Mikroskopska analiza sputuma

Mikroskopski pregled nativnih in fiksnih obarvanih pripravkov sputuma omogoča podrobno preučevanje njegove celične sestave in do neke mere odraža naravo patološkega procesa v pljučih in bronhih, njegovo aktivnost, identifikacijo različnih vlaknatih in kristalnih tvorb, ki imajo tudi pomembno diagnostično vrednost, in končno grobo oceno stanja mikrobne flore dihal (bakterioskopija).

Mikroskopija uporablja nativne in obarvane pripravke sputuma. Za preučevanje mikrobne flore (bakterioskopija) se razmazi sputuma običajno obarvajo po Romanovsky-Giemsi, po Gramu, za identifikacijo Mycobacterium tuberculosis pa po Ziehl-Neelsenu.

Celični elementi in elastična vlakna

Od celičnih elementov, ki jih je mogoče odkriti v sputumu bolnikov s pljučnico, imajo diagnostično vrednost epitelijske celice, alveolarni makrofagi, levkociti in eritrociti.

Epitelijske celice. Ploščatocelični epitelij iz ustne votline, nazofarinksa, glasilk in epiglotisa nima diagnostične vrednosti, čeprav odkrivanje velikega števila ploščatoceličnih epitelijskih celic praviloma kaže na nizko kakovost vzorca sputuma, dostavljenega v laboratorij, ki vsebuje znatno primes sline.

Pri bolnikih s pljučnico se sputum šteje za primernega za pregled, če pri mikroskopiji z majhno povečavo število epitelijskih celic v vidnem polju ne presega 10. Večje število epitelijskih celic kaže na nesprejemljivo prevlado orofaringealne vsebine v biološkem vzorcu.

Alveolarni makrofagi, ki jih v majhnih količinah najdemo tudi v katerem koli sputumu, so velike celice retikulohistiocitnega izvora z ekscentrično nameščenim velikim jedrom in obilnimi vključki v citoplazmi. Ti vključki so lahko sestavljeni iz drobnih prašnih delcev (prašnih celic), ki jih absorbirajo makrofagi, levkociti itd. Število alveolarnih makrofagov se poveča med vnetnimi procesi v pljučnem parenhimu in dihalih, vključno s pljučnico.

Celice stebričastega ciliarnega epitelija obdajajo sluznico grla, sapnika in bronhijev. Izgledajo kot podolgovate celice, razširjene na enem koncu, kjer se nahajajo jedro in cilije. Celice stebričastega ciliarnega epitelija najdemo v vsakem sputumu, vendar njihovo povečanje kaže na poškodbo sluznice bronhijev in sapnika (akutni in kronični bronhitis, bronhiektazije, traheitis, laringitis).

Levkociti v majhnih količinah (2-5 v vidnem polju) se nahajajo v vsakem sputumu. V primeru vnetja pljučnega tkiva ali sluznice bronhijev in sapnika, zlasti v primeru gnojnih procesov (gangrena, pljučni absces, bronhiektazija), se njihovo število znatno poveča.

Pri barvanju pripravkov sputuma po Romanovsky-Giemsi je mogoče razlikovati posamezne levkocite, kar ima včasih pomembno diagnostično vrednost. Tako se pri izrazitem vnetju pljučnega tkiva ali bronhialne sluznice poveča tako skupno število nevtrofilnih levkocitov kot tudi število njihovih degenerativnih oblik z fragmentacijo jeder in uničenjem citoplazme.

Povečanje števila degenerativnih oblik levkocitov je najpomembnejši znak aktivnosti vnetnega procesa in hujšega poteka bolezni.

Eritrociti. Posamezne eritrocite lahko najdemo v skoraj vsakem sputumu. Njihovo znatno povečanje opazimo v primerih motene žilne prepustnosti pri bolnikih s pljučnico, v primerih uničenja pljučnega ali bronhialnega tkiva, zastojev v pljučnem krvnem obtoku, pljučnega infarkta itd. Eritrocite v velikih količinah najdemo v sputumu v primerih hemoptize katere koli geneze.

Elastična vlakna. Omeniti velja še en element sputuma - plastična vlakna, ki se pojavijo v sputumu med uničenjem pljučnega tkiva (pljučni absces, tuberkuloza, razpadajoči pljučni rak itd.). Elastična vlakna so v sputumu predstavljena v obliki tankih, dvojno konturnih, zavitih niti z dihotomno delitvijo na koncih. Pojav elastičnih vlaken v sputumu pri bolnikih s hudo pljučnico kaže na pojav enega od zapletov bolezni - nastanek abscesa v pljučnem tkivu. V nekaterih primerih, ko se oblikuje pljučni absces, lahko elastična vlakna v sputumu odkrijemo celo nekoliko prej kot ustrezne radiografske spremembe.

Pogosto lahko v primerih lobarne pljučnice, tuberkuloze, aktinomikoze in fibrinoznega bronhitisa v pripravkih sputuma najdemo tanke fibrinske vlaknine.

Znaki aktivnega vnetnega procesa v pljučih so:

1. narava sputuma (mukopurulentna ali gnojna);
2. povečanje števila nevtrofilcev v sputumu, vključno z njihovimi degenerativnimi oblikami;
3. povečanje števila alveolarnih makrofagov (iz posameznih skupkov več celic v vidnem polju in več);

Pojav elastičnih vlaken v sputumu kaže na uničenje pljučnega tkiva in nastanek pljučnega abscesa.

Končne ugotovitve o prisotnosti in stopnji aktivnosti vnetja in uničenja pljučnega tkiva se oblikujejo le, če jih primerjamo s klinično sliko bolezni in rezultati drugih laboratorijskih in instrumentalnih raziskovalnih metod.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Mikrobna flora

Mikroskopija razmazov sputuma, obarvanih po Gramu, in preučevanje mikrobne flore (bakterioskopija) pri nekaterih bolnikih s pljučnico nam omogočata približno določitev najverjetnejšega povzročitelja pljučne okužbe. Ta preprosta metoda hitre diagnostike povzročitelja ni dovolj natančna in jo je treba uporabljati le v kombinaciji z drugimi (mikrobiološkimi, imunološkimi) metodami pregleda sputuma. Imerzijska mikroskopija obarvanih razmazov sputuma je včasih zelo uporabna za nujno izbiro in predpisovanje ustrezne antibakterijske terapije. Vendar je treba upoštevati možnost zasejanja bronhialne vsebine z mikrofloro zgornjih dihal in ustne votline, zlasti če je sputum odvzet nepravilno.

Zato se sputum šteje za primernega za nadaljnjo preiskavo (bakterioskopijo in mikrobiološko preiskavo) le, če izpolnjuje naslednje pogoje:

• Gramovo barvanje razkrije veliko število nevtrofilcev v sputumu (več kot 25 v vidnem polju pri majhni povečavi mikroskopa);
• število epitelijskih celic, bolj značilnih za vsebino orofarinksa, ne presega 10;
• Pripravek vsebuje prevladujočo skupino mikroorganizmov enega morfološkega tipa.

Pri obarvanju razmaza sputuma po Gramu je včasih mogoče precej dobro prepoznati grampozitivne pnevmokoke, streptokoke, stafilokoke in skupino gramnegativnih bakterij - Klebsiella, Pfeifferjev bacil, Escherichia coli itd. V tem primeru grampozitivne bakterije pridobijo modro barvo, gramnegativne bakterije pa rdečo.

Bakterijski povzročitelji pljučnice

Gram-pozitivni	Gram negativni
Pnevmokoki Streptococcus pneumoniae. Streptokoki Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans. Stafilokoki: Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus.	Klebsiella pneumoniae Haemophilus influenzae (Pfeifferjev bacil) Haemophilius influenzae Pseudomonas aeruginosa Legionelozna pnevmofilija Escherichia coli

Predhodna bakterioskopija sputuma je najpreprostejša metoda za preverjanje povzročitelja pljučnice in je pomembna za izbiro optimalne antibiotične terapije. Na primer, če se v razmazih, obarvanih po Gramu, odkrijejo grampozitivni diplokoki (pnevmokoki) ali stafilokoki, se namesto antibiotikov širokega spektra, ki povečujejo tveganje za selekcijo in širjenje mikroorganizmov, odpornih na antibiotike, lahko predpiše ciljno zdravljenje, ki deluje proti pnevmokokom ali stafilokokom. V drugih primerih lahko odkrivanje gramnegativne flore, ki prevladuje v razmazih, kaže na to, da so povzročitelji pljučnice gramnegativne enterobakterije (Klebsiella, Escherichia coli itd.), kar zahteva imenovanje ustreznega ciljno usmerjenega zdravljenja.

Res je, da je mogoče grobo sklepati o verjetnem povzročitelju pljučne okužbe z mikroskopijo le na podlagi znatnega povečanja bakterij v sputumu, pri koncentraciji 10 ⁶ - 10 ⁷ mc/ml in več (LL Vishnyakova). Nizke koncentracije mikroorganizmov (< 10 ³ mc/ml) so značilne za spremljajočo mikrofloro. Če koncentracija mikrobnih teles niha od 10 ⁴ do 10 ⁶ mc/ml, to ne izključuje etiološke vloge tega mikroorganizma pri nastanku pljučne okužbe, vendar je tudi ne dokazuje.

Prav tako je treba vedeti, da se "atipični" znotrajcelični patogeni (mikoplazma, legionela, klamidija, rikecije) ne obarvajo po Gramu. V teh primerih se lahko pojavi sum na prisotnost "atipične" okužbe, če se v razmazih sputuma odkrije disociacija med velikim številom nevtrofilcev in izjemno majhnim številom mikrobnih celic.

Žal ima bakterioskopska metoda na splošno precej nizko občutljivost in specifičnost. Nenapovedna vrednost tudi pri dobro vizualiziranih pnevmokokih komaj doseže 50 %. To pomeni, da metoda v polovici primerov daje lažno pozitivne rezultate. To je posledica več razlogov, eden od njih je, da je približno 1/3 bolnikov pred hospitalizacijo že prejelo antibiotike, kar znatno zmanjša učinkovitost bakterioskopije sputuma. Poleg tega tudi v primeru pozitivnih rezultatov testov, ki kažejo na dokaj visoko koncentracijo "tipičnih" bakterijskih patogenov v razmazu (npr. pnevmokoki), ni mogoče popolnoma izključiti prisotnosti sočasne okužbe z "atipičnimi" znotrajceličnimi patogeni (mikoplazma, klamidija, legionela).

Metoda bakterioskopije razmazov sputuma, obarvanih po Gramu, v nekaterih primerih pomaga potrditi povzročitelja pljučnice, čeprav ima na splošno zelo nizko napovedno vrednost. "Atipičnih" znotrajceličnih patogenov (mikoplazme, legionele, klamidije, rikecije) bakterioskopija sploh ne potrdi, saj jih ne obarvamo po Gramu.

Omeniti velja možnost mikroskopske diagnostike pri bolnikih s pljučnico zaradi glivične okužbe pljuč. Za bolnike, ki se dolgotrajno zdravijo s širokospektralnimi antibiotiki, je najpomembnejše odkrivanje Candide albicans v obliki kvasovkam podobnih celic in razvejanega micelija med mikroskopijo nativnih ali obarvanih pripravkov sputuma. To kaže na spremembo mikroflore traheobronhialne vsebine, ki se pojavi pod vplivom antibiotičnega zdravljenja, kar zahteva znatno korekcijo terapije.

V nekaterih primerih morajo bolniki s pljučnico razlikovati obstoječo pljučno poškodbo od tuberkuloze. V ta namen se uporablja barvanje razmaza izpljunka po Ziehl-Neelsenu, ki v nekaterih primerih omogoča identifikacijo tuberkuloznih mikobakterij, čeprav negativen rezultat takšne študije ne pomeni, da bolnik nima tuberkuloze. Pri barvanju izpljunka po Ziehl-Neelsenu se tuberkulozne mikobakterije obarvajo rdeče, vsi drugi elementi izpljunka pa modro. Tuberkulozne mikobakterije imajo videz tankih, ravnih ali rahlo ukrivljenih palic različnih dolžin s posameznimi odebelitvami. V pripravku se nahajajo v skupinah ali posamično. Odkrivanje celo posameznih tuberkuloznih mikobakterij v pripravku ima diagnostično vrednost.

Za povečanje učinkovitosti mikroskopskega odkrivanja tuberkuloznih mikobakterij se uporablja več dodatnih metod. Najpogostejša med njimi je tako imenovana flotacijska metoda, pri kateri homogeniziran sputum stresamo s toluenom, ksilenom ali bencinom, katerega kapljice, ki plavajo navzgor, zajamejo mikobakterije. Ko se sputum usede, zgornjo plast s pipeto nanesemo na stekleno ploščico. Preparat nato fiksiramo in obarvamo po Ziehl-Neelsenu. Obstajajo tudi druge metode akumulacije (elektroforeza) in mikroskopije tuberkuloznih bakterij (luminiscenčna mikroskopija).

Mikroskopski pregled (analiza) sputuma omogoča odkrivanje sluzi, celičnih elementov, vlaknatih in kristalnih tvorb, gliv, bakterij in parazitov.

Celice

• Alveolarni makrofagi so celice retikulohistiocitnega izvora. Veliko število makrofagov v sputumu se odkrije pri kroničnih procesih in v fazi reševanja akutnih procesov v bronhopulmonalnem sistemu. Alveolarni makrofagi, ki vsebujejo hemosiderin ("celice s srčno napako"), se odkrijejo pri pljučnem infarktu, krvavitvi in zastoju v pljučnem krvnem obtoku. Makrofagi z lipidnimi kapljicami so znak obstruktivnega procesa v bronhih in bronhiolih.
• Ksantomatozne celice (maščobni makrofagi) se nahajajo v abscesih, aktinomikozi in ehinokokozi pljuč.
• Stebričaste ciliarne epitelijske celice so celice sluznice grla, sapnika in bronhijev; najdemo jih pri bronhitisu, traheitisu, bronhialni astmi in malignih novotvorbah pljuč.
• Ploski epitelij se odkrije, ko slina vstopi v sputum in nima diagnostične vrednosti.
• Levkociti so prisotni v različnih količinah v vsakem sputumu. Veliko število nevtrofilcev najdemo v mukopurulentnem in gnojnem sputumu. Sputum je bogat z eozinofili v primerih bronhialne astme, eozinofilne pljučnice, helmintskih pljučnih lezij in pljučnega infarkta. Eozinofili se lahko pojavijo v sputumu v primerih tuberkuloze in pljučnega raka. Limfocite najdemo v velikih količinah v primerih oslovskega kašlja in redkeje tuberkuloze.
• Rdeče krvničke. Odkrivanje posameznih rdečih krvničk v sputumu nima diagnostične vrednosti. Če je v sputumu prisotna sveža kri, se odkrijejo nespremenjene rdeče krvničke, če pa se s sputumom izloči kri, ki je bila dlje časa v dihalih, se odkrijejo izlužene rdeče krvničke.
• Maligne tumorske celice najdemo v malignih neoplazmah.

Vlakna

• Elastična vlakna se pojavijo med razpadom pljučnega tkiva, ki ga spremlja uničenje epitelijske plasti in sproščanje elastičnih vlaken; najdemo jih pri tuberkulozi, abscesu, ehinokokozi in novotvorbah v pljučih.
• Vlakna v obliki koral se nahajajo pri kroničnih pljučnih boleznih, kot je kavernozna tuberkuloza.
• Kalcificirana elastična vlakna so elastična vlakna, impregnirana s kalcijevimi solmi. Njihova detekcija v sputumu je značilna za razpad tuberkulozne petrifikacije.

Spirale, kristali

• Kurshmanove spirale nastanejo v primeru spastičnega stanja bronhijev in prisotnosti sluzi v njih. Med kašeljnim sunkom se viskozna sluz vrže v lumen večjega bronhija, ki se zvije v spiralo. Kurshmanove spirale se pojavijo pri bronhialni astmi, bronhitisu, pljučnih tumorjih, ki stiskajo bronhije.
• Charcot-Leydenovi kristali so produkti razgradnje eozinofilcev. Običajno se pojavijo v sputumu, ki vsebuje eozinofile; značilni so za bronhialno astmo, alergijska stanja, eozinofilne infiltrate v pljučih in pljučni metljaj.
• Kristali holesterola se pojavljajo v abscesih, pljučni ehinokokozi in neoplazmah v pljučih.
• Kristali hematoidina so značilni za pljučni absces in gangreno.
• Aktinomicetne druze najdemo pri pljučni aktinomikozi.
• Elementi ehinokoka se pojavijo pri pljučni ehinokokozi.
• Dietrichovi čepi so rumenkasto-sive grudice z neprijetnim vonjem. Sestavljene so iz detritusa, bakterij, maščobnih kislin in maščobnih kapljic. Značilne so za pljučni absces in bronhiektazije.
• Ehrlichova tetrada je sestavljena iz štirih elementov: kalcificiranega detritusa, kalcificiranih elastičnih vlaken, kristalov holesterola in tuberkuloznih mikobakterij. Pojavi se med razpadanjem kalcificirane primarne tuberkulozne lezije.

Micelij in brsteče glivične celice se pojavijo med glivičnimi okužbami bronhopulmonalnega sistema.

Bakterije pnevmocistisa se pojavijo pri pljučnici, ki jo povzroča pnevmocistis.

Glivične kroglice so odkrite pri kokcidioidomikozi pljuč.

Ličinke askarisa so odkrite pri askariazi.

Ličinke jegulj se nahajajo pri strongiloidozi.

Jajčeca pljučnega metljaja se odkrijejo med paragonimiazo.

Elementi, ki jih najdemo v sputumu pri bronhialni astmi. Pri bronhialni astmi se običajno izloča majhna količina sluzastega, viskoznega sputuma. Makroskopsko so vidne Curschmannove spirale. Mikroskopski pregled običajno razkrije eozinofile, valjasti epitelij in Charcot-Leydenove kristale.