Vloga encimov in citokinov v patogenezi osteoartritisa

V zadnjih letih se je veliko raziskav osredotočilo na identifikacijo proteaz, ki so odgovorne za degradacijo ECM za sklepni hrustanca pri osteoartritisu. Glede na sodobne ideje pomembno vlogo pri patogenezi osteoartritisa igrajo matriksne metaloproteaze (MMPs). Bolniki z osteoartritisom imajo povečano raven treh predstavnikov MMP-kolagenaz, stromelizinov in želatinaz. Kolagenaze je odgovoren za razgradnjo nativne kolagena, stromelizina - kolagena tipa IV, laminin in proteoglikani, azhelatinaza - za razgradnjo želatine, kolagena IV, Vh vrste XI elastina. Nadalje, predpostavlja obstoj drugega encima - agrekanaze, ki ima lastnosti MMP in je odgovoren za proteolizo hrustanca proteoglikanom agregatov.

Sklepnega hrustanca, človeških kolagenaze označene tri vrste stopenj, ki so dvignjeni pri bolnikih z osteoartritisom - kolagenaze-1 (MMP-1), kolagenaza-2 (MMP-8), kolagenaza-3 (MMP-13). Koeksistenca treh različnih vrst kolagenaz v sklepnem hrustancu kaže, da ima vsak od njih svojo posebno vlogo. Dejansko kolagenazo-1 in -2 so lokalizirane predvsem v površno in zgornjem vmesnem območju od sklepnega hrustanca, medtem ko se je dalo kolagenaze-3 pri dnu vmesnih in globokih območjih. Poleg tega so rezultati Imunohistokemične študije pokazale, da je med napredovanjem stopnje osteoartritisa kolagenaze-3 vrhunec ali celo zmanjša, medtem ko je stopnja kolagenaze-1 postopoma povečuje. Dokazano je, da je za osteoartritis kolagenaze-1 glavnem vključena v vnetnem procesu v sklepnega hrustanca, medtem kolagenaze-3 - v preoblikovanje tkiva. Izraženo v hrustanca pacientov z OA kolagenaze 3 opravlja degradacijo tipa II kolagena intenzivneje kot kolagenaze-1.

Predstavnikov druge skupine metaloproteaz Human stromelizinovu identificirano kot tri - stromelizin-1 (MMP-3), stromelizin-2 (MMP-10) in stromelizin-3 (MMP-11). Danes je znano, da je v patološkem procesu pri osteoartritisu vključen le stromelin-1. V sinovialne membrane bolnikov z osteoartritisom niso določeni stromelizin-2, vendar se nahaja v zelo majhnih količinah v sinovialnih fibroblastov bolnikov z revmatoidnim artritisom. Stromelizin-3, najdemo tudi v sinovialni ovojnici bolnikov z revmatoidnim artritisom v bližini fibroblastov, zlasti na področjih fibroze.

V skupini želatinaze v človeški hrustančnega tkiva prepoznani le dve - 92 kDa gelatinaza (gelatinaza B ali MMP-9) in 72 kDa gelatinaza (gelatinaza A ali MMP-2); pri bolnikih z osteoartritisom se določi zvišanje ravni 92 kD želatineze.

Ne tako dolgo nazaj je bila ugotovljena druga skupina MMP, ki so lokalizirana na površini celičnih membran in se imenujejo membranski tip MMP (MMP-MT). V to skupino spadajo štirje encimi - MMP-MT1-MMP-MT-4. Izraz MMP-MT se nahaja v človeški sklepni hrustanec. Čeprav imajo MMP-MT-1 lastnosti kolagenaze, lahko MMP-MT-1 in MMP-MT-2 aktivira želatinazo-72 kD in kollagenazo-3. Vloga te skupine MMP v patogenezi OA zahteva prefinjenost.

Proteinaze se izločajo v obliki zimogena, ki jo aktivirajo druge proteaze ali organske spojine živega srebra. Katalitska aktivnost MMP je odvisna od prisotnosti cinka v aktivnem območju encima.

Biološko aktivnost MMP nadzirajo posebni TIMP. Do sedaj so bile ugotovljene tri vrste TIMP, ki jih najdemo v človeških sklepnih tkivih, TIMP-1-TIMP-3. Četrta vrsta TIMP je identificirana in klonirana, vendar še ni bila odkrita v človeških sklepnih tkivih. Te molekule vežejo specifično na aktivno mesto MMP, čeprav so nekateri od njih so sposobni, da se veže na aktivno mesto 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) in 92 kDa progelatinase (TIMP-1 in -3). Podatki kažejo, da je OA sklepnega hrustanca neravnovesje med MMP in TIMPs pride do relativnega pomanjkanja inhibitorjev, ki se lahko delno povezane s povečano MMP aktivnostjo v tkivu. TIMP-1 in -2 se nahajajo v sklepnem hrustanču, sintetizirajo jih hondrociti. Pri osteoartritisu v sinovialni membrani in sinovialni tekočini je bila odkrita le prva vrsta TIMP. TIMP-3 je odkrit izključno v ECM. TIMP-4 ima identično aminokislinsko sekvenco s TIMP-2 in-ZIN skoraj 38% -STIMP-1 za skoraj 50%. Druge tarčnih celicah TIMP-4 je odgovoren za modulacija aktivacije progelatinase 72 kD celično površino, kar kaže pomembno vlogo kot regulator tkivno specifični ECM preoblikovanja.

Drugi mehanizem za nadzor biološke aktivnosti MMP je njihova fiziološka aktivacija. Menimo, da so encimi iz družine serinskih in cisteinskih proteaz, kot sta AP / plazmin in katepsin B, fiziološki aktivatorji MMP. V sklepnem hrustancu bolnikov z osteoartritisom so odkrili povišano raven urokinaze (UAP) in plazmina.

Kljub dejstvu, da se v skupnih tkivih nahajajo več tipov katepsinov, se katepsin-B šteje za najverjetnejšega aktivatorja MMP v hrustančnem stanju. V tkivih človeškega sklepa so bili odkriti fiziološki zaviralci serinske in cisteinske proteaze. Aktivnost zaviralca AP-1 (IAP-1) in cisteinskih proteaz se zmanjša pri bolnikih z osteoartritisom. Podobno MMP / TIMP - lahko sicer neravnotežje med serinskih in cisteinskih proteaz in njihovih inhibitorjev razložiti povečana aktivnost MMP sklepnega hryashe bolnikih z osteoartritisom. Poleg tega se lahko MMP aktivirajo med seboj. Na primer, stromelin-1 aktivira kolagenazo-1, kolagenazo 3 in želatinazo 92 kD; Kolagenaza-3 aktivira 92 kD želatinaze; MMP-MT aktivira kolagenazo-3 in želatinazo-72 kD potencialira to aktivacijo; MMP-MT aktivira tudi 72 kD želatinaze. Cytokine je mogoče razdeliti na tri skupine - uničujoče (pro-vnetne), regulatorne (vključno z protivnetnimi) in anabolične (rastne dejavnike).

Vrste citokinov (glede na van den Berg WB et al)

Destruktivno	Interleukin-1 TNF-a Leukemični zaviralni faktor Interleukin-17
Regulativni	Interlekin-4 Interleukin-10 Interleukin-13 Enzimski inhibitorji
Anabolični	Msulin podobni faktorji rasti TFR-b Morfogenetski proteini kosti Morfogenetski proteini, pridobljeni iz hrustanca

Škodljive citokini, zlasti IL-1 inducirana povečanja sproščanja proteaz in inhibirajo sintezo proteoglikanov in kolagena hondrocitov. Regulativne Citokini, posebej IL-4 in -10, zavirajo nastajanje antagonista receptorja IL-1, za povečanje proizvodnje IL-1 (IL-1 RA) in zmanjšajo aktivnost ravni in NO-sintaze iz hondrocitov. Tako IL-4 antagonizira IL-1 na tri načine: 1) zmanjšuje nastajanje in preprečuje njegove učinke, 2) povečuje produkcijo osnovne "čistilnega" IL-1pA in 3) zmanjšuje proizvodnjo primarnega sekundarnega "sel» Ni. Poleg tega IL-4 zmanjša razgradnjo encimskih tkiv. Optimalni terapevtski učinek je dosežen s kombinacijo IL-4 in IL-10 v razmerju in vivo. Anabolični dejavniki, kot kakTFR-p in IGF-1, v resnici ne motijo nastajanje ali delovanje IL-1, vendar prikazuje nasprotni aktivnosti, na primer, stimulira sintezo proteoglikan in kolagena, inhibirajo aktivnost za proteazo in TGF (3, prav tako zavira sproščanje encimov in spodbuja njihove zaviralce.

Proinflamatorni citokini so odgovorni za povečano sintezo in izražanje MMP v skupnih tkivih. Sintetizirajo se v sinovialni membrani in se nato razpršijo v sklepni hrustanec skozi sinovialno tekočino. Proinflamatorni citokini aktivirajo hondrocite, ki pa lahko tudi proizvajajo pro-vnetne citokine. V sklepih, ki jih prizadene osteoartroza, vlogo efektorja vnetja igrajo predvsem celice sinovialne membrane. To je sinovitis tipa makrofagov, ki izloča proteaze in vnetne posrednike. Med njimi so v največji meri vključeni v patogenezo osteoartritisa, IL-f, TNF-a, IL-6, levkemičnega inhibitornega faktorja (LIF) in IL-17.

Biološko aktivne snovi, ki spodbujajo poslabšanje hrustanca v osteoartritisu

• Interleukin-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Učinek, ki spodbuja kolonije: makrofag (monocitna) in granulocitna makrofaga
• Snov P
• PGE ₂
• Aktivatorji plazminogena (vrste tkiv in urokinaze) in plazmin
• Metaloproteaze (kolagenaze, elastaze, stromelizini)
• Katepsini A in B
• Triler
• Bakterijski lipopolisaharidi
• Fosfolipaza Ag

Podatki iz literature kažejo, da so IL-ip in, morda TNF-a, glavni posredniki uničenja sklepnih tkiv pri osteoartritisu. Vendar še vedno ni znano, ali delujejo neodvisno drug od drugega ali med njima obstaja funkcionalna hierarhija. Na modelih osteoartritisa pri živalih se je pokazalo, da je IL-1 blokada učinkovito preprečuje uničenje sklepnega hrustanca, ker blokada TNF-alfa vodi v slabitev vnetja v sklepnih tkivih. V sinovialni membrani, sinovialni tekočini in hrustancu bolnikov so bile ugotovljene povečane koncentracije obeh citokinov. Hondrocitov lahko poveča sintezo ne le proteaz (MMP in v glavnem AP), ampak tudi manjše kolagenov kot vrste I in III, kot tudi zmanjša sintezo kolagenske tipe II in IX in proteoglikani. Ti citokini tudi spodbujajo aktivne kisikove vrste in vnetne posrednike, kot je PGE ₂. Rezultat takšnih makromolekularnih sprememb v sklepnem hrustancu z osteoartritisom je neučinkovitost postopkov popravil, kar vodi v nadaljnjo degradacijo hrustanca.

Zgoraj imenovani pro-vnetni citokini modulirajo procese inhibicije / aktivacije MMP pri osteoartritisu. Na primer, lahko neravnovesje med stopnjami TIMP-1 in MMP v hrustanca pri osteoartritisu se posredovano z IL-ip, ker je študija in vitro je pokazala, da poveča koncentracijo IL-1beta zmanjša koncentracijo TIMP-1 in MMP poveča sintezo preko hondrocitov. Sintezo AP je modulirana tudi z IL-1beta. Stimulacija vitro hondrocitov sklepnega hrustanca z IL-1 vyzyvet povečanja odmerka odvisno sintezo in močnem zmanjšanju AP sintezno PAI-1. Sposobnost IL-1, da zmanjša sintezo IAP-1 in spodbudi sintezo AP, je močan mehanizem za nastanek plazmina in aktivacijo MMP. Poleg tega plazmin ni le encim, ki aktivira druge encime, temveč tudi v procesu degradacije hrustanca z direktno proteolizo.

IL-ip sintetiziramo kot neaktivnega prekurzorskega maso 31 kD (pre-IL-ip), Azat, po odcepitvi signalnega peptida, ki se pretvori v aktivno citokina iz teže 17,5 kD. V tkivih sklepov, vključno sinovialne membrane in sinovialne tekočine sklepnega hrustanca, IL-ip odkrita v aktivni obliki, in v raziskavah in vivo so pokazale zmožnost sinovialne membrane pri osteoartritisu izločajo ta citokin. Nekatere serinske proteaze lahko pretvorijo pre-IL-ip v svojo bioaktivno obliko. Pri sesalcih, so takšne lastnosti dalo le eno proteazo, ki spada v družino cistein aspartatspetsificheskih encimov je IL-1p-converting enzyme (IKF ali kaspaze-1). Ta encim sposoben specifično pretvori pre-IL-ip biološko aktivne "zrelo" IL-ip z maso 17,5 kD. IKF je proenzim z molekulsko maso 45 kD (p45), ki je lokalizirana v celični membrani. Po proenzima P45 proteolitično cepitev, da tvorita dve podenoti, znan kot P10 in P20, kar je značilno za encimsko aktivnost.

TNF-a je tudi sintetiziran kot predhodno vezan na membrano z maso 26 kD; s proteolitično cepitvijo se sprosti iz celice kot aktivne topne oblike z maso 17 kD. Proteolitično cepitev izvaja TNF-a-konvertirajoči encim (TNF-KF), ki spada v družino adamalizinov. AR Amin in soavtorji (1997) so ugotovili povečano izražanje mRNA TNF-CF v sklepnem hrustancu bolnikov z osteoartritisom.

Biološka aktiviranje hondrocitov in sinovitsitov IL-1 in TNF-a, posredovano z vezavo na specifične receptorje na celični površini - IL-R in TNF-R. Za vsak citokin so bile identificirane dve vrsti receptorjev: IL-IP tipov I in II ter TNF-P I (p55) in II (p75). Za prenos signalov v celicah skupnih tkiv se odzivajo IL-1PI in p55. IL-1P tipa I ima nekoliko višjo afiniteto za IL-1beta kot za IL-1a; IL-1P tipa II - nasprotno, ima večjo afiniteto za IL-1a kot za IL-ip. Ni še jasno, ali lahko IL-IP II tip II posreduje signalom IL-1 ali služi le za konkurenčnost IL-1 vezave na tip IL-1PI. V hondroiitah in sinovijskih fibroblastov bolnikov z osteoartritisom našli velike količine IL-1PI in p55, kar pojasnjuje visoko občutljivost teh celic na stimulacijo s citokini ustrezne. Ta proces vodi do povečanja izločanja proteolitičnih encimov in do uničenja sklepnega hrustanca.

Izključitev IL-6 v patološki proces pri osteoartritisu ni izključena. Ta predpostavka temelji na naslednjih ugotovitvah:

• IL-6 poveča število vnetnih celic v sinovialni membrani,
• IL-6 stimulira proliferacijo hondrocitov,
• IL-6 izboljša učinke IL-1 pri povečanju sinteze MMP in zavira sintezo proteoglikanov.

Vendar, IL-6 lahko inducirajo produkcijo TIMP, vendar ne vpliva proizvodnja MMP Zato se šteje, da je ta citokin, ki sodeluje v procesu zadrževanja proteolitično razgradnjo sklepnega hrustanca, ki poteka skozi povratno zvezo.

Še en predstavnik družine IL-6 je LIF - citokin, ki ga proizvaja hondrocitov dobljenih iz bolnikov z osteoartritisom, kot odziv na stimulacijo z proinflamatornih citokinov IL-ip in TNF-a. LIF stimulira resorpcijo proteoglikanov hrustanca, pa tudi sintezo produkcije MMP in NO. Vloga tega citokina pri osteoartritisu ni v celoti razumljena.

IL-17 je 20-30 kD homodimer z IL-1 podobnim delovanjem, a veliko manj izrazit. IL-17 stimulira sintezo in sproščanje številnih vnetnih citokinov, vključno z IL-ip, TNF-a, IL-6 in MMP v tarčne celice, kot so človekove makrofagi. Poleg tega IL-17 stimulira proizvodnjo NO s hondrociti. Tako kot LIF je bila vloga IL-17 v patogenezi OA malo raziskana.

Anorganski prosti radikal NE ima pomembno vlogo pri degradaciji sklepnega hrustanca z OA. Chondrociti, pridobljeni pri bolnikih z osteoartritisom, proizvedejo več NO kot spontano, kot tudi po stimulaciji s proinflamatornimi citokini v primerjavi z normalnimi celicami. Visoke koncentracije NO odkriti v sinovialni tekočini in serumu bolnikov z osteoartritisom - je posledica povečanja ekspresije in sinteze inducirano NO-sintaze (hNOC) - encim odgovoren za NO proizvodnjo. Nedavno smo klonirali DNA hondrocitne hNOC, določili smo aminokislinsko sekvenco encima. Aminokislinska sekvenca kaže 50-odstotno identiteto in 70-odstotno podobnost hNOC, ki je specifičen za endotel in nevralno tkivo.

NO inhibira sintezo makromolekul ECM za sklepno hrustanco in spodbuja sintezo MMP. Poleg tega povečanje proizvodnje NO spremlja zmanjšanje sinteze antagonista IL-IP (IL-1RA) s hondrociti. Tako povečana raven IL-1 in zmanjšanje - IL-1 RA povzročijo hiperstimulacijo NE hondrocite, kar vodi do povečane degradacije hrustanca matrice. Obstajajo poročila o terapevtskem učinku in vivo selektivnega zaviralca hNOC na napredovanje eksperimentalnega osteoartritisa.

Zaviralci naravnih citokinov lahko neposredno zavirajo vezavo citokinov na receptorje celičnih membran, kar zmanjša njihovo pro-vnetno aktivnost. Naravni zaviralci citokinov lahko razdelimo v tri razrede glede na njihov način delovanja.

Prvi razred inhibitorjev vključujejo receptorske antagoniste, ki preprečujejo vezavo liganda na receptor s konkurenco za vezavno mesto. Do sedaj je bil tak inhibitor ugotovljen samo za IL-1, zgoraj omenjeni konkurenčni inhibitor sistema IL-1 / ILIP IL-1 PA. IL-1 RA blokira veliko učinkov, ki so jih opazili v tkivih sklepov osteoartritisa, vključno sintezo prostaglandinov ga sinovialnih celic, proizvodnja kolagenaze z hondrocitov in razgradnjo sklepnega hrustanca v kabinetu.

IL-1RA je odkrit v različnih oblikah - eno topno (rIL-1PA) in dve medcelični (μIL-lPAI in μIL-1APAP). Afiniteta topne oblike IL-1RA je 5-krat večja od medceličnih oblik. Kljub intenzivnemu znanstvenemu iskanju funkcija slednjega ostaja neznana. Eksperimety vitro so pokazale, da inhibicija IL-1beta aktivnosti zahtevane koncentracije IL-1pA 10-100 krat presegajo mejo v pogojih in vivo zahteva tisočkratno povečanje koncentracije IL-1pA. To dejstvo lahko delno razloži relativno pomanjkanje IL-1 RA in presežek IL-1 pri sinoviji bolnikov z osteoartritisom.

Drugi razred naravnih inhibitorjev citokinov predstavljajo topni receptorji citokinov. Primer takšnih inhibitorjev pri ljudeh, povezanih z patogenezo osteoartroze, je pIL-1P in pp55. Topne citokinov receptorje okrnjena oblike običajnih receptorjev z vezavo na citokin, ki prepreči, da se veže na membrano povezano receptorjev ciljnih celic, ki deluje z mehanizmom konkurenčni antagonizem.

Glavni prekurzor topnih receptorjev je membranski vezan IL-1PP. Affinity rIL-IP glede na IL-1 in IL-1 PA je drugačna. Tako ima pIL-1PH večjo afiniteto za IL-1p kot za IL-1 PA in pIL-1PI kaže večjo afiniteto za IL-1RA kot za IL-ip.

Za TNF obstajajo tudi dve vrsti topnih receptorjev - pp55 in pp75, kot so topni IL-1 receptorji, ki jih tvorijo "odlaganje" (odlaganje). In vivo sta oba receptorja v tkivih prizadetih sklepov. Razpravljamo o vlogi topnih receptorjev TNF v patogenezi osteoartritisa. Menijo, da v nizkih koncentracijah stabilizacijo tridimenzionalno strukturo TNF in poveča razpolovno dobo bioaktivno citokinov, medtem ko so lahko visoke koncentracije PP55 in PP75 zmanjšajo aktivnost TNF s konkurenčno antagonizma. Očitno je, da pp75 lahko deluje kot nosilec TNF in olajša njegovo vezavo na receptor, ki je povezan z membrano.

Tretji razred naravnih inhibitorjev citokinov predstavlja skupina protivnetnih citokinov, ki vključujejo TGF-beta, IL-4, IL-10 in IL-13. Protivnetni citokini zmanjšujejo produkcijo pro-vnetne, kot tudi nekatere proteaze, spodbujajo proizvodnjo IL-1RA in TIMP.