zavirajo proizvodnjo IL-1, povečajo proizvodnjo antagonista receptorja IL-1 (IL-1RA) in zmanjšajo raven NO sintaze v hondrocitih. Tako IL-4 deluje proti IL-1 v treh smereh: 1) zmanjšuje proizvodnjo in preprečuje njegove učinke, 2) povečuje proizvodnjo glavnega "lovilca" IL-1RA in 3) zmanjšuje proizvodnjo glavnega sekundarnega "posrednika" NO. Poleg tega IL-4 zmanjšuje encimsko razgradnjo tkiva. In vivo se optimalni terapevtski učinek doseže s kombinacijo IL-4 in IL-10. Anabolični dejavniki, kot sta TGF-β in IGF-1, dejansko ne vplivajo na proizvodnjo ali delovanje IL-1, ampak kažejo nasprotno aktivnost, na primer spodbujajo sintezo proteoglikanov in kolagena, zavirajo aktivnost proteaz, TGF-β pa tudi zavira sproščanje encimov in spodbuja njihove inhibitorje.

Provnetni citokini so odgovorni za povečano sintezo in izražanje MMP v sklepnih tkivih. Sintetizirajo se v sinovialni membrani in nato skozi sinovialno tekočino difundirajo v sklepni hrustanec. Provnetni citokini aktivirajo hondrocite, ki so prav tako sposobni proizvajati provnetne citokine. V sklepih, ki jih je prizadela osteoartroza, vlogo efektorja vnetja igrajo predvsem celice sinovialne membrane. Prav sinovociti makrofagnega tipa izločajo proteaze in vnetne mediatorje. Med njimi so v patogenezo osteoartroze najbolj »vpleteni« IL-f, TNF-a, IL-6, zaviralni faktor levkemije (LIF) in IL-17.

Biološko aktivne snovi, ki spodbujajo razgradnjo sklepnega hrustanca pri osteoartritisu

• Interlevkin-1
• Interlevkin-3
• Interlevkin-4
• TNF-α
• Kolonije stimulirajoči dejavniki: makrofagi (monociti) in granulociti-makrofagi
• Snov P
• STRAN ₂
• Aktivatorji plazminogena (tkivni in urokinazni tipi) in plazmin
• Metaloproteinaze (kolagenaze, elastaze, stromelizini)
• Katepsini A in B
• Trilsin
• Bakterijski lipopolisaharidi
• Fosfolipaza Ag

Podatki iz literature kažejo, da sta IL-1 in morda TNF-a glavna mediatorja uničenja sklepnega tkiva pri osteoartrozi. Vendar pa še vedno ni znano, ali delujeta neodvisno drug od drugega ali pa med njima obstaja funkcionalna hierarhija. Živalski modeli osteoartroze so pokazali, da blokada IL-1 učinkovito preprečuje uničenje sklepnega hrustanca, medtem ko blokada TNF-a vodi le do zmanjšanja vnetja v sklepnih tkivih. Povečane koncentracije obeh citokinov so bile najdene v sinovialni membrani, sinovialni tekočini in hrustancu bolnikov. V hondrocitih lahko povečata sintezo ne le proteaz (predvsem MMP in AP), temveč tudi manjših kolagenov, kot sta tipa I in III, ter zmanjšata sintezo kolagenov tipa II in IX ter proteoglikanov. Ti citokini spodbujajo tudi reaktivne kisikove vrste in vnetne mediatorje, kot je PGE2 _. Posledica takšnih makromolekularnih sprememb v sklepnem hrustancu pri osteoartritisu je neučinkovitost reparativnih procesov, kar vodi v nadaljnjo razgradnjo hrustanca.

Zgoraj omenjeni provnetni citokini modulirajo procese supresije/aktivacije MMP pri osteoartrozi. Na primer, neravnovesje med ravnmi TIMP-1 in MMP v hrustancu pri osteoartrozi lahko posreduje IL-1, saj je študija in vitro pokazala, da povečanje koncentracije IL-1 beta vodi do zmanjšanja koncentracije TIMP-1 in povečanja sinteze MMP s strani hondrocitov. Sintezo AP modulira tudi IL-1 beta. In vitro stimulacija hondrocitov sklepnega hrustanca z IL-1 povzroči od odmerka odvisno povečanje sinteze AP in močno zmanjšanje sinteze iAP-1. Sposobnost IL-1, da zmanjša sintezo iAP-1 in spodbudi sintezo AP, je močan mehanizem za tvorbo plazmina in aktivacijo MMP. Poleg tega plazmin ni le encim, ki aktivira druge encime, temveč sodeluje tudi v procesu razgradnje hrustanca z neposredno proteolizo.

IL-ip se sintetizira kot neaktivni predhodnik z maso 31 kD (pre-IL-ip) in se nato po cepitvi signalnega peptida pretvori v aktivni citokin z maso 17,5 kD. V sklepnih tkivih, vključno s sinovialno membrano, sinovialno tekočino in sklepnim hrustancem, se IL-ip nahaja v aktivni obliki, študije in vivo pa so pokazale sposobnost sinovialne membrane pri osteoartrozi, da izloča ta citokin. Nekatere serinske proteaze so sposobne pretvoriti pre-IL-ip v njegovo bioaktivno obliko. Pri sesalcih so takšne lastnosti ugotovili le pri eni proteazi, ki spada v družino encimov, specifičnih za cistein aspartat, in se imenuje IL-1β-konvertirni encim (ICF ali kaspaza-1). Ta encim je sposoben specifično pretvoriti pre-IL-ip v biološko aktiven "zrel" IL-ip z maso 17,5 kD. ICF je 45 kD proencim (p45), ki je lokaliziran v celični membrani. Po proteolitični cepitvi proencima p45 nastaneta dve podenoti, znani kot p10 in p20, za kateri je značilna encimska aktivnost.

TNF-α se sintetizira tudi kot membransko vezan predhodnik z maso 26 kDa; s proteolitično cepitvijo se iz celice sprosti kot aktivna topna oblika z maso 17 kDa. Proteolitično cepitev izvaja encim za pretvorbo TNF-α (TNF-AC), ki spada v družino adamalizinov. AR Amin in sod. (1997) so ugotovili povečano izražanje mRNA TNF-AC v sklepnem hrustancu bolnikov z osteoartritisom.

Biološka aktivacija hondrocitov in sinovicitov z IL-1 in TNF-a poteka z vezavo na specifične receptorje na površini celic - IL-R in TNF-R. Za vsak citokin sta bili identificirani dve vrsti receptorjev - IL-IP tipa I in II ter TNF-R tipa I (p55) in II (p75). IL-1PI in p55 sta odgovorna za prenos signalov v celicah sklepnega tkiva. IL-1R tipa I ima nekoliko večjo afiniteto za IL-1beta kot za IL-1a; IL-1R tipa II pa ima, nasprotno, večjo afiniteto za IL-1a kot za IL-ip. Ni jasno, ali lahko IL-IP tipa II posreduje signale IL-1 ali služi le za kompetitivno inhibicijo povezave IL-1 z IL-1R tipa I. Hondroitidi in sinovialni fibroblasti bolnikov z osteoartrozo vsebujejo velike količine IL-1PI in p55, kar posledično pojasnjuje visoko občutljivost teh celic na stimulacijo z ustreznimi citokini. Ta proces vodi tako do povečanega izločanja proteolitičnih encimov kot do uničenja sklepnega hrustanca.

Vpletenosti IL-6 v patološki proces pri osteoartritisu ni mogoče izključiti. Ta domneva temelji na naslednjih opažanjih:

• IL-6 poveča število vnetnih celic v sinovialni membrani,
• IL-6 spodbuja proliferacijo hondrocitov,
• IL-6 okrepi učinke IL-1 pri povečanju sinteze MMP in zaviranju sinteze proteoglikanov.

Vendar pa je IL-6 sposoben sprožiti nastajanje TIMP, ne vpliva pa na nastajanje MMP, zato velja, da je ta citokin vključen v proces zaviranja proteolitične razgradnje sklepnega hrustanca, ki poteka z mehanizmom povratne zveze.

Drug član družine IL-6 je LIF, citokin, ki ga proizvajajo hondrociti, pridobljeni od bolnikov z osteoartrozo, kot odgovor na stimulacijo s provnetnima citokinoma IL-1p in TNF-a. LIF spodbuja resorpcijo hrustančnih proteoglikanov, pa tudi sintezo MMP in proizvodnjo NO. Vloga tega citokina pri osteoartrozi še ni povsem pojasnjena.

IL-17 je homodimer z molekulsko maso 20–30 kD z učinkom, podobnim IL-1, vendar veliko manj izrazitim. IL-17 spodbuja sintezo in sproščanje številnih provnetnih citokinov, vključno z IL-1p, TNF-a, IL-6 in MMP v ciljnih celicah, kot so človeški makrofagi. Poleg tega IL-17 spodbuja proizvodnjo NO s strani hondrocitov. Tako kot LIF je bila tudi vloga IL-17 pri patogenezi osteoartritisa slabo raziskana.

Anorganski prosti radikal NO igra pomembno vlogo pri razgradnji sklepnega hrustanca pri osteoartritisu. Hondrociti, izolirani od bolnikov z osteoartritisom, proizvajajo večje količine NO tako spontano kot po stimulaciji s provnetnimi citokini v primerjavi z normalnimi celicami. Visoka vsebnost NO je bila ugotovljena v sinovialni tekočini in serumu bolnikov z osteoartritisom – to je posledica povečanega izražanja in sinteze inducirane NO sintaze (hNOC), encima, odgovornega za proizvodnjo NO. Nedavno je bila klonirana DNK hNOC, specifičnega za hondrocite, in določeno je bilo aminokislinsko zaporedje encima. Aminokislinsko zaporedje kaže na 50-odstotno identiteto in 70-odstotno podobnost s hNOC, specifičnim za endotelij in živčno tkivo.

NO zavira sintezo makromolekul zunajceličnega materiala sklepnega hrustanca in spodbuja sintezo MMP. Poleg tega povečanje proizvodnje NO spremlja zmanjšanje sinteze antagonista IL-IP (IL-1RA) s strani hondrocitov. Tako povečanje ravni IL-1 in zmanjšanje IL-1RA vodi do hiperstimulacije NO v hondrocitih, kar posledično vodi do povečane razgradnje hrustančnega matriksa. Obstajajo poročila o terapevtskem učinku selektivnega zaviralca hNOC in vivo na napredovanje eksperimentalne osteoartroze.

Naravni zaviralci citokinov lahko neposredno preprečijo vezavo citokinov na receptorje celične membrane in s tem zmanjšajo njihovo provnetno aktivnost. Naravne zaviralce citokinov lahko glede na njihov način delovanja razdelimo v tri razrede.

Prvi razred inhibitorjev vključuje antagoniste receptorjev, ki preprečujejo vezavo liganda na njegov receptor s tekmovanjem za vezavno mesto. Do danes je bil tak inhibitor najden le za IL-1 - to je zgoraj omenjeni kompetitivni inhibitor sistema IL-1/ILIP IL-1 PA. IL-1 PA blokira številne učinke, ki jih opazimo v sklepnih tkivih pri osteoartritisu, vključno s sintezo prostaglandinov s strani sinovialnih celic, proizvodnjo kolagenaze s strani hondrocitov in razgradnjo kostne mase sklepnega hrustanca.

IL-1RA se nahaja v različnih oblikah – eni topni (rIL-1RA) in dveh medceličnih (μIL-lPAI in μIL-1RAP). Afiniteta topne oblike IL-1RA je 5-krat večja kot pri medceličnih oblikah. Kljub intenzivnim znanstvenim raziskavam funkcija slednje ostaja neznana. Poskusi in vitro so pokazali, da zaviranje aktivnosti IL-1beta zahteva koncentracijo IL-1RA, ki je 10–100-krat višja od normalne, medtem ko pogoji in vivo zahtevajo tisočkratno povečanje koncentracije IL-1RA. To dejstvo lahko delno pojasni relativno pomanjkanje IL-1RA in presežek IL-1 v sinovialni ovojnici bolnikov z osteoartrozo.

Drugi razred naravnih zaviralcev citokinov so topni citokinski receptorji. Primeri takšnih zaviralcev pri ljudeh, ki so povezani s patogenezo osteoartritisa, so rIL-1R in pp55. Topni citokinski receptorji so skrajšane oblike normalnih receptorjev; ko se vežejo na citokine, preprečijo njihovo vezavo na membransko povezane receptorje ciljnih celic, pri čemer delujejo po mehanizmu kompetitivnega antagonizma.

Glavni predhodnik topnih receptorjev je membransko vezan IL-1RP. Afiniteta rIL-IP za IL-1 in IL-1RA je različna. Tako ima rIL-1RN večjo afiniteto za IL-1β kot za IL-1RA, rIL-1PI pa kaže večjo afiniteto za IL-1RA kot za IL-ip.

Obstajata tudi dve vrsti topnih receptorjev za TNF - pp55 in pp75, ki tako kot topni receptorji IL-1 nastanejo z "odpadanjem". In vivo se oba receptorja nahajata v tkivih prizadetih sklepov. Vloga topnih receptorjev TNF v patogenezi osteoartroze je predmet razprav. Domneva se, da v nizkih koncentracijah stabilizirajo tridimenzionalno strukturo TNF in povečajo razpolovni čas bioaktivnega citokina, medtem ko lahko visoke koncentracije pp55 in pp75 zmanjšajo aktivnost TNF s kompetitivnim antagonizmom. Verjetno lahko pp75 deluje kot nosilec TNF, kar olajša njegovo vezavo na membransko povezan receptor.

Tretji razred naravnih zaviralcev citokinov predstavlja skupina protivnetnih citokinov, ki vključujejo TGF-beta, IL-4, IL-10 in IL-13. Protivnetni citokini zmanjšujejo nastajanje provnetnih in nekaterih proteaz ter spodbujajo nastajanje IL-1RA in TIMP.