Laboratorijska diagnoza osteoartritisa

V večini primerov bolniki z osteoartritisom nimajo sprememb v krvnih in urinskih preiskavah, razen v primerih sinovitisa s pomembnim izlivom, ko se lahko pojavi povečanje ESR, hipergamaglobulinemija, povečanje ravni kazalnikov akutne faze - CRP, fibrinogena itd. Pri pregledu sinovialne tekočine ni opaziti pomembnih razlik od normalnih kazalnikov.

V zadnjih letih poteka intenzivno iskanje možnih bioloških označevalcev (BM) razgradnje in reparacije sklepnih tkiv (predvsem hrustanca in kosti). BM naj bi odražal te dinamične spremembe, služil kot napovedovalec prognoze osteoartroze in označevalec učinkovitosti patogenetskega zdravljenja. Odkritje novih in poglobljenejših študij znanih bioloških označevalcev bo omogočilo boljše razumevanje mehanizmov patogeneze osteoartroze. Vendar pa je glavna naloga uporabe bioloških označevalcev presnove hrustanca ocena hondroprotektivnih lastnosti zdravil in spremljanje zdravljenja z zdravili, ki spadajo v skupino DMO AD - "modifikatorji bolezni".

Pri osteoartritisu se patološke spremembe pojavljajo predvsem v sklepnem hrustancu, pa tudi v subhondralni kosti, sinovialni membrani in drugih mehkih tkivih sklepa. Ker je naša sposobnost neposrednega pregleda teh struktur omejena, so najpomembnejši viri za zbiranje bioloških markerjev kri, urin in sinovialna tekočina.

Testiranje urina je najbolj zaželeno, saj ne vključuje nobenih invazivnih posegov. Po našem mnenju je idealen material za testiranje dnevni urin. Analiza jutranjega urina bi bila primernejša, vendar možnost njegove uporabe temelji le na dejstvu, da se ta vrsta analize uporablja za določanje bioloških označevalcev kostnega metabolizma pri osteoporozi: znano je, da so biološki označevalci podvrženi cirkadianim ritmom, najvišja koncentracija bioloških označevalcev kostnega metabolizma pa se pojavi ponoči. Trenutno v literaturi ni podatkov o cirkadianih ritmih bioloških označevalcev mehkih tkiv in hrustanca, zato bo končna odločitev o izbiri ustreznega testa urina sprejeta po izvedbi ustreznih študij.

Krvne preiskave so rutinski klinični testi. Nekateri biološki označevalci se v krvi že določajo, kot so indeksi akutne faze, drugi pa bodo morda v bližnji prihodnosti vključeni v standardni seznam biokemijskih testov. Za vsak biološki označevalec je treba določiti, v kateri komponenti krvi ga je treba določiti - v plazmi ali serumu. Rezultati raziskav kažejo, da se koncentracija bioloških označevalcev v krvni plazmi bistveno razlikuje od koncentracije v serumu. Biološki označevalci se običajno določajo v krvnem serumu. Po V. Rayanu in sodelavcih (1998) se koncentracije bioloških označevalcev v krvi, odvzeti iz vene blizu prizadetega sklepa, in iz bolj oddaljene vene razlikujejo. Ti podatki kažejo na potrebo po standardizaciji odvzema krvi za preučevanje bioloških označevalcev.

Po LJ Attencia et al. (1989) hrustanec sinovialnih sklepov odrasle osebe predstavlja le 10 % celotne mase hialinskega hrustanca v telesu, vključno z medvretenčnimi ploščicami. Tako določanje bioloških markerjev v krvi in urinu odraža sistemski metabolizem in ne lokalnih sprememb v sklepu, ki ga prizadene osteoartroza. Sinovialna tekočina je pri osteoartrozi najbližje patološkemu žarišču in verjetno najnatančneje odraža procese, ki se dogajajo v prizadetem sklepu. Koncentracija bioloških markerjev v sinovialni tekočini je lahko bistveno višja kot v krvi, kar pomeni, da jo je lažje določiti. Primeri vključujejo epitop 846 agrekana - v sinovialni tekočini ga je 40-krat več kot v krvnem serumu, beljakovine hrustančnega oligomera (COMP) - 10-krat več kot v krvnem serumu. Produkti razgradnje v sinovialni tekočini natančneje odražajo katabolne procese v sklepnem hrustancu. Odvajanje molekul iz sinovialne tekočine skozi lokalni limfni sistem lahko povzroči zmanjšanje njihove velikosti in celo njihovo uničenje.

Kljub invazivnosti tehnike odvzema sinovialne tekočine, ki je povezana s številnimi možnimi zapleti, je vrednost določanja bioloških markerjev pri njej očitna. Da bi se izognili težavam s tako imenovanim suhim sklepom, lahko tik pred odvzemom tekočine v sklep vbrizgamo 20 ml izotonične raztopine NaCl. Takoj po injiciranju izotonične raztopine naj pacient 10-krat upogne in iztegne ud v sklepu, nato pa hitro aspirira razredčeno sinovialno tekočino. Po EM-JA Thonarju (2000) takšno redčenje sinovialne tekočine vpliva na presnovo v sklepnem hrustancu. Vendar pa rezultati študije FC Robiona in sodelavcev (2001) kažejo, da ponavljajoče se izpiranje kolenskih sklepov konj ne povzroča pomembnih sprememb v presnovi hrustanca. Ti podatki zagotovo zahtevajo potrditev. Zato je treba za vsak biološki marker v fazi predkliničnih študij na živalih določiti vpliv izpiranja sklepa na spremembe njegove koncentracije.

Naslednja pomembna točka je določitev razpolovnega časa v sinovialni tekočini in krvi za vsak biološki marker. Brez teh podatkov bo interpretacija rezultatov testov težavna. Običajno je razpolovni čas biološko aktivnih snovi v krvi krajši kot v drugih tekočih medijih zaradi učinkovitega izločanja skozi jetra in ledvice. Zato je za vsak biološki marker treba določiti tudi pot izločanja. Tako se N-propeptid kolagena tipa III izloča iz jeter z endocitozo, ki jo posredujejo receptorji, neglikozilirani fragmenti kolagena pa se izločajo predvsem z urinom, prav tako osteokalcin. Na endotelijskih celicah sinusov jetrnih lobulov so receptorji za glikozaminoglikane, zato se hialuronska kislina in proteoglikani izločajo iz jeter. Razpolovni čas hialuronske kisline v krvi je 2–5 minut. Prisotnost sinovitisa lahko pospeši izločanje bioloških markerjev iz sklepov, čeprav študija na kuncih ni pokazala pomembnih razlik v očistku proteoglikanov s sinovitisom ali brez njega. Zato je treba raziskati vpliv vnetja na spremembe koncentracije bioloških markerjev v telesnih tekočinah.

Ledvice selektivno filtrirajo biološke označevalce. Tako glikozaminoglikani, ki nosijo velik negativni naboj, morda ne prodrejo skozi ledvično bazalno membrano, medtem ko so glikozaminoglikani, kot sta hondroitin-6-sulfat in hondroitin-4-sulfat, zaznani v urinu.

Poleg patologije (zlasti osteoartritisa) lahko na koncentracijo bioloških markerjev v telesnih tekočinah vpliva več dejavnikov:

1. Cirkadijski ritmi so bili preučeni le za majhno število bioloških označevalcev. Preučevali so jih za označevalce kostnega metabolizma. Tako se najvišja koncentracija osteokalcina pojavi ponoči, najvišja koncentracija kolagenskih povezav pa zjutraj - ob 8. uri. Pri revmatoidnem artritisu se najvišja aktivnost IL-6 pojavi tudi ponoči (okoli 14. ure) in prej kot osteokalcin. Ti podatki so nekoliko zanimivi v povezavi z udeležbo IL-6 pri vnetju in fiziologiji kostnega tkiva. TNF-α pa nima cirkadianih ritmov. Vendar pa jih receptorji tega citokina lahko upoštevajo.
2. Peristaltika. Hialuronsko kislino sintetizirajo sinovialne celice (kot tudi številne druge celice) in je potencialni označevalec sinovitisa pri osteoartritisu in revmatoidnem artritisu. Vendar pa je najvišja koncentracija hialuronata v črevesnem limfnem sistemu. Ni presenetljivo, da se lahko koncentracija hialuronske kisline v krvnem obtoku po jedi poveča. Zato je treba odvzem krvi za določanje bioloških označevalcev opraviti na tešče ali 3 ure po jedi. Vpliv peristaltike na raven bioloških označevalcev v krvi pa je treba še preučiti.
3. Telesna aktivnost zjutraj po spanju pri zdravih posameznikih povzroči povečanje koncentracije hialuronske kisline v krvi, MMP-3 in epitopa keratan sulfata. Telesna aktivnost lahko spremeni koncentracijo nekaterih markerjev tako v sinovialni tekočini kot v krvnem serumu. Takšno povečanje je bolj izrazito pri bolnikih z revmatoidnim artritisom, poleg tega pa je koncentracija bioloških markerjev v korelaciji s kliničnim stanjem teh bolnikov.
4. Bolezni jeter in ledvic. Ciroza jeter povzroči znatno povečanje ravni hialuronske kisline v serumu in verjetno vpliva na izločanje proteoglikanov. Znano je, da bolezni ledvic vplivajo na koncentracijo osteokalcina. Tudi to vprašanje zahteva poglobljeno študijo.
5. Starost in spol. Med rastjo se poveča aktivnost celic rastne plošče, kar spremlja povečanje koncentracije skeletnih bioloških označevalcev v krvnem serumu. Primer je povečanje koncentracije fragmentov agrekanov in kolagena tipa II v periferni krvi in urinu rastočih živali. Zato je interpretacija analiz bioloških označevalcev pri otrocih in mladostnikih z mišično-skeletnimi boleznimi težka. Pri mnogih bioloških označevalcih je bilo ugotovljeno povečanje koncentracije s staranjem. Pri moških koncentracija bioloških označevalcev v hrustančnem in kostnem tkivu znatno presega koncentracijo pri ženskah. Poleg tega lahko pri ženskah v menopavzi in po menopavzi pričakujemo spremembe v koncentraciji bioloških označevalcev presnove hrustanca, podobne tistim, ki jih opazimo v kostnem tkivu.
6. Kirurški posegi lahko vplivajo tudi na raven bioloških markerjev, ta učinek pa lahko traja več tednov.

Koncept bioloških markerjev osteoartroze temelji na predpostavki, da odražajo določene vidike presnovnih procesov v sklepnih tkivih. Vendar se je izkazalo, da je razmerje med koncentracijami bioloških markerjev v telesnih tekočinah in presnovo hrustanca, sinovialne ovojnice in drugih tkiv zelo kompleksno.

Na primer, koncentracija markerjev razgradnje ECM sklepnega hrustanca v sinovialni tekočini je lahko odvisna ne le od stopnje razgradnje same matrice, temveč tudi od drugih dejavnikov, kot je stopnja izločanja molekularnih fragmentov iz sinovije, kar je bilo že omenjeno, pa tudi od količine hrustančnega tkiva, ki ostane v sklepu.

Kljub zgoraj navedenim dejstvom je koncentracija bioloških markerjev v sinovialni tekočini na splošno povezana z metabolizmom molekul zunajceličnega matriksa sklepnega hrustanca. Na primer, spremembe v koncentraciji fragmentov agrekana, epitopa 846, COMB in C-propeptida kolagena II v sinovialni tekočini po poškodbi sklepa in med razvojem osteoartroze so skladne s spremembami v intenzivnosti metabolizma agrekana, COMB in kolagena II v eksperimentalnih modelih osteoartroze pri živalih/in in vivo ter v sklepnem hrustancu bolnikov z osteoartrozo/in in vitro.

Identifikacija specifičnih virov molekularnih fragmentov je kompleksen proces. Povečano sproščanje molekularnih fragmentov se lahko pojavi tako zaradi splošnega povečanja procesov razgradnje, ki jih sintetični procesi ne kompenzirajo, kot zaradi povečane razgradnje s hkratnim povečanjem intenzivnosti sinteze istih molekul ECM; v slednjem primeru se koncentracija molekul ECM ne spremeni. Zato je treba iskati markerje, specifične za razgradnjo in sintezo. Primer prvega so fragmenti agrekana, drugega pa C-propeptid kolagena 11.

Tudi če je biološki marker povezan s specifičnim vidikom presnove, je treba upoštevati posebnosti tega procesa. Na primer, identificirani fragmenti lahko nastanejo kot posledica razgradnje de novo sintetizirane molekule, ki se še ni integrirala v funkcionalni zunajcelični matriks (ECM), molekule, ki je bila pravkar integrirana v ECM, in končno trajne molekule ECM, ki je pomemben funkcionalni del zrelega matriksa. Drug problem je opredelitev specifične cone matriksa (pericelularna, teritorialna in interteritorialna matrika), ki je služila kot vir bioloških markerjev, zaznanih v sinovialni tekočini, krvi ali urinu. Študije in vitro kažejo, da je lahko intenzivnost presnove v posameznih conah zunajcelične matrike sklepnega hrustanca različna. Študija določenih epitopov, povezanih s sulfacijo hondroitin sulfata, lahko pomaga pri identifikaciji populacije de novo sintetiziranih molekul agrekanov.

Lahko se domneva, da je pojav fragmentov molekul, ki so normalno prisotne v hrustančnem zunajceličnem materialu (ECM), v sinovialni tekočini povezan s presnovo hrustančnega matriksa. Vendar to ni vedno tako, saj je odvisno od številnih dejavnikov, zlasti od tega, kolikor koncentracija dane molekule v sklepnem hrustancu presega koncentracijo v drugih sklepnih tkivih in kolikor intenzivnost njene presnove v hrustancu presega intenzivnost njene presnove v drugih sklepnih tkivih. Tako skupna masa agrekana v sklepnem hrustancu znatno presega maso na primer v meniskusu kolenskega sklepa, medtem ko se skupna masa COMB v meniskusu praktično ne razlikuje od mase v sklepnem hrustancu. Stromelizin-1 proizvajajo tako hondrociti kot sinovociti, vendar skupno število celic v sinovialni membrani presega število celic v hrustancu, zato je pomemben del stromelizina-1, ki ga najdemo v sinovialni tekočini, najverjetneje sinovialnega izvora. Zato je identifikacija specifičnega vira bioloških markerjev izjemno težka in pogosto nemogoča.

Pri preučevanju bioloških označevalcev v krvnem serumu in urinu se pojavi problem določanja njihovega morebitnega zunajsklepnega vira. Poleg tega se lahko v primeru monoartikularne poškodbe biološki označevalci, ki jih izloča prizadeti sklep, pomešajo z označevalci, ki jih izločajo nepoškodovani sklepi, vključno s kontralateralnimi. Sklepni hrustanec predstavlja manj kot 10 % celotne mase hialinskega hrustanca v telesu. Zato je določanje bioloških označevalcev v krvi in urinu lahko upravičeno pri poliartikularnih ali sistemskih boleznih (v povezavi z osteoartrozo - pri generalizirani osteoartrozi).

Zahteve za biološke označevalce so odvisne od tega, ali se uporabljajo kot diagnostični, prognostični ali evalvativni test. Diagnostični test na primer določa razlike med zdravimi posamezniki in bolniki z osteoartritisom, kar se izraža v občutljivosti in specifičnosti testa. Prognostični test identificira posameznike v kohorti, pri katerih je najverjetneje, da bo bolezen hitro napredovala. Nazadnje, evalvativni test temelji na sposobnosti označevalca, da spremlja spremembe skozi čas pri posameznem bolniku. Poleg tega se lahko biološki označevalci uporabijo za določanje občutljivosti bolnikov na določeno zdravilo.

Sprva so domnevali, da bi biološki označevalci lahko služili kot diagnostični testi, ki bi pomagali razlikovati sklep, prizadet zaradi osteoartroze, od intaktnega, ter izvajati diferencialno diagnostiko z drugimi boleznimi sklepov. Zato je bilo določanje koncentracije keratan sulfata v krvnem serumu obravnavano kot diagnostični test za generalizirano osteoartrozo. Vendar pa so nadaljnje študije pokazale, da lahko ta biološki označevalec le v nekaterih primerih odraža razgradnjo hrustančnih proteoglikanov. Izkazalo se je, da so koncentracije bioloških označevalcev v krvnem serumu odvisne od starosti in spola pregledane osebe.

Domnevni biološki označevalci presnove sklepnega tkiva v sinovialni tekočini in krvnem serumu bolnikov z osteoartritisom

Biološki označevalec	Postopek	V sinovialni tekočini (povezave)	V krvnem serumu (povezave)
1. Hrustanec
Agrekan
Fragmenti osrednjih beljakovin	Razgradnja agrekanov	Lohmander LS. et al., 1989; 1993	Thonar EJMA et al., 1985; Campion GV et al., 1989; MehrabanF. et al., 1991; Spector TD et al., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994; Poole AR et al., 1994) t (Poole AR et al., 1994)
Epitopi osrednjih beljakovin (neoepitopi, specifični za območje cepitve)	Razgradnja agrekanov	Sandy JD et al., 1992; LohmanderLS. et al., 1993; LarkM.W. et al., 1997
Epitopi keratoničnih sulfatov	Razgradnja agrekanov	Campion GV et al., 1989; Belcher C et al., 1997
Epitopi hondroitin sulfatov (846, ЗВЗ, 7D4 in DR.)	Sinteza/razgradnja agrekanov	Poole AR et al., 1994; HazellP.K. et al., 1995; Slater RR Jr. et al., 1995; Plaas AHK et al., 1997; 1998; Lohmander LS. et al., 1998
Razmerje med hondroitin-6 in hondroitin-4 sulfati	Sinteza/razgradnja agrekanov	Shinme iM. et al. 1993
Majhni proteoglikani	Razgradnja majhnih proteoglikanov	Witsch-PrehmP. et al., 1992
Matrični proteini hrustanca
HOMP	Razgradnja HOMP	Saxne T., Heinegerd D., 1992"; LohmanderLS. et al., 1994; Petersson IF et al., 1997	Šarif M. in drugi, 1995
Hrustančni kolageni
C-propeptid kolagena tipa II	Sinteza kolagena II	ShinmeiM. et al., 1993; YoshiharaY. et al., 1995; LohmanderLS. et al., 1996
Fragmenti alfa verige kolagena tipa II	Razgradnja kolagena II	Hollander AP et al., 1994; Billinghurst RC et al., 1997; AtleyLM. et al., 1998
MMP in njihovi inhibitorji	Sinteza in izločanje	Iz sinovije ali sklepnega hrustanca?
II. Meniskusi
HOMP	Razgradnja HOMP	Iz sklepnega hrustanca, meniskusa ali sinovije?
Majhni proteoglikani	Razgradnja majhnih proteoglikanov
III. Sinovialna membrana
Hialuronska kislina	Sinteza hialuronske kisline		Goldberg RL et al., 1991; Hedin P.-J. et al., 1991; Sharif M. et al., 1995
MMP in njihovi inhibitorji
Stromelizin (MMP-3)	Sinteza in izločanje MMP-3	LohmanerLS et al., 1993	ZuckerS. et al., 1994; YoshiharaY. et al., 1995
Intersticijska kolagenaza (MMP-1)	Sinteza in izločanje MMP-1	Clark IM et al., 1993; LohmanderLS. et al., 1993	Manicourt DH et al., 1994
TIMP	Sinteza in izločanje TIMP	Lohmander LS. et al., 1993; Manicourt DH et al., 1994	Yoshihara Y. et al., 1995
N-propeptid kolagena tipa III	Sinteza/razgradnja kolagena III	Šarif M. in drugi, 1996	Šarif M. in drugi, 1996

Številne študije so pokazale razlike v koncentracijah agrekanskih fragmentov, HOMP in MMP ter njihovih inhibitorjev v sklepni tekočini kolenskih sklepov zdravih prostovoljcev, bolnikov z revmatoidnim artritisom, reaktivnim artritisom ali osteoartrozo. Kljub temu, da avtorji dokazujejo pomembne razlike v povprečnih koncentracijah bioloških markerjev, je interpretacija podatkov težavna, saj je bila primerjalna analiza profilna in retrospektivna. Prognostične lastnosti teh testov je treba potrditi v prospektivnih študijah.

Biološki označevalci se lahko uporabijo za oceno resnosti bolezni ali stadija patološkega procesa. V primeru osteoartroze se resnost bolezni in njene stopnje presojajo na podlagi rezultatov rentgenskih preiskav, artroskopije, pa tudi na podlagi resnosti sindroma bolečine, omejitve delovanja prizadetih sklepov in funkcionalne zmogljivosti bolnika. L. Dahlberg in sod. (1992) ter T. Saxne in D. Heinegard (1992) so predlagali uporabo nekaterih molekularnih označevalcev presnove sklepnega hrustanca za dodatno karakterizacijo stopenj osteoartroze. Vendar pa so za uvedbo takšnih bioloških označevalcev v medicinsko prakso potrebne nadaljnje raziskave v tej smeri.

Obstajajo poročila o možni uporabi bioloških označevalcev kot prognostičnih testov. Na primer, pokazalo se je, da koncentracija hialuronske kisline (vendar ne keratan sulfata) v serumu bolnikov z osteoartritisom kolena na začetku študije kaže na napredovanje gonartroze v 5 letih opazovanja. V isti populaciji bolnikov se je pokazalo, da je bila povečana vsebnost COMB v serumu bolnikov z gonartrozo v prvem letu po začetku študije povezana z radiografskim napredovanjem v 5 letih opazovanja. Študije bioloških označevalcev pri bolnikih z revmatoidnim artritisom so pokazale, da je koncentracija COMB, epitopa 846, hondroitin sulfata v serumu povezana s hitrejšim napredovanjem bolezni. Ti rezultati, pridobljeni pri majhnih skupinah bolnikov, pogosto ne kažejo na moč povezave med ravnjo bioloških označevalcev in napredovanjem bolezni, kar pomeni, da so potrebne nadaljnje študije, prospektivne in na večjih kohortah bolnikov.

TD Spector in sodelavci (1997) so ugotovili rahlo povišanje serumskega CRP pri bolnikih z zgodnjim osteoartritisom in poročali, da je CRP lahko napovedovalec napredovanja osteoartritisa. V tem primeru povišanje CRP odraža procese poškodbe sklepnega tkiva in je lahko povezano s povečanjem hialuronske kisline, kar prav tako kaže na napredovanje bolezni. Možno je, da je sinovialna membrana odgovorna za večino hialuronske kisline, določene v serumu, kar kaže na prisotnost blagega sinovitisa. Povečane koncentracije stromelizina MMP v sinovialni tekočini in serumu bolnikov z osteoartritisom in po poškodbi sklepa so lahko povezane tudi z blagim sinovitisom.

Končno se lahko biološki označevalci uporabljajo kot merila učinkovitosti v kliničnih preskušanjih zdravil, pa tudi za spremljanje patogenetskega zdravljenja. Vendar pa obstajata dve medsebojno povezani težavi: pomanjkanje zdravil z dokazanimi lastnostmi, ki "modifikujejo strukturo" ali "modifikujejo bolezen", je v veliki meri posledica pomanjkanja zanesljivih bioloških označevalcev, in obratno, pomanjkanje specifičnih označevalcev presnove sklepnega tkiva je v veliki meri posledica pomanjkanja kontroliranih študij zdravil v teh skupinah.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]