Imunološke študije v urologiji

Predpisovanje imunograma urološkemu pacientu pomeni, da lečeči zdravnik posumi na prisotnost motenj v imunskem sistemu. Ponavljajoče se bakterijske, virusne, glivične okužbe, alergijske manifestacije, sistemske bolezni so lahko znaki teh motenj, za katere je značilno več sindromov (infekcijski, onkološki, alergijski, avtoimunski, limfoproliferativni). En pacient ima lahko več sindromov. Na primer, kronične nalezljive bolezni (infekcijski sindrom) lahko povzročijo imunsko pomanjkljivost, imunska pomanjkljivost pa se lahko kaže kot nagnjenost k infekcijskim in onkološkim boleznim (onkološki sindrom). Nagnjenost k okužbam se lahko pojavi na ozadju sekundarne imunske pomanjkljivosti, ki se je razvila kot posledica limfoproliferativne bolezni, kot je levkemija. Obstajajo tri glavne skupine patoloških sprememb v imunskem sistemu:

• kvantitativna ali funkcionalna pomanjkljivost ene ali druge povezave imunskega sistema, ki vodi v razvoj stanja imunske pomanjkljivosti;
• motnja v prepoznavanju antigenov s strani imunskega sistema, kar vodi v razvoj avtoimunskih procesov;
• hiperreaktivni ali "perverzni" imunski odziv, ki se kaže v razvoju alergijskih bolezni.

Obstajajo presejalne (testi 1. stopnje) in razjasnitvene (testi 2. stopnje) metode imunodiagnostike. Prve obstajajo za beleženje motenj v imunskem sistemu, druge pa za ugotavljanje mehanizmov, ki sodelujejo pri njihovem izvajanju, z namenom nadaljnje imunokorekcije.

B-celična imunost

Metode presejanja

• Določanje relativnega in absolutnega števila B-limfocitov z uporabo imunofluorescence ali pretočne citofluorometrije z monoklonskimi protitelesi proti antigenom B-celic (CD19, CD20, kjer je CD skupek diferenciacije). Normalna vsebnost B-limfocitov pri odraslih je 8–19 % celotnega števila levkocitov oziroma 190–380 celic/μl. Povečanje vsebnosti B-limfocitov se pojavi pri akutnih in kroničnih bakterijskih in glivičnih okužbah, kroničnih boleznih jeter, sistemskih boleznih vezivnega tkiva, kronični limfocitni levkemiji in mielomu.
• Določanje koncentracije nespecifičnih imunoglobulinov (F, M, G, E) z enostavno radialno imunodifuzijo, nefelometrijo ali turbometrijo, radioimunskim testom ali encimskim imunološkim testom (ELISA). Norme za odrasle: imunoglobulin (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Povečanje koncentracije imunoglobulinov se pojavi v istih patoloških stanjih, pri katerih se pojavi povečanje vsebnosti B-limfocitov. Zmanjšanje koncentracije imunoglobulinov se pojavi pri prirojeni hipogamaglobulinemiji, novotvorbah imunskega sistema, odstranitvi vranice, izgubi beljakovin, boleznih ledvic ali črevesja, zdravljenju s citostatiki in imunosupresivi.

Metode razjasnjevanja

• Določanje imunskih kompleksov v krvi s selektivnim obarjanjem v polietilen glikolu, ki mu sledi spektrofotometrično določanje gostote (normalno 80-20 U). Povečanje imunskih kompleksov v krvi je značilno za akutne bakterijske, glivične, virusne okužbe, avtoimunske bolezni imunskih kompleksov, serumsko bolezen, alergijske reakcije tipa 3;
• Določanje specifičnih imunoglobulinov v krvi v povezavi z bakterijskimi in virusnimi antigeni, deoksiribonukleinsko kislino (DNK) pri avtoimunskih boleznih, odkrivanje antispermičnih (avtoimunska neplodnost) in antirenalnih protiteles (pielonefritis in glomerulonefritis) z radialno imunodifuzijo ali metodo ELISA.
• Določanje antispermičnih protiteles v spermi [MAR test (mešana antiglobulinska reakcija)], normalen - negativen rezultat.
• Določanje koncentracije imunoglobulinov v urinu za namene diferencialne diagnoze med pielonefritisom in glomerulonefritisom (selektivnost proteinurije).
• Določanje vsebnosti IgE v prostatnem soku za diagnosticiranje alergijskega prostatitisa z metodo radialne imunodifuzije ali ELISA.
• Študija odziva v reakciji blastne transformacije B-limfocitov na mitogen B-celic (mitogen pokeweed za stimulacijo reakcije blastne transformacije B-limfocitov v prisotnosti limfocitov T), katerega normativna vrednost je 95-100 %.

T-celična povezava imunosti

Metode presejanja

• Določanje relativnega in absolutnega števila zrelih CD3 T-limfocitov z imunofluorescenčno reakcijo ali pretočno citofluorometrijo z uporabo monoklonskih protiteles proti CD3. Norma za odrasle je 58–76 % oziroma 1100–1700 celic/μl. Zmanjšanje števila T-limfocitov je pokazatelj insuficience celične povezave imunosti. To je značilno za nekatere sekundarne in primarne imunske pomanjkljivosti (kronične bakterijske in virusne okužbe: tuberkuloza, sindrom pridobljene imunske pomanjkljivosti, maligni tumorji, kronična ledvična odpoved, poškodbe, stres, staranje, podhranjenost, zdravljenje s citostatiki, izpostavljenost ionizirajočemu sevanju). Povečanje števila T-limfocitov se pojavi na ozadju imunske hiperaktivnosti ali pri limfoproliferativnih boleznih. Pri vnetju se število T-limfocitov najprej poveča, nato pa zmanjša. Odsotnost zmanjšanja števila T-limfocitov kaže na kronični vnetni proces.
• Vrednotenje subpopulacij limfocitov.
  • Določanje števila T-pomožnih celic (protitelesa proti CD4). Normalno 36-55 % oziroma 400-1100 celic/mcl. Povečanje števila teh celic se pojavi pri avtoimunskih boleznih, Waldenstromovi bolezni, aktivaciji protitransplantacijske imunosti; zmanjšanje števila T-pomožnih celic se pojavi pri kroničnih bakterijskih, virusnih, protozojskih okužbah, tuberkulozi, sindromu pridobljene imunske pomanjkljivosti, malignih tumorjih, opeklinah, poškodbah, podhranjenosti, staranju, zdravljenju s citostatiki, izpostavljenosti ionizirajočemu sevanju.
  • Določanje števila T-supresorjev (protitelesa proti CD4). Normalno 17-37 % oziroma 300-700 celic/μl. Povečanje števila T-supresorjev se pojavi v enakih pogojih, v katerih se število T-pomožnih celic zmanjša, njihovo zmanjšanje pa se pojavi v enakih pogojih, v katerih se vsebnost T-pomožnih celic poveča.
  • Imunoregulacijski indeks CD4/CD8, normalno 1,5-2,5. Hiperaktivnost z vrednostmi nad 2,5 (alergijske in avtoimunske bolezni); hipoaktivnost - manj kot 1,0 (nagnjenost k kroničnim okužbam). Na začetku vnetnega procesa se imunoregulacijski indeks poveča, ko pa se umiri, se normalizira.

Metode razjasnjevanja

• Določanje števila naravnih ubijalk (NK celic) - protiteles proti CD16 in CD56. Norma za limfocite CD 16 je 6-26%, CD56 - 9-19%. Povečanje števila NK celic se pojavi med zavrnitvijo presadka, zmanjšanje - pri virusnih okužbah, raku, primarnih in sekundarnih imunskih pomanjkljivostih, opeklinah, poškodbah in stresu, zdravljenju s citostatiki in izpostavljenosti ionizirajočemu sevanju.
• Določanje števila T-limfocitov z receptorjem za interlevkin-2 (aktivacijski marker) - protitelesa proti CD25. Norma je 10-15%. Povečanje njihovega števila opazimo pri alergijskih boleznih, zavrnitvi presadka, odzivu na timus-odvisne antigene v akutnem obdobju primarne okužbe, zmanjšanje - pri istih boleznih, pri katerih pride do zmanjšanja števila NK celic.
• Študija izražanja aktivacijskega markerja - molekule histokompatibilnosti razreda II HLA-DR. Povečano izražanje se pojavi pri vnetnih procesih, pri bolnikih s hepatitisom C, celiakijo, sifilisom, akutnimi boleznimi dihal.
• Vrednotenje apoptoze limfocitov. Približno predstavo o pripravljenosti limfocitov za apoptozo lahko dobimo z izražanjem receptorja Fas (CD95) na njihovi površini in protoonkogena bd-2 v mitohondrijih. Apoptozo limfocitov ocenimo z obdelavo z dvema fluorescentnima barviloma: propidijevim jodidom, ki se veže na fragmente DNK, in aneksinom Y, ki se veže na fosfatidilserin, ki se pojavi na celični membrani ob začetku apoptoze. Rezultate ovrednotimo s pretočnim citofluorometrom. Rezultati se izračunajo na podlagi razmerja celic, obarvanih z različnimi barvili. Neobarvane celice so sposobne preživetja, celice, vezane samo na aneksin Y, so zgodnje manifestacije apoptoze, pri čemer sta propidijev jodid in aneksin Y pozne manifestacije apoptoze, obarvanje samo s propidijevim jodidom pa kaže na nekrozo.
• Vrednotenje proliferacije T-limfocitov in vitro.
  • Spremembe v celični blastogenezi - reakcija blastne transformacije limfocitov. Levkocite inkubiramo s katerim koli mitogenom rastlinskega izvora (lektini). Fitohemaglutinin se najpogosteje uporablja 72 ur, nato se odvzame razmaz, obarva in prešteje število blastov! Stimulacijski indeks je razmerje med odstotkom transformiranih celic v poskusu (kultura s fitohemaglutininom) in odstotkom transformiranih celic v kontroli (kultura brez fitohemaglutinina). Reakcijo blastne transformacije limfocitov lahko ocenimo z vključitvijo radioaktivne oznake (ZN-timndinium) v gojene celice, saj se sinteza DNK med delitvijo celic poveča. Motnje v proliferativnem odzivu se pojavijo tako pri primarnih kot sekundarnih imunskih pomanjkljivostih, povezanih z okužbami, rakom, odpovedjo ledvic in kirurškimi posegi.
  • V teh študijah se ocenjuje izražanje aktivacijskih markerjev (CD25, transferinski receptor - CD71) in molekule glavnega kompleksa histokompatibilnosti razreda II HLA-DR, ki jih na mirujočih T-limfocitih praktično ni. T-limfocite stimuliramo s fitohemaglutininom, po 3 dneh pa analiziramo izražanje aktivacijskih markerjev z metodo direktne ali posredne imunofluorescenčne reakcije, pretočne citofluorometrije, z uporabo monoklonskih protiteles proti izoliranim receptorjem.
  • Merjenje količine mediatorjev, ki jih sintetizirajo aktivirani T-limfociti [interlevkin (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferon itd.] z uporabo radioimunskega testa ali ELISA. Posebej pomembna je ocena koncentracije γ-interferona in IL-4 kot markerjev Th1 in Th2 v supernatantu aktiviranih kultur in znotraj celice. Če je mogoče, je koristno določiti izražanje genov za ustrezni citokin z ravnijo matrične ribonukleinske kisline v celici producentki in intenzivnostjo izražanja receptorjev za ustrezne citokine.
    
• Reakcija inhibicije migracije limfocitov. Senzibilizirani T-limfociti v reakciji z antigenom izločajo limfokine, vključno z dejavniki, ki zavirajo migracijo limfocitov. Pojav inhibicije opazimo, ko v celično kulturo vnesemo mitogene. Ocena stopnje inhibicije nam omogoča, da presodimo sposobnost limfocitov za izločanje citokinov. Običajno je frekvenca migracije, odvisno od specifičnega mitogena, 20–80 %.
• Ocena citotoksičnosti NK celic. Določi se sposobnost naravnih celic ubijalk, da ubijejo ciljne celice eritromieloidne linije K-562. Če se ocenjuje citotoksičnost, odvisna od protiteles, se uporabijo ciljne celice, prevlečene s protitelesi IgG. Ciljne celice so označene s 3H-uridinom in inkubirane z efektorskimi celicami. Smrt ciljnih celic se oceni s sproščanjem radioaktivne oznake v raztopino. Zmanjšanje citotoksičnosti se pojavi pri malignih novotvorbah. V nekaterih primerih, ko je treba napovedati učinkovitost zdravljenja z interlevkini, se citotoksičnost NK celic oceni med inkubacijo z določenimi citokini.

Študija delovanja fagocitov

Metode presejanja

Študija intenzivnosti absorpcije mikrobnih celic s strani fagocitov (fagocitoza lateksnih delcev, testna kultura stafilokoka, E. coli ali mikroorganizmov, izoliranih od pacienta). S centrifugiranjem heparinizirane krvi se izolira suspenzija levkocitov, za opsonizacijo se doda serum IV. krvne skupine (opsonini so beljakovine, ki krepijo fagocitozo). Mikrobna suspenzija se razredči, zmeša z levkociti in inkubira 120 minut, pri čemer se vzorci za analizo odvzamejo 30,90,120 minut po začetku inkubacije. Iz zbrane suspenzije levkocitov se naredijo razmazi. Določijo se naslednji kazalniki fagocitoze:

• fagocitni indeks - odstotek celic, ki so vstopile v fagocitozo v 30 minutah in 120 minutah inkubacije; standardna vrednost fagocitnega indeksa (30) je 94 %, fagocitnega indeksa (120) pa 92 %;
• fagocitno število - povprečno število bakterij, ki se nahajajo znotraj celice; standardna vrednost fagocitnega števila (30) je 11 %, fagocitnega števila (120) pa 9,8 %;
• koeficient fagocitnega števila - razmerje med fagocitnim številom (30) in fagocitnim številom (120); običajno 1,16;
• Baktericidni indeks nevtrofilcev - razmerje med številom mikrobov, ubitih v fagocitih, in skupnim številom absorbiranih mikrobov; običajno 66 %.

Metode razjasnjevanja

• Študija baktericidne sposobnosti fagocitov v testu z nitromodrim tetrazolijem (NBT) - NBT test. Levkocitom se doda rumeno nitromodro tetrazolijevo barvilo. Ko nevtrofilec absorbira barvilo, pod vplivom prostih kisikovih radikalov pride do redukcijskega procesa, ki povzroči modro obarvanost. Reakcija se izvede na plošči z ravnim dnom z 96 vdolbinicami. V prve tri vdolbinice z mešanico NBT in levkocitov se doda Hanksova raztopina (spontani NBT), v drugo pa delci lateksa; mešanica se inkubira pri 37 °C 25 minut. Rezultati se odčitajo pri 540 nm na čitalniku in izrazijo v poljubnih enotah. Izračuna se stimulacijski koeficient (K _st ), ki je enak razmerju med optično gostoto v stimuliranih vdolbinicah in povprečno optično gostoto v vdolbinicah brez stimulacije. Pri zdravih ljudeh je NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78±0,36.
• Študija adhezijske molekule. Pretočna citofluorometrija se uporablja za določanje izražanja površinskih antigenov CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Imunske pomanjkljivosti z oslabljeno adhezijo se kažejo v ponavljajočih se okužbah, počasnem celjenju ran in odsotnosti gnoja v žariščih okužbe.

Študija sistema komplementa

Metode presejanja

Določanje hemolitične aktivnosti komplementa je preučevanje klasične poti aktivacije komplementa. Različne razredčitve seruma bolne in zdrave osebe se dodajo ovčjim eritrocitom, prevlečenim s protitelesi. Enota hemolitične aktivnosti je recipročna vrednost razredčitve seruma, pri kateri se uniči 50 % eritrocitov. Stopnja hemolize se fotometrično oceni s sproščanjem hemoglobina v raztopino. Zmanjšanje hemolitične aktivnosti komplementa opazimo pri sistemskem eritematoznem lupusu z okvaro ledvic, akutnem glomerulonefritisu, kombiniranih imunskih pomanjkljivostih, miasteniji, virusnem hepatitisu, limfomih, povečanje - pri obstruktivni zlatenici, Hashimotovem tiroiditisu, revmatizmu, revmatoidnem artritisu, nodularnem periarteritisu, dermatomiozitisu, miokardnem infarktu, ulceroznem kolitisu, Reiterjevem sindromu in protinu.

Metode razjasnjevanja

• Določanje komponent komplementa. Kvantitativna določitev se izvede z radialno imunodifuzijo in nefelometrijo.
  Študija ni informativna, razen če se spremenijo antigenske lastnosti komponent komplementa.
• Ugotovljeno je bilo, da komponenta komplementa Clq krepi fagocitozo in posreduje pri celični citotoksičnosti. Njeno zmanjšanje se pojavi pri boleznih imunskih kompleksov, sistemskem eritematoznem lupusu, gnojnih okužbah in tumorjih.
• Komponenta C3 sodeluje pri aktivaciji klasičnih in alternativnih poti komplementa. Zmanjšanje njene koncentracije je povezano s kroničnimi bakterijskimi in glivičnimi okužbami ter prisotnostjo imunskih kompleksov v krvnem obtoku ali tkivnih imunskih kompleksov.
• Komponenta C4 sodeluje pri aktivaciji klasične poti. Zmanjšanje njene koncentracije je povezano s podaljšano aktivacijo komplementa z imunskimi kompleksi in zmanjšanjem koncentracije zaviralca C1, ki nadzoruje aktivacijo klasične poti komplementa. Pomanjkanje C4 se pojavi pri sistemskem eritematoznem lupusu, povečanje C4 pa pri boleznih ledvic, zavrnitvi presadka, akutnem vnetju in boleznih prebavil.
• C5a je majhen fragment molekule C5, ki se od nje odcepi zaradi aktivacije sistema komplementa. Njegova koncentracija se poveča med vnetjem, sepso, atopičnimi in alergijskimi boleznimi.
• Zaviralec Cl je večfunkcijski faktor. Nadzira aktivacijo komponente komplementa C1, zavira aktivnost kalikreina, plazmina in aktiviranega Hagemanovega faktorja, Cl5 in Or proteaz. Pomanjkanje zaviralca C1 vodi do angioedema.
• funkcionalne študije komplementa. Testni serum se doda standardnemu serumu, ki ne vsebuje nobene komponente komplementa, in se določi hemolitična aktivnost komplementa. Če se hemolitična aktivnost ne povrne v normalno stanje, se aktivnost te komponente komplementa v testnem serumu šteje za zmanjšano.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]